Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Métodos electrofisiológicos para medir los niveles de fotopigmento en fotorreceptores de Drosophila

2.2K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/63514

⸱

2 de junio de 2022

 ,  , 
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University

En este artículo

Resumen

Presentamos un protocolo para caracterizar electrofisiológicamente los fotopigmentos biestables: (i) explotar los desplazamientos de carga dentro de las moléculas de fotopigmento después de la absorción de fotones y su enorme cantidad en los fotorreceptores, y (ii) explotar las diferencias de espectros de absorción de los estados de fotopigmento de rodopsina y metarhodopsina. Estos protocolos son útiles para detectar mutaciones que afectan a los sistemas de fotopigmento biestables.

Resumen

El fotopigmento acoplado a la proteína G de Drosophila rodopsina (R) está compuesto por una proteína (opsina) y un cromóforo. El proceso de activación de la rodopsina se inicia mediante la isomerización inductora de absorción de fotones del cromóforo, promoviendo cambios conformacionales de la opsina y dando como resultado un segundo estado de fotopigmento oscuro-estable (metarhodopsina, M). La investigación de este fotopigmento biestable utilizando mutagénesis aleatoria requiere métodos simples y robustos para detectar moscas mutantes. Por lo tanto, se han diseñado varios métodos para medir las reducciones en los niveles de fotopigmento funcional. Uno de estos métodos explota los desplazamientos de carga dentro del fotopigmento después de la absorción de fotones y las enormes cantidades de moléculas de fotopigmento expresadas en los fotorreceptores. Esta señal eléctrica, llamada potencial del receptor temprano (o corriente temprana del receptor), se mide mediante una variedad de métodos electrofisiológicos (por ejemplo, electrorretinograma y registros de células enteras) y es linealmente proporcional a los niveles de fotopigmento funcional. Las ventajas de este método son la alta relación señal-ruido, la medición lineal directa de los niveles de fotopigmento y la independencia de los mecanismos de fototransducción aguas abajo de la activación de rodopsina o metarhodopsina. Un método electrofisiológico adicional llamado postpotencial de despolarización prolongada (PDA) explota la biestabilidad del fotopigmento de Drosophila y las diferencias espectrales de absorción de los estados de pigmento R y M de la mosca. El PDA es inducido por la luz azul intensa, convirtiendo cantidades saturadas de rodopsina en metarhodopsina, lo que resulta en la falla de la terminación de la respuesta a la luz durante un tiempo prolongado en la oscuridad, pero puede ser terminado por la conversión de metarhodopsina a rodopsina utilizando luz naranja intensa. Dado que el PDA es una señal robusta que requiere una conversión masiva de fotopigmentos, incluso pequeños defectos en la biogénesis del fotopigmento conducen a un PDA anormal fácilmente detectado. De hecho, los mutantes PDA defectuosos condujeron a la identificación de nuevas proteínas de señalización importantes para la fototransducción.

Introducción

La rodopsina activada por la luz (R), que es un receptor acoplado a la proteína G (GPCR), está compuesta por una proteína transmembrana 7 (opsina) y un cromóforo. En Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), la absorción de fotones induce la isomerización del cromóforo 11-cis-3-OH-retinal a all-trans-3-OH-retinal1, promoviendo el cambio conformacional de la rodopsina a metarhodopsina (M, Figura 1A). A diferencia de la rodopsina de vertebrados, la fracción predominante del cromóforo de invertebrados no se disocia de la opsina, lo que resulta en el estado de pigmento fisiológicamente activo oscuro-estable M. A su vez, la absorción adicional de fotones por el cromóforo all-trans-3-OH-retinal induce la isomerización del cromóforo 2,3, generando el estado pigmentario R con el cromóforo 11-cis-3-OH-retinal. El estado R es un fotopigmento oscuro, estable y fisiológicamente no activo. Además de la ruta de regeneración de fotones extremadamente rápida del cromóforo4, al igual que los fotopigmentos de vertebrados, existe una ruta lenta enzimática alternativa para la regeneración de cromóforos en los invertebrados, en la que algunas de las etapas se realizan en las células de la retina que rodean las células fotorreceptoras 5,6.

Drosophila conlleva grandes ventajas como organismo modelo para el estudio de fotorreceptores de invertebrados. En particular, la accesibilidad de la preparación y la capacidad de aplicar la genética molecular han hecho de Drosophila un poderoso sistema modelo7. Por lo tanto, se han establecido varios métodos experimentales in vivo y ex vivo para estudiar la fototransducción en general y los niveles de fotopigmento, en particular. El método in vivo más simple explota la respuesta de voltaje extracelularmente registrada relativamente grande a la luz del ojo de Drosophila. En consecuencia, la estimulación de la luz evoca una respuesta de voltaje eléctrico en todo el ojo que se puede medir utilizando el registro de electrorretinograma extracelular (ERG), que es ~ 3 órdenes de magnitud mayor que la respuesta ERG a la luz de los ojos de los vertebrados 8,9. La respuesta ERG de Drosophila es robusta y fácil de obtener, lo que la convierte en un método conveniente para identificar anomalías en la respuesta a la luz debido a mutaciones. La respuesta del ERG a la luz surge principalmente de los fotorreceptores, las células pigmentarias (glía) y las neuronas secundarias de la lámina (ver Figura 1B). Los componentes principales del ERG son (i) la respuesta de voltaje extracelular de los fotorreceptores, (ii) los transitorios "on" y "off" al principio y al final del estímulo de luz que surgen de las neuronas de la lámina (Figura 2A, recuadro, ON, OFF), (iii) la respuesta lenta de las células gliales (Figura 2A, recuadro, flechas), y (iv) la respuesta breve y transitoria, resultante del desplazamiento de la carga durante la activación del fotopigmento que precede al transitorioON 10 (Figura 2C [recuadro], D, E). Esta breve respuesta se compone de dos fases (M1 y M2, Figura 2C [recuadro]) y solo puede ser inducida por una estimulación de luz extremadamente fuerte, que activa simultáneamente millones de moléculas de fotopigmento. No se observa bajo estimulación azul (Figura 2D, traza azul) ni en mutantes con niveles de fotopigmento muy reducidos (Figura 2E, traza roja), pero su amplitud se mejora ligeramente en un mutante que abole la actividad plc (Figura 2E, traza naranja). La fase M1 es un ERP típico de la mosca que surge de la activación de M en los fotorreceptores. La fase M1, que tiene una polaridad positiva (intracelularmente), libera un neurotransmisor de forma normal en una sinapsis inversora de signos y activa las neuronas de la lámina, que responden a la despolarización del fotorreceptor generando la fase M2 amplificada sinápticamente. Así, tanto las fases M1 como M2 reflejan la activación M10,11.

La despolarización del fotorreceptor genera el transitorio "on" corneal-positivo, que surge de la sinapsis inversora de signos entre el axón fotorreceptor y las neuronas monopolares de la lámina10,11 (Figura 1B). El lento ascenso y decaimiento del ERG surgen de la despolarización de las células pigmentarias (Figura 2A, recuadro, flechas) debido principalmente al eflujo K+ de las células fotorreceptoras12 a través de los canales de potencial receptor transitorio (TRP) y TRP-like (TRPL) 13,14,15. Estos componentes cinéticos lentos enmascaran y distorsionan en gran medida la forma de onda de la respuesta del fotorreceptor en comparación con los registros intracelulares o de células enteras de la respuesta del fotorreceptor a la luz 9,10. Además, a iluminaciones muy fuertes, se puede observar una respuesta transitoria adicional, que precede y se fusiona parcialmente con el transitorio "encendido" (Figura 2C [recuadro],D,E). Esta señal se origina directamente a partir de la activación masiva del fotopigmento10.

Se han desarrollado varios protocolos de régimen de luz que utilizan filtros de densidad neutra (ND) y de color, así como fuertes destellos de iluminación, para investigar el ojo en general y la cascada de fototransducción en particular. Estos protocolos también se han utilizado para investigar las propiedades del fotopigmento.

El protocolo de intensidad-respuesta mide la amplitud máxima de la respuesta de voltaje ERG de todo el ojo al aumento de las intensidades de luz (Figura 2A, B). Este protocolo ayuda a detectar cambios en la sensibilidad de las células fotorreceptoras a la luz9.

El protocolo postpotencial de despolarización prolongada (PDA) explota las diferencias en los espectros de absorción de rodopsina y metarhodopsina que permite, en Drosophila, una conversión fotopigmentada masiva de R a su estado intermedio M fisiológicamente activo y oscuro-estable2. En la respuesta de voltaje ERG, se da un pulso relativamente corto de luz saturada, y se registra la respuesta de voltaje resultante. Bajo esta condición, la señal de despolarización alcanza un techo (potencial de inversión) porque la activación de una fracción de un porcentaje de la enorme cantidad de moléculas de rodopsina (~ 1 x 108) es suficiente para alcanzar el techo. La presencia de los componentes de fototransducción en gran abundancia asegura que este techo se alcanzará incluso en mutantes con una reducción significativa en la concentración o un mal funcionamiento sutil de los componentes de fototransducción. Esta situación impide el aislamiento de estos mutantes. Pak et al. introdujeron el PDA screening7 buscando una prueba confiable y reveladora para aislar mutantes visuales. En Drosophila, la respuesta PDA se produce mediante la eliminación genética del pigmento rojo de cribado, que permite la conversión de fotopigmentos, y la aplicación de luz azul, que es absorbida preferentemente por la rodopsina (Figura 3A) y, por lo tanto, da como resultado una gran conversión neta de la R al estado de fotopigmento M. La terminación de la fototransducción se interrumpe a nivel del fotopigmento por una gran conversión neta de R a M, lo que, a su vez, da como resultado una excitación sostenida mucho después de que se apaga la luz (Figura 2C, Figura 4A [arriba]). Durante el período de PDA, los fotorreceptores son menos sensibles a las luces de prueba posteriores y están parcialmente insensibilizados (inactivados). El PDA detecta incluso defectos menores en la biogénesis de rodopsina y prueba la capacidad máxima de la célula fotorreceptora para mantener la excitación durante un período prolongado. Dado que depende estrictamente de la presencia de altas concentraciones de rodopsina, califica fácilmente para la reposición deficiente de los componentes de fototransducción. Sorprendentemente, la pantalla PDA ha producido muchos mutantes visuales nuevos y muy importantes (revisados en Pak et al.7). Por lo tanto, los mutantes PDA aislados por Pak et al.7 siguen siendo extremadamente útiles para analizar el sistema visual de Drosophila .

El PDA es inducido en Drosophila por la saturación de luz azul, lo que resulta en una despolarización continua mucho después del desplazamiento de la luz (Figura 4A [arriba]). Después de saturar la luz azul inductora de PDA, los fotorreceptores periféricos (R1-6) permanecen continuamente activos en la oscuridad a su capacidad máxima, alcanzando la saturación. Las luces azules saturadas adicionales durante el PDA no producen ninguna respuesta adicional en las células R1-6 durante muchos segundos, sino que inducen una respuesta en las células R7-8 que se superpone a la PDA. Las respuestas superpuestas se explican por los diferentes espectros de absorción de los fotopigmentos expresados en estas células (R7-8)16. El PDA puede ser suprimido por la fotoconversión de M de vuelta a R con luz naranja saturada (Figura 4A [arriba]). La capacidad del PDA para llevar a las células fotorreceptoras a su capacidad activa máxima, una situación que no se puede lograr con luz blanca intensa, explica por qué ha sido una herramienta importante para detectar mutantes visuales de Drosophila. Esto se debe a que permite la detección de incluso defectos menores en proteínas implicadas en la biogénesis de niveles normales de fotopigmento17,18. Se han aislado dos grupos de mutantes defectuosos de PDA: ni mutantes de inactivación ni después de potenciales (nina) e inactivación, pero no mutantes postpotenciales (ina). El fenotipo del primero es la falta de un CAP y la inactivación asociada que surge de una gran reducción en los niveles de fotopigmento (Figura 4A [medio]). El fenotipo de este último muestra inactivación pero no despolarización oscura después de la luz azul debido a un mecanismo aún desconocido en el mutante con niveles normales de rodopsina pero carente de proteínas que interactúan con los canales TRP (Figura 4A [abajo]).

El PDA surge de la diferencia en la cantidad de fotopigmento en relación con la arrestina (ARR2), que une y termina la actividad M 19,20,21 (Figura 1A). En los fotorreceptores de Drosophila, la cantidad del fotopigmento es aproximadamente cinco veces mayor que la cantidad de ARR219. Así, los niveles de ARR2 son insuficientes para inactivar todas las moléculas M generadas por una gran fotoconversión neta de R a M, dejando un exceso de M constantemente activo en la oscuridad 17,19,20,22,23. Este mecanismo explica la eliminación de la respuesta del CAP por mutaciones o por privación de carotenoides24,25, provocando una reducción del nivel de fotopigmento, pero no afecta a los niveles de arrestina. Además, esta explicación también explica los fenotipos del alelo21 mutante nulo ARR2 (arr2 3), en el que se podría lograr PDA a intensidades de luz azul más tenues ~ 10 veces 19,20,21 (Figura 4B, C). El PDA no es una característica única de los fotorreceptores de mosca, y aparece en todas las especies probadas que tiene M estable oscuro con un espectro de absorción diferente al del estado R, lo que permite una fotoconversión suficiente del fotopigmento del estado R al estado M. Una especie investigada a fondo en la que se descubrió la fenomenología PDA es el fotorreceptor percebe (Balanus), en el que el espectro de absorción del estado R está en una longitud de onda más larga que el estado M2 (Figura 3B). En consecuencia, a diferencia de la situación en la mosca, en el percebe, la luz naranja-roja induce un PDA, mientras que la luz azul suprime el PDA2.

El protocolo de potencial del receptor temprano (ERP) explota el desplazamiento de carga que ocurre durante la activación de R o M. El pigmento visual es una parte integral de la membrana superficial del compartimento de señalización de las membranas de vertebrados e invertebrados3. En consecuencia, el proceso de activación en el que las moléculas de fotopigmento cambian de un estado intermedio a otro se acompaña de un desplazamiento de carga 4,26. Como las moléculas de fotopigmento se alinean eléctricamente en paralelo con la capacitanciade membrana 4, un cambio conformacional sincronizado rápido genera un cambio de polarización rápido de la membrana superficial, que, en las moscas, ocurre en el compartimiento de señalización compuesto por una pila de ~ 30,000-50,000 microvellosidades llamada rabdomere. Esta polarización luego se descarga pasivamente a través de la capacitancia de membrana del cuerpo celular hasta que la membrana celular está igualmente polarizada. El ERP es el registro extracelular del desplazamiento de carga. El ERP registrado intracelularmente manifiesta el ERP extracelular integrado por la constante de tiempo de la membrana celular 4,27,28. La corriente activada por el desplazamiento de la carga visual del pigmento también podría medirse en registros de pinzas de voltaje de celda entera29,30 (Figura 5A-D), con la gran ventaja (en registros de corriente de receptor temprano (ERC)) de minimizar el efecto de la capacitancia de membrana en la cinética de la señal.

La sección de protocolo describe cómo realizar mediciones de ERG a partir de Drosophila eye9 y mediciones de ERC mediante registros de células enteras de ommatidia aislada de Drosophila 31,32. También describimos protocolos específicos que se utilizan para investigar la fototransducción en general y los fotopigmentos en particular.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Medición de la relación de respuesta de intensidad, postpotencial de despolarización prolongada (PDA) y el potencial receptor temprano (ERP) utilizando el electrorretinograma

  1. Condiciones de cría adecuadas para la preparación de D. melanogaster
    1. Criar moscas D. melanogaster en botellas que contengan alimentos que contengan maíz amarillo estándar en una incubadora mantenida a una temperatura de 24 °C y en un ciclo oscuro/claro de 12 h
    2. Mantenga las botellas de mosca en la oscuridad al menos 24 horas antes del experimento.
  2. Configuración general
    1. Prepare pipetas de grabación tirando de capilares de vidrio llenos de fibra de 1 mm x 0,58 mm (O.D x I.D) llenos de fibra (Figura 6L, O). La resistencia de las pipetas debe ser de 5-10 MΩ; se puede utilizar cualquier tirador adecuado.
    2. Cubra dos cables de plata con AgCl2, insertando alambre de plata de 0,25 mm en una solución KCl de 3 M conectada a una fuente de alimentación de 5 V hecha a medida.
    3. Inserte cada alambre de plata recubierto en los soportes de los electrodos (Figura 6N).
    4. Llene el capilar de vidrio con la solución filtrada de Ringer (ver Tabla 1) usando una jeringa de punta alargada (Figura 6M).
    5. Inserte el electrodo de alambre en el capilar de vidrio. Asegúrese de que la solución dentro del capilar esté en contacto con el alambre de plata.
    6. Inserte los soportes de electrodos (Figura 7P, N) en los dos micromanipuladores de electrodos (Figura 7G).
  3. Procedimiento de preparación de la mosca para grabaciones eléctricas
    NOTA: Para mantener la mosca en condiciones adaptadas a la oscuridad, use solo iluminación de luz roja tenue durante los siguientes pasos.
    1. Anestesiar las moscas en la botella con gas CO2 utilizando el sistema fly sleeper (Figura 6A, B) y verterlas en el recipiente de la traviesa.
    2. Elija una mosca y sosténgala cuidadosamente por su ala con una pinza afilada. Cubre el resto de las moscas con una placa de Petri.
    3. Coloque la mosca en el soporte de la mosca en la orientación adecuada, acostada de lado, con la espalda hacia la mano (Figura 6P).
    4. Encienda la fuente de alimentación del soldador. Establezca la corriente en ~2.25 A. Esta corriente debe calentar el filamento de platino-iridio de 0,25 mm a ~55-56 °C (consulte el archivo complementario).
    5. Coloque una gota de cera con una temperatura de fusión baja (~ 55-56 ° C) en el soldador (Figura 6F).
    6. Usando pinzas, levante la mosca de sus alas y fije sus alas al soporte de la mosca (Figura 6I) usando el soldador.
    7. Usando el soldador, conecte la espalda de la mosca a la superficie del soporte con cera (Figura 6P).
    8. Baje la punta del soldador sobre el punto de unión de las patas y derrita la cera para cubrir todas las patas juntas (Figura 6P).
    9. Coloque una pequeña gota de cera entre la cabeza y la espalda en el área del cuello (Figura 6P).
      NOTA: Tenga especial cuidado para evitar el sobrecalentamiento de la cabeza de la mosca. Asegúrese de que la mosca esté correctamente fijada y no pueda moverse durante el experimento; movimientos menores pueden crear artefactos en las grabaciones. Asegúrese de que las aberturas de la tráquea (entradas de respiración) en el tórax y el abdomen no estén cubiertas con cera.
    10. Coloque el soporte para moscas (Figura 7Q) en una jaula oscura de Faraday en un bloque magnético (Figura 7I) y asegúrese de que la mosca esté a ~ 5 mm del final de la guía de luz (Figura 7L).
    11. Coloque el electrodo de grabación (Figura 7P) sobre el ojo de la mosca y el electrodo de tierra (Figura 7N) sobre la parte superior de la espalda de la mosca utilizando los micromanipuladores.
    12. Inserte el electrodo de tierra en la parte posterior de la mosca utilizando los micromanipuladores.
    13. Inserte el electrodo de grabación en la periferia externa del ojo de la mosca, preferiblemente, utilizando los micromanipuladores.
      NOTA: Después de insertar el electrodo en el ojo, se observará un pequeño hoyuelo; tire del electrodo hacia arriba sin retirarlo del ojo hasta que el hoyuelo desaparezca. Los electrodos también se pueden sumergir en pequeñas gotas de gelatina de electrodo aplicadas en el torso y el ojo.
  4. Protocolo de intensidad-respuesta
    1. Coloque un filtro naranja (filtro de borde 590) delante de la lámpara de xenón de alta presión. Utilice un filtro de densidad neutra atenuante (ND) grande (seis órdenes de magnitud).
    2. Espere 60 s en la oscuridad y dé un pulso de luz de 5 s.
    3. Reemplace el filtro ND por un filtro ND menos atenuante en incrementos de un orden de magnitud.
    4. Espere 60 s en la oscuridad y dé un segundo pulso de luz de 5 s.
    5. Repita los pasos 1.4.1.-1.4.4, aumentando gradualmente la intensidad de la luz utilizando filtros ND menos atenuantes (el último pulso debe generarse sin ningún filtro ND). Asegúrese de utilizar la serie de filtros ND en la dirección adecuada, comenzando por una gran atenuación y alcanzando una atenuación baja.
  5. Protocolo PDA (este protocolo solo se puede realizar en moscas de ojos blancos)
    1. Dar un pulso de luz de 5 s de máxima intensidad usando un filtro naranja (filtro de borde 590, para convertir el fotopigmento máximo al estado R).
    2. Reemplace el filtro naranja por un filtro azul de banda ancha (BP450/40 nm) y dé tres pulsos de luz de 5 s a la máxima intensidad.
      NOTA: También es posible dar un pulso de luz azul de intensidad máxima continua y larga hasta que se alcance una respuesta de voltaje de estado estacionario.
    3. Espere 60 s en la oscuridad, reemplace el filtro azul con el filtro naranja anterior y dé dos pulsos de luz de 5 s con intervalos de 60 s.
  6. Protocolo ERP/M-potential para medir el espectro de fotoequilibrio de M (este protocolo solo se puede realizar en moscas de ojos blancos10,25)
    1. Dé un pulso de luz azul continuo (paso de banda (BP) 450/40 nm) hasta alcanzar una respuesta de voltaje de estado estacionario, que convierte la cantidad máxima de fotopigmento del estado R al estado M de las celdas R1-6.
    2. Dé un breve destello de luz intensa (<3 ms) de una longitud de onda entre 350-700 nm (el espectro de absorción conocido del fotopigmento de las células R1-6) utilizando filtros de paso de banda estrechos (~ 20 nm) y mida la amplitud máxima de la fase M1 de la respuesta potencial M (que refleja la absorción de metarhodopsina en esta longitud de onda específica en el fotoequilibrio10,25).
      NOTA: Para la activación síncrona de un gran grupo de moléculas de fotopigmento, se requiere un breve e intenso destello de luz para que el contenido de fotones se empaquete en una corta duración. El potencial M está compuesto por dos componentes: M1 (fase negativa corneal), que refleja el desplazamiento de carga de la metarhodopsina en el fotorreceptor, y M2 (fase11,33 positiva corneal), que refleja la respuesta M1 amplificada de los fotorreceptores en la lámina 9,10,11 . Cada uno de estos componentes puede ser identificado y medido. Sin embargo, es preferible medir el potencial M1 ya que es una manifestación lineal directa de los niveles M. Si se utiliza M2, asegúrese de que su amplitud esté en el rango lineal mediante el uso de privación leve de carotenoides24,25.
    3. Vuelva a dar un pulso de luz azul continuo (BP450/40 nm), seguido de un breve destello de luz intensa (<1 ms) de una longitud de onda diferente.
    4. Repita este protocolo hasta que se cubra todo el espectro de absorción de M en el equilibrio fotográfico.

2. Protocolo ERC para medir el espectro de acción de los estados R y M de las celdas R1-6 utilizando registros de pinzas de voltaje de celda entera

NOTA: Para obtener un protocolo detallado para el uso de grabaciones de pinzas de voltaje de celda entera, véase Katz et al.34. El potencial M utiliza el ERG para medir la activación del estado M solo porque la contribución del estado R es suprimida por la capacitancia de la membrana. Por el contrario, el ERC mide la activación de los estados R (ERC positivo) y M (ERC negativo) porque los registros de pinza de voltaje eliminan el efecto de la capacitancia de la membrana (ver introducción).

  1. Convierta el fotopigmento al estado deseado (R o M). Para la conversión de R a M, primero, adapte las moscas mediante un breve (<1 ms) flash azul adaptativo (BP450/40 nm). Para la conversión de M a R, proporcione un flash naranja adaptativo corto (filtro de borde OG590).
  2. Dé un breve destello de luz (<1 ms) de una longitud de onda entre 350-700 nm y mida la amplitud máxima negativa o positiva de la respuesta ERC, que refleja la absorción M / R en esta longitud de onda específica.
    NOTA: Para la activación síncrona de un gran grupo de moléculas de fotopigmento, se requiere un breve e intenso destello de luz para empacar el contenido de fotones en una corta duración. La conversión máxima de fotopigmento de R a M por flash azul puede alcanzar ~ 80% del total de moléculas de fotopigmento debido a la superposición en el espectro de absorción de R y M (Figura 3A). Por lo tanto, en longitudes de onda inferiores a ~ 550 nm, el ERC tiene dos componentes: una fase negativa que refleja la respuesta de la metarhodopsina y una fase positiva que refleja la respuesta de la rodopsina restante. El ERC depende linealmente de la intensidad de la luz (Figura 5D). En consecuencia, para derivar la sensibilidad espectral de los estados R y M, cada fase del ERC necesita ser normalizada en las diversas longitudes de onda para una energía igual29.
  3. Repita los pasos 2.1.-2.2. utilizando destellos de diferentes longitudes de onda.
  4. Trazar el ERC positivo y negativo normalizado en función de la longitud de onda.
    NOTA: El fuerte destello de luz induce una corriente masiva a través de los canales sensibles a la luz que conduce a un estrés metabólico en el fotorreceptor, que, a su vez, causa la apertura del canal independiente de la luz. El ERC se superpone a esta corriente constitutiva.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

La Figura 2 ejemplifica la robustez y facilidad de uso de la técnica ERG. Es robusto porque se registra en la mosca prácticamente intacta mediante una técnica simple de registros de voltaje extracelular que requieren una configuración electrofisiológica simple. La robustez se manifiesta mediante la obtención de registros de respuestas de luz con amplitudes relativamente grandes (en el rango de milivoltios) incluso cuando las mutaciones reducen o distorsionan fuertemente la respuesta de la lu...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

La principal ventaja de usar la preparación de fotorreceptores Drosophila es su accesibilidad, la facilidad y precisión de la estimulación de la luz y, lo más importante, la capacidad de aplicar el poder de la genética molecular7. Extensos estudios genéticos han establecido Drosophila como un sistema modelo extremadamente útil para la disección genética de procesos biológicos complejos7. La estructura relativamente simple del genoma de Drosophila ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por subvenciones de la Fundación de Ciencias de Israel (ISF) y la Fundación Binacional de Ciencias de Estados Unidos e Israel (BSF). Agradecemos al Sr. Anatoly Shapochnikov por la construcción del calentador de filamento de cera.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

2
Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jeringa de 1 mL con puntaFigura 6M
1 pinzaDumont #5, estándar0,1 mm x 0,06 mm, longitud 110 mm, acero inoxidable (figura 6H)
2 lentes de condensador convertidor
A/DDispositivo molecularDigidata 1200Posible sustitución: cualquier digidata de dispositivos moleculares (p. ej. 1440A) -Figura 7C
AmplificadorElectrónica casi perfectaPosible reemplazo: Instrumentos Warner- IE251A o IE-210 (viene con cabeza)- Figura 7D
subtanque
Fuente > luz fríaSchottKL1500 LCDFigura 6C
Limpiaparabrisas delicadosKimtechKimwipes (Figura 6K)
PortaelectrodosAdecuado para diámetro exterior capilar de 1 mm (Figura 6N, Figura 7N y Figura 7P)
Jaula de Faradaycaseroy cortina frontal negra (Figura 7K)
Filtro (Color)SchottOG590, Filtro de bordeFigura 7S
Filtro (Color)SchottBP450/40 nmFigura 7S
Filtro (Color)Blazers550 nmFigura 7S
Filtro (Color) para fuente de luz fríaSchottRG630Figura 6C
Filtro (Calor)SchottKG3Figura 7S
Filtros (Neutro filtro de densidad)Chroma6,5,4,3,2,1,0.5,0.3Figura 7S Sistema de
lámpara de flashHoneywellFigura 7U
Sistema de traviesas de mosca con inyectorInyectar + maticFigura 6A-B
Fuente de alimentación de la lámparaPTILPS-220Figura 7W
Detector de luzFototransistor casero
Guía de luz3 mm de diámetro, 1,3 m de largo (Figura 7L,M)Fuente
Lámpara de xenón de 75 W libre de ozono de alta presión (que funciona a 50 W), posible reemplazo: Cairn research- OptoLED (Figura 7R)
Cera de fusión a baja temperaturaHecho enCompuesto de mezcla de cera de abejas (Tm≈ 62 y s° C) y parafina a ~3:1 para alcanzar una temperatura de fusión de ~55– 56 ° C (Figura 6J)
Soporte magnético para moscas HechoenFigura 6I y Figura 7Q
Sistema de preamplificador de microelectrodos con etapa de cabezaElectrónicaProbador de impedancia (Figura 7G)
Micromanipulador (mecánico grueso)Tritech Research, NarishigeM-2
Micromanipulador (mecánico fino)Leitz MicrosystemsLeitz Micromanipulador mecánicoFigura 7F
pCLAMPSoftware de dispositivo
Placa60 mm
Generador de impulsosAMPIMaster 8Figura 7A
Crema Redux para electrocardiografíaParker LaboratoriesRedux Electrolyte Crè me
Controlador de obturadorUniblitz, Vincent AssociatesVCM-D1 Monocanal Uni-estableFigura 7V
Sistema de obturadorUniblitz, Vincent AssociatesLS2 2 mm Uni-estable ObturadoresFigura 7V
Alambre de plataWarner Instruments0.25– 1 mm de diámetro, necesita ser cloruro
Soldador compuesto por un filamento0,25 mm de diámetro (Figura 6F)
Microscopio con zoom estereoscópicoNikonSMZ-2BFigura 6D
Zoom estereoscópico MicroscopioWildWild M5Con ajustes de aumento de 6, 12, 25 y 50 (Figura 7E)
Filtros de jeringaMillex22 y micro; m Filtro de PVDF
Extractor de pipeta verticalSutter/ NarishigeModelo P-97/PP-830Utilice un extractor vertical u horizontal, según prefiera (Figura 6L)
Calentador de filamento de ceraHecho enVer figura S1 (Figura 6E-G)
Sistema de lámpara de destello de xenónDr. Rapp OptoElectronicJML-C2Figura 7X
alargada rugosa Mesa antivibratoria Newport VW-3036-OPT-01 Figura 7H Capilares Aparato Harvard Capilares de vidrio de borosilicato 1 mm x 0,58 mm (Figura 6O)Software de dispositivo molecular Clampex CO Blindaje electromagnético (Figura 7O) de luz casa casa casi perfecta molecular de Petri de platino-iridio de casa

Referencias

  1. Vogt, K., Kirschfeld, K. Chemical identity of the chromophores of fly visual pigment. Naturwissenschaften. 77, 211-213 (1984).
  2. Hillman, P., Hochstein, S., Minke, B. Transduction in invertebrate photoreceptors: role of pigment bistability. Physiological Reviews. 63 (2), 668(1983).
  3. Hamdorf, K. Handbook of Sensory Physiology. Comparative Physiology and Evolution of Vision in Invertebrates. Autrum, H. 7, Springer-Verlag. 145-224 (1979).
  4. Gagné, S., Roebroek, J. G., Stavenga, D. G. Enigma of early receptor potential in fly eyes. Vision Research. 29 (12), 1663-1670 (1989).
  5. Pak, W. L., Shino, S., Leung, H. T. PDA (prolonged depolarizing afterpotential)-defective mutants: the story of nina's and ina's--pinta and santa maria, too. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 216-237 (2012).
  6. Wang, X., Wang, T., Jiao, Y., von, L. J., Montell, C. Requirement for an enzymatic visual cycle in Drosophila. Current Biology. 20 (2), 93-102 (2010).
  7. Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
  8. Pak, W. L. Neurogenetics, Genetic Approaches to the Nervous System. Breakfield, X. , Elsevier, North-Holland. 67-99 (1979).
  9. Minke, B. Light-induced reduction in excitation efficiency in the trp mutant of Drosophila. The Journal of General Physiology. 79, 361-385 (1982).
  10. Minke, B., Kirschfeld, K. Fast electrical potentials arising from activation of metarhodopsin in the fly. The Journal of General Physiology. 75 (4), 381-402 (1980).
  11. Stephenson, R. S., Pak, W. L. Heterogenic components of a fast electrical potential in Drosophila compound eye and their relation to visual pigment photoconversion. The Journal of General Physiology. 75 (4), 353-379 (1980).
  12. Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (15), 5748-5755 (2000).
  13. Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
  14. Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
  15. Phillips, A. M., Bull, A., Kelly, L. E. Identification of a Drosophila gene encoding a calmodulin-binding protein with homology to the trp phototransduction gene. Neuron. 8, 631-642 (1992).
  16. Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induced response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. Journal of Comparative Physiology. 98, 345-355 (1975).
  17. Selinger, Z., Doza, Y. N., Minke, B. Mechanisms and genetics of photoreceptors desensitization in Drosophila flies. Biochimica et Biophysica Acta. 1179, 283-299 (1993).
  18. Minke, B. The history of the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) and its role in genetic dissection of Drosophila phototransduction. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 106-117 (2012).
  19. Satoh, A. K., et al. Arrestin translocation is stoichiometric to rhodopsin isomerization and accelerated by phototransduction in Drosophila photoreceptors. Neuron. 67 (6), 997-1008 (2010).
  20. Byk, T., Bar Yaacov, M., Doza, Y. N., Minke, B., Selinger, Z. Regulatory arrestin cycle secures the fidelity and maintenance of the fly photoreceptor cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1907-1911 (1993).
  21. Dolph, P. J., et al. Arrestin function in inactivation of G protein-coupled receptor rhodopsin in vivo. Science. 260, 1910-1916 (1993).
  22. Belusic, G., Pirih, P., Stavenga, D. G. Photoreceptor responses of fruitflies with normal and reduced arrestin content studied by simultaneous measurements of visual pigment fluorescence and ERG. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 196 (1), 23-35 (2010).
  23. Stavenga, D. G., Hardie, R. C. Metarhodopsin control by arrestin, light-filtering screening pigments, and visual pigment turnover in invertebrate microvillar photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 197 (3), 227-241 (2011).
  24. Stark, W. S., Zitzmann, W. G. Isolation of adaptation mechanisms and photopigment spectra by vitamin A deprivation. Journal of Comparative Physiology. 105, 15-27 (1976).
  25. Minke, B., Kirschfeld, K. The contribution of a sensitizing pigment to the photosensitivity spectra of fly rhodopsin and metarhodopsin. The Journal of General Physiology. 73, 517-540 (1979).
  26. Cone, R. A., Cobbs, W. H. Rhodopsin cycle in the living eye of the rat. Nature. 221 (5183), 820-822 (1969).
  27. Murakami, M., Pak, W. L. Intracellularly recorded early receptor potential of the vertebrate photoreceptors. Vision Research. 10 (10), 965-975 (1970).
  28. Hodgkin, A. L., Obryan, P. M. Internal recording of the early receptor potential in turtle cones. The Journal of Physiology. 267 (3), 737-766 (1977).
  29. Yasin, B., et al. Ectopic expression of mouse melanopsin in Drosophila photoreceptors reveals fast response kinetics and persistent dark excitation. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3624-3636 (2017).
  30. Hardie, R. C. Photolysis of caged Ca 2+ facilitates and inactivates but does not directly excite light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 15, 889-902 (1995).
  31. Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing Papers of a Biological Character. Royal Society (Great Britain). 245, 203-210 (1991).
  32. Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium-dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
  33. Pak, W. L., Lidington, K. J. Fast electrical potential from a long-lived, long-wavelength photoproduct of fly visual pigment. The Journal of General Physiology. 63 (6), 740-756 (1974).
  34. Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. Electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627(2017).
  35. Selinger, Z., Minke, B. Inositol lipid cascade of vision studied in mutant flies. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 53, 333-341 (1988).
  36. Minke, B., Kirschfeld, K. Microspectrophotometric evidence for two photoconvertible states of visual pigments in the barnacle lateral eye. The Journal of General Physiology. 71, 37-45 (1978).
  37. Ranganathan, R., Harris, W. A., Zuker, C. S. The molecular genetics of invertebrate phototransduction. Trends in Neurosciences. 14, 486-493 (1991).
  38. Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. The Journal of Physiology. 524, 179-194 (2000).
  39. Dimitracos, S. A., Tsacopoulos, M. The recovery from a transient inhibition of the oxidative metabolism of the photoreceptors of the drone (Apis mellifera). Journal of Experimental Biology. 119, 165-181 (1985).
  40. Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca 2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Potencial temprano del receptorpospotencial despolarizante prolongadoregistro de electroretinogramaregistro de c lula completamutantes de fototransducci nmetarodopsina de la rodopsinacribado gen tico
Métodos electrofisiológicos para medir los niveles de fotopigmento en fotorreceptores de Drosophila
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.