Artículo de método

Una técnica de manguito modificado para el modelo de trasplante cardíaco heterotópico cervical de ratón

DOI:

10.3791/63504

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7 de febrero de 2022

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1Department of Urological Oncology Surgery, Chongqing University Cancer Hospital, 2School of Medicine, Chongqing University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Basic Medical Science, Army Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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En el presente protocolo, se utiliza un modelo de trasplante cardíaco de ratón para investigar el mecanismo del rechazo del aloinjerto cardíaco. En este modelo heterotópico de trasplante cardíaco, se mejora la eficiencia de la operación y la supervivencia de los injertos cardíacos se garantiza mediante una anastomosis cervical de extremo a extremo de la implantación cardíaca utilizando una técnica de manguito modificado.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El rechazo del aloinjerto cardíaco limita la supervivencia a largo plazo de los pacientes después del trasplante de corazón. Un modelo de trasplante de corazón de ratón es ideal para investigar el mecanismo de rechazo del aloinjerto cardíaco en estudios preclínicos debido a su alta homología con genes humanos. Esta comprensión ayudaría a desarrollar enfoques únicos para mejorar la supervivencia a largo plazo de los pacientes tratados con aloinjertos cardíacos. En un modelo de ratón, la implantación cardíaca de un donante abdominal se realiza comúnmente con una anastomosis de extremo a extremo en la aorta del receptor y la vena cava inferior mediante puntos de sutura. En este modelo, el corazón del donante se implanta mediante anastomosis de extremo a extremo en la arteria carótida y la vena yugular del receptor mediante la técnica del manguito modificado. La cirugía de trasplante se realiza sin suturas y, por lo tanto, puede aumentar la supervivencia del receptor, ya que no hay interferencia con el suministro de sangre y el reflujo venoso de la parte inferior del cuerpo. Este modelo de ratón ayudaría a investigar los mecanismos subyacentes al rechazo inmunológico y patológico (agudo/crónico) de los aloinjertos cardíacos.

Introducción

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El trasplante de corazón se ha convertido en el tratamiento estándar para la insuficiencia cardíaca terminal. Más de 5.500 trasplantes de corazón por año se realizan en las organizaciones registradas bajo la Sociedad Internacional de Trasplante de Corazón y Pulmón. Entre los receptores de trasplante alogénico de corazón, la tasa de rechazo a 1 año sigue siendo del >10%, mientras que la tasa de rechazo a 3 años aumentó al 36%1,2. Sin embargo, faltan tratamientos profilácticos efectivos para los pacientes con rechazo del aloinjerto cardíaco. Por lo tanto, se justifican estudios con modelos animales que aclaren los mecanismos fisiológicos subyacentes al rechazo inmunológico y patológico de los aloinjertos cardíacos. Tales estudios contribuirían a la investigación de nuevos objetivos necesarios para desarrollar fármacos eficaces, lo que ayudaría a prevenir el rechazo del aloinjerto cardíaco y mejorar las tasas de supervivencia en esas poblaciones de pacientes.

Algunos posibles mecanismos inmunológicos y fisiopatológicos del rechazo del aloinjerto cardíaco han sido propuestos recientemente en estudios con modelos de ratón de trasplante cardíaco heterotópico 3,4,5. En consecuencia, el trasplante cardíaco heterotópico de ratón se convirtió en un modelo preclínico ideal para investigar los mecanismos de rechazo inmune y lesión patológica que ocurren en los aloinjertos cardíacos después del trasplante cardíaco debido a su alta homología con genes humanos. El concepto predominante es realizar un trasplante heterotópico en un modelo de ratón mediante una anastomosis abdominal de extremo a extremo en la aorta receptora y la vena cava inferior mediante puntos de sutura, similares a la anatomía humana normal. Sin embargo, este procedimiento puede interferir con el riego sanguíneo del receptor y el reflujo venoso de la parte inferior del cuerpo6. Por lo tanto, aquí se propone un procedimiento de trasplante cardíaco heterotópico modificado en un modelo de ratón.

El corazón del donante se implanta con la arteria carótida y la vena yugular del receptor mediante una anastomosis cervical de extremo a extremo utilizando una técnica de manguito modificada. Este procedimiento modificado facilitó la viabilidad operatoria y aseguró la supervivencia del injerto cardíaco sin interferir con el suministro de sangre y el reflujo venoso de la parte inferior del cuerpo.

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Protocolo

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Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, octava edición, Consejo Nacional de Investigación (EE.UU.) 2011. Los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital de Cáncer de la Universidad de Chongqing, Chongqing, China. Para el estudio de trasplante alogénico se utilizaron ratones machos BALB/c y C57BL/6 con un peso de 20-30 g, obtenidos de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales). Los ratones C57BL/6 se utilizaron como donantes y receptores singénicos, mientras que los ratones BALB/c sirvieron como receptores alogénicos. En la figura 1 se muestra un esquema del protocolo.
NOTA: Todos los suministros utilizados durante la cirugía, incluidos los instrumentos y soluciones quirúrgicas, son estériles. El procedimiento quirúrgico se adhiere al principio de la técnica de operación aséptica.

1. Procedimiento del destinatario

  1. Inducir anestesia general por inhalación de isoflurano al 5% a través de una cámara de inducción de 15 x 10 x 10 cm conectada con una campana (ver Tabla de materiales).
  2. Fije el ratón destinatario en la mesa de operaciones con una almohadilla térmica. Mantener la anestesia con inhalación continua de isoflurano al 2% a través de una mascarilla facial sobre la nariz y la boca.
    NOTA: La frecuencia y el ritmo respiratorios lentos, la desaparición del reflejo corneal y la ausencia del reflejo pedal en los dedos de los pies indican la efectividad de la anestesia.
  3. Después de afeitarse el cabello, desinfecte el área quirúrgica con tres rondas alternas de exfoliante de povidona yodada seguido de alcohol. Luego, incide la piel 1.5-2 cm paralela a la línea media cervical desde el ángulo mandibular derecho hasta el extremo de la cola.
  4. Diseccionar ~1 cm de la vena yugular externa derecha usando un electrocoagulador y microfórceps. Recorte la vena en el extremo proximal con una pinza microvascular atraumática y anítela en el extremo distal.
  5. Pase el extremo distal de la vena a través de un manguito de púas de poliuretano de 22 G (consulte la Tabla de materiales) con un extremo cónico y ranuras superficiales. Fije la vena con el mango del manguito con una pinza microvascular.
  6. Eliminar el 8-0 Sutura de ligadura en el extremo distal, gire la luz sobre el manguito enganchado por la púa superficial al revés y fije con una sutura quirúrgica 10-0 en las ranuras de la superficie.
  7. Resecar la glándula sublingual derecha para formar una fosa para implantar el injerto cardíaco, y reservar el lóbulo derecho de la glándula submaxilar y el esternocleidomastoideo derecho.
  8. Diseccionar la arteria carótida común derecha durante ~1 cm usando microfórceps, y cortar la arteria con una pinza microvascular atraumática en el extremo proximal. En el extremo distal, ligar y cortar la arteria.
  9. Pase el extremo distal de la arteria a través de un manguito de púas de poliuretano de 26 G (consulte la Tabla de materiales) con un extremo cónico y ranuras en la superficie. Fije la arteria con el mango del manguito con una pinza microvascular.
  10. Retire la sutura de ligadura en el extremo distal, gire la luz al revés sobre el manguito y fíjela con una púa superficial y surcos con una sutura quirúrgica 10-0.
  11. Después de preparar los vasos del receptor, deje caer 100 UI / ml de solución salina de heparina en los vasos para prevenir la trombosis. Cubra la incisión cervical con una gasa salina húmeda estéril para su posterior implantación.

2. Procedimiento del donante

  1. Emplear el mismo procedimiento anestésico (paso 1.1) para el ratón donante.
  2. Afeite el vello abdominal con una maquinilla de afeitar eléctrica y desinfecte el área quirúrgica con tres rondas alternas de exfoliante de povidona yodada seguido de alcohol.
  3. Incise el abdomen (2-3 cm) con una tijera a lo largo de la línea media desde la sínfisis del pubis hasta la subxifoidea, y expanda el área incisa con un retractor.
  4. Diseccionar 1 cm de la aorta abdominal y la vena cava inferior utilizando un electrocoagulador y un microfórceps, y realizar la heparinización inyectando 1 mL de solución salina fisiológica suplementada con 250 UI/mL de heparina a través de la vena cava inferior. Después de esto, extirpar la aorta abdominal y la vena cava inferior.
  5. Extirpe el tórax a lo largo de la línea axilar anterior en ambos lados usando una tijera quirúrgica para separar la pared torácica. Ligate la vena cava superior con un 8-0 sutura quirúrgica.
  6. Inserte una aguja del cuero cabelludo en la vena cava inferior suprahepática. Luego, inyecte solución salina fisiológica helada suplementada con 100 UI / ml de heparina a través de la aguja del cuero cabelludo de la vena cava inferior suprahepática para perfundir el corazón del donante hasta que el color de la sangre se desvanezca.
  7. Vuelva a perfundir el corazón del donante con 2-3 ml de solución helada de histidina-triptófano-cetoglutarato (HTK) (consulte la Tabla de materiales) utilizando una aguja del cuero cabelludo del arco aórtico para proteger el miocardio del donante. El tiempo medio de isquemia cálida es de 5 min.
  8. Ligate la vena cava superior e inferior y la vena pulmonar con una sutura quirúrgica 5-0. Diseccionar y cortar la aorta y la arteria pulmonar del donante antes de su ramificación. Después de eso, divida la vena cava superior e inferior y la vena pulmonar para extraer el corazón del donante.

3. Implantación

  1. Implante el corazón del donante en el bolsillo cervical del ratón receptor en posición invertida.
  2. Tire del manguito con una vena yugular receptora evertida hacia la luz de la arteria pulmonar del donante para realizar la anastomosis de extremo a extremo de la arteria pulmonar del donante a la vena yugular externa receptora. Ligate el manguito usando los surcos en la superficie a través de una sutura quirúrgica 10-0 para corregir la anastomosis.
  3. Emplear un procedimiento similar para la anastomosis de extremo a extremo de la aorta del donante a la arteria carótida receptora.
  4. Libere la pinza microvascular atraumática de la vena yugular seguida de la arteria carótida para volver a perfundir el corazón del donante. El tiempo medio de isquemia fría es de 15 min.
  5. Fije el injerto cardíaco y suture adecuadamente para evitar la torsión del injerto.
  6. Cierre la incisión cervical con suturas continuas usando una sutura de monofilamento de poliamida 5-0 (ver Tabla de materiales).
    NOTA: Retire la sutura después de que la herida esté completamente curada.
  7. Mantenga al ratón receptor dentro de una jaula tibia, seca y limpia hasta que se recupere de la anestesia.
    NOTA: Se tarda 5-10 minutos en recuperarse.
  8. Inyectar buprenorfina (0,05 mg/kg) por vía subcutánea en el ratón receptor cada 6 h durante 48 h para analgesia postoperatoria.
    NOTA: La dosis de analgesia fue optimizada para este estudio. Sin embargo, el régimen de analgesia puede extenderse / modificarse si hay algún signo de dolor de acuerdo con las pautas institucionales de uso de animales.

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Resultados

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En este modelo de trasplante cardíaco heterotópico cervical de ratón, la tasa de supervivencia de los ratones receptores fue de aproximadamente el 95,2% (20 de 21 ratones sobrevivieron). La causa principal de muerte fue el sangrado postoperatorio. El latido cardíaco rápido con un ritmo regular sirve como un indicador de la supervivencia del corazón del donante implantado.

Los ratones C57BL/6 y BALB/c eran tipos MHC (H-2b) y MHC (H-2d) en este modelo, respectivamente

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Discusión

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El modelo de trasplante de corazón de ratón contribuye a la investigación de los mecanismos de rechazo después del trasplante de corazón, contribuyendo al desarrollo de enfoques únicos para mejorar la supervivencia a largo plazo de los receptores de aloinjertos cardíacos. Sin embargo, el trasplante cardíaco en ratones es una tarea compleja y desafiante, que requiere un alto nivel de técnicas de microcirugía, especialmente en anastomosis vascular11,12,13

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81870304) a Jun Li.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
  5-0 Sutura de monofilamento de poliamidaB.Braun Medical Inc.C3090954
  8-0 Sutura de monofilamento de poliamidaB.Braun Medical Inc.
Sutura de monofilamento de poliamida 10-0B.Braun Medical Inc.
Brazalete de poliuretano de 22 GB.Braun Medical Inc.4251628-02
Manguito de poliuretano de 26 GSuzhou Linhua Medical Instrument Co., LTDREF383713
Cámara de inducción de anestesiaRWD Life Science Co., LTDV100
Pinza microvascular atraumáticaBeyotimeFS500
BALB/c y C57BL/6 ratones (20– 30 g)Centro de Animales de Experimentación (Universidad Médica del Ejército, Chongqing, China)
BuprenorfinaEE. UU. Ciencias de la vida biológica352004
ElectrocoaguladorGuangzhou Runman Medical Instrument Co., LTDZJ1099
GasaHenan piaoan group Co., LTD10210402
Almohadilla térmicaGuangzhou Dewei Biological Technology Co., LTDDK0032
HeparinaNorth China Pharmaceutical Co., LTD2101131-2
Solución HTKShenzhen Changyi Pharmaceutical Co., LtdYZB/Min8263-2013
Jeringa de inyección (10 mL)Shandong weigao group medical polymer Co., LTD20211001
IsofluranoRWD Life Science Co., Ltd 21070201
Solución salina fisiológicaSouthwest pharmaceutical Co., LTD H50021610
Aguja para el cuero cabelludo Afeitadora20183150210del Grupo Médico Hongyu
BeyotimeFS600
Máquina de anestesia para animales pequeñosRWD Life Science Co., LTDR500
Microscopio de operación quirúrgicaTiannuoxiang Scientific Instrument Co., Ltd, Pekín, ChinaSZX-6745
HisopoYubei Materiales Médicos Co., LTD21080274
C2090880G0090781

Referencias

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  1. Khush, K. K., et al. The International thoracic organ transplant registry of the international society for heart and lung transplantation: Thirty-sixth adult heart transplantation report - 2019; focus theme: Donor and recipient size match. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 38 (10), 1056-1066 (2019).
  2. Stehlik, J., et al. The registry of the international society for heart and lung transplantation: 29th official adult heart transplant report--2012. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 31 (10), 1052-1064 (2012).
  3. Huang, H., et al. Combined intrathymic and intravenous injection of mesenchymal stem cells can prolong the survival of rat cardiac allograft associated with decrease in miR-155 expression. Journal of Surgical Research. 185 (2), 896-903 (2013).
  4. Eggenhofer, E., et al. Features of synergism between mesenchymal stem cells and immunosuppressive drugs in a murine heart transplantation model. Transplant Immunology. 25 (2-3), 141-147 (2011).
  5. Sula Karreci, E., et al. Brief treatment with a highly selective immunoproteasome inhibitor promotes long-term cardiac allograft acceptance in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (52), 8425-8432 (2016).
  6. Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. 6, 238(2007).
  7. Lin, C. M., Gill, R. G., Mehrad, B. The natural killer cell activating receptor, NKG2D, is critical to antibody-dependent chronic rejection in heart transplantation. American Journal of Transplantation. 21 (11), 3550-3560 (2021).
  8. Ito, H., Hamano, K., Fukumoto, T., Wood, K. J., Esato, K. Bidirectional blockade of CD4 and major histocompatibility complex class II molecules: An effective immunosuppressive treatment in the mouse heart transplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 17 (5), 460-469 (1998).
  9. Zhou, Y. X., et al. Acute rejection correlates with expression of major histocompatibility complex class I antigens on peripheral blood CD3(+)CD8(+) T-lymphocytes following skin transplantation in mice. Journal of International Medical Research. 39 (2), 480-487 (2011).
  10. Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. Journal of Visualized Experiments. (92), e50753(2014).
  11. Cui, D., Tan, C., Liu, Z. An alternative technique of arterial anastomosis in mouse heart transplantation. Clinical Transplantation. 32 (6), 13264(2018).
  12. Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. Journal of Investigative Surgery. 26 (4), 223-228 (2013).
  13. Fang, J., et al. A simplified two-stitch sleeve technique for arterial anastomosis of cervical heterotopic cardiac transplantation in mice. American Journal of Translational Research. 5 (5), 521-529 (2013).
  14. Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51 (4), 896-898 (1991).
  15. Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
  16. Fensterer, T. F., Miller, C. J., Perez-Abadia, G., Maldonado, C. Novel cuff design to facilitate anastomosis of small vessels during cervical heterotopic heart transplantation in rats. Comparative Medicine. 64 (4), 293-299 (2014).

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