Este protocolo describe cómo construir un sistema de cadena de polimerasa de flujo continuo basado en un chip microfluídico y cómo construir un sistema de electroforesis capilar en el laboratorio. Presenta un método sencillo para el análisis de ácidos nucleicos en el laboratorio.
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Artículo de método
Amplificación de Escherichia coli en un chip microfluídico de PCR de flujo continuo y su detección con un sistema de electroforesis capilar
En este artículo
Resumen
Resumen
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método tradicional empleado para la amplificación de un gen diana que ha desempeñado un papel importante en el diagnóstico biomolecular. Sin embargo, la PCR tradicional requiere mucho tiempo debido a la eficiencia de la variación de baja temperatura. En este trabajo se propone un sistema de PCR de flujo continuo (CF-PCR) basado en un chip microfluídico. El tiempo de amplificación se puede reducir en gran medida ejecutando la solución de PCR en un microcanal colocado en calentadores configurados a diferentes temperaturas. Además, dado que la electroforesis capilar (CE) es una forma ideal de diferenciar los productos de PCR positivos y falsos positivos, se construyó un sistema de CE para lograr una separación eficiente de los fragmentos de ADN. En este trabajo se describe el proceso de amplificación de Escherichia coli (E. coli) mediante el sistema CF-PCR construido internamente y la detección de los productos de PCR mediante CE. Los resultados demuestran que el gen diana de E. coli se amplificó con éxito en 10 minutos, lo que indica que estos dos sistemas pueden utilizarse para la rápida amplificación y detección de ácidos nucleicos.
Introducción
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular utilizada para amplificar fragmentos específicos de ADN, amplificando así trazas de ADN cientos de millones de veces. Ha sido ampliamente utilizado en el diagnóstico clínico, la investigación médica, la seguridad alimentaria, la identificación forense y otros campos. El proceso de PCR consta principalmente de tres pasos: desnaturalización a 90-95 °C, recocido a 50-60 °C y extensión a 72-77 °C. El ciclo térmico es una parte importante del proceso de PCR; sin embargo, el termociclador de PCR tradicional no solo es voluminoso sino también ineficiente, ya que requiere aproximadamente 40 min....
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Protocolo
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos y equipos utilizados en este protocolo.
1. Fabricación de chip microfluídico CF-PCR
- Calentar la oblea de silicona a 200 °C durante 25 minutos para eliminar la humedad.
- Dispense 1 ml de fotorresistencia SU-8-2075 por pulgada de oblea. Hágalo girar en la oblea de silicio con un recubridor giratorio a 500 rpm durante 5-10 s con una aceleración de 100 rpm/s, y luego a 2.000 rpm durante 30 s con una aceleración de 500 rpm/s.
- Hornee suavemente la oblea de silicona a 65 °C dura....
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Resultados
La figura 5 representa el electroferograma de los productos de PCR y los marcadores de ADN. La traza (Figura 5A) es el resultado de CE del producto amplificado por CF-PCR, la traza (Figura 5B) es el resultado de CE del producto amplificado por ciclos térmicos y la traza (Figura 5C) es el resultado de CE de la escalera de ADN de 100 pb. Primero amplificamos el gen diana de E. coli en el sistema .......
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Discusión
Tanto la PCR como la CE son dos biotecnologías populares en el análisis de ácidos nucleicos. En este trabajo se describe la amplificación de E. coli y la detección de los productos de PCR utilizando los sistemas CF-PCR y CE, ambos de fabricación propia. El gen diana de E. coli se amplificó con éxito en 10 minutos debido a las altas tasas de transferencia de calor. Los fragmentos de ADN menores de 1.500 pb se separaron en 8 minutos (Figura 5). La gran ventaja de estas dos té.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Este trabajo contó con el apoyo de la Comisión de Ciencia y Tecnología de la Municipalidad de Shanghái, China (Nº 19ZR1477500 y Nº 18441900400). Agradecemos el apoyo financiero de la Universidad de Shanghái para la Ciencia y la Tecnología (No.2017KJFZ049).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Escalera de ADN de 100 pb | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Tampón rápido I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Ciencia & Tecnología Co., Ltd. | T1051 | |
| Alfa Aesar, EE. UU. | L15459 | ||
| mezcla dNTP (2.5 μ M) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| , EE. UU | 9004-62-0 | ||
| isopropanol | Aladdin, Shanghái, China | 67-63-0 | |
| microscopio | Olympus, Japón | Fotolitografía BX51 | |
| nbsp; | SUSS MicroTec, Alemania | MJB4 | |
| tubo fotomultiplicador | Hamamatsu Photonics, Japón | R928 | |
| fotorresistente | MicroChem, EE. UU | SU-8 2075 | |
| Controladores de temperatura PID | Shanghái, China | XH-W2023 | |
| limpiador de plasma | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polivinil pirrolidona (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | de P110608 | |
| Harvard Apparatus PHD2000 | |||
| tubos de silicona | BIO-RAD, EE. UU | ||
| relés de estado sólido | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerasa | Takara Bio Inc. | Aguja de acero RR070A | |
| zhongxinqiheng,Suzhou,China | |||
SYBR GREEN  | Solarbio, Pekín, China | SY1020 | |
| Tecnología EasyShining, Chengdu, China | Plantilla TCM-M207 | ||
| (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| fuente de alimentación de voltaje | Medina, NY, EE. UU. | TREK MODELO 610E |
Referencias
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B.
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Reimpresiones y permisos
