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Artículo de método

Inactivación de patógenos mediante fotólisis con luz visible de riboflavina-5′-fosfato

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DOI:

10.3791/63531

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6 de abril de 2022

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1Department of Biotechnology, Ming Chuan University, 2Department of Tourism and Leisure, Hsing Wu University, 3Department of Science Education and Application, National Taichung University of Education, 4Department of Soil and Environmental Sciences, National Chung Hsing University

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para inactivar bacterias patógenas con especies reactivas de oxígeno producidas durante la fotólisis del mononucleótido de flavina (FMN) bajo irradiación de luz azul y violeta de baja intensidad. Se ha demostrado que la fotólisis FMN es un método simple y seguro para procesos sanitarios.

Resumen

Riboflavina-5'-fosfato (o mononucleótido de flavina; FMN) es sensible a la luz visible. Se pueden generar varios compuestos, incluidas las especies reactivas de oxígeno (ROS), a partir de la fotólisis FMN tras la irradiación con luz visible. Las ROS generadas a partir de la fotólisis FMN son perjudiciales para los microorganismos, incluidas las bacterias patógenas como Staphylococcus aureus (S. aureus). Este artículo presenta un protocolo para desactivar S. aureus, como ejemplo, a través de reacciones fotoquímicas que involucran FMN bajo irradiación de luz visible. El anión radical superóxido () generado durante la fotólisis FMN se evalúa mediante la reducción de nitro azul tetrazolio (figure-abstract-1NBT). La viabilidad microbiana de S. aureus que se atribuye a especies reactivas figure-abstract-2 se utilizó para determinar la efectividad del proceso. La tasa de inactivación bacteriana es proporcional a la concentración de FMN. La luz violeta es más eficiente para inactivar S. aureus que la irradiación de luz azul, mientras que la luz roja o verde no impulsa la fotólisis FMN. El presente artículo demuestra la fotólisis FMN como un método simple y seguro para procesos sanitarios.

Introducción

La riboflavina-5′-fosfato (FMN) se forma por fosforilación en la posición de riboflavina 5′ de la cadena lateral ribitil y es requerida por todas las flavoproteínas para numerosos procesos celulares para generar energía. También desempeña el papel de vitamina para algunas funciones en el cuerpo humano1. FMN es aproximadamente 200 veces más soluble en agua que la riboflavina2.

La inactivación fotodinámica antibacteriana (aPDI) de las bacterias es una forma eficiente de controlar la resistencia a las bacterias 3,4 porque no depende del modo de resistencia bacteriana. Clínicamente, aPDI se utiliza para tratar infecciones de tejidos blandos con el fin de disminuir la infección de la piel nosocomial debido a bacterias multirresistentes 5,6,7,8,9. aPDI también produce muerte celular mediante la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Las ROS, como los radicales superóxido (), el oxígeno singlete, los radicales hidroxilo (figure-introduction-1•OH) y los radicales peroxilo, son radicales libres o moléculas que contienen oxígeno reactivo 10,11,12 y normalmente son reactivas 13. Al igual que el daño del ADN causado por ROS, la peroxidación de la membrana y la destrucción de las células endoteliales también son reacciones bioquímicas adversas que se atribuyen a ROS en las células12.

El uso de aPDI para bacterias patógenas implica una fuente de luz visible o UV para inactivar microorganismos en presencia de compuestos químicos, como cloruro de metiltioninio 14, PEI-ce6 conjugado 15, porfirina 16, dióxido de titanio17, azul de toluidina O 18 y nanopartículas de óxido de zinc 19. El azul de toluidina O y el azul de metileno son colorantes de fenotiazinio y el azul de metileno tiene propiedades tóxicas. Las nanopartículas de óxido de zinc y la irradiación UV están relacionadas con efectos adversos para la salud y el medio ambiente. Como tal, la explotación de un fotosensibilizador confiable, seguro y simple a través de fotólisis bajo irradiación visible merece un estudio más profundo.

El micronutriente, riboflavina o FMN, no es tóxico y de hecho se utiliza para la fabricación de alimentos o la alimentación20. Tanto la FMN como la riboflavina son altamente sensibles a la irradiación lumínica2. Bajo UV 1,2,21,22,23 e irradiación de luz azul10,24, estos dos compuestos alcanzan un estado excitado. La riboflavina activada o FMN que se produce por fotólisis es promovida a su estado triplete y se generan ROS simultáneamente 2,25. Kumar et al. informaron que la riboflavina activada por la luz UV selectivamente causa un aumento de la lesión a la fracción guanina del ADN en microorganismos patógenos26. Bajo irradiación por luz UV, se ha demostrado que la riboflavina activada fotodinámicamente promueve la generación de 8-OH-dG, que es un biomarcador para el estrés oxidativo, en el ADN bicatenario27. Se reporta que S. aureus y E. coli son desactivadas por ROS durante la fotólisis de riboflavina o FMN 10,24,28. Un estudio previo realizado por los autores mostró que las reacciones fotolíticas que involucran riboflavina y FMN reducen el cristal violeta, un colorante triarilmetano y un agente antibacteriano que generafigure-introduction-2, y eliminan la mayor parte de la capacidad antimicrobiana del cristal violeta28. Cuando el dinucleótido de flavina adenina o FMN es irradiado por luz azul, los ROS resultantes producen apoptosis en las células HeLa para su envenenamiento in vitro29. Utilizando tratamiento fotoquímico en presencia de riboflavina, Cui et al. inactivaron linfocitos inhibiendo su proliferación y producción de citoquinas30.

La fotólisis de la riboflavina se utiliza para la inactivación del patógeno sanguíneo por UV 10,24, pero los componentes sanguíneos pueden verse afectados bajo la irradiación de luz UV30. También se informa que las plaquetas expuestas a UV mejoran progresivamente el rendimiento de los marcadores de activación P-selectina y LIMP-CD63 en sus membranas. Es necesario investigar la citotoxicidad de la radiación UV y de alta intensidad y sería de gran utilidad un fotosensibilizador que no sea complicado y seguro durante una fotorreacción FMN que involucre luz visible.

La luz de longitudes de onda más cortas tiene más energía y es mucho más probable que cause daños graves a las células. Sin embargo, en presencia de un fotosensibilizador adecuado, la irradiación con luz violeta de baja intensidad puede inhibir los microorganismos patógenos. Por lo tanto, es importante estudiar la fotosensibilización y la generación de FMN cuando se irradia con luz violeta, para determinar la vía por la cual las ROS de la fotólisis de FMN aumentan la inactivación de figure-introduction-3 las bacterias.

El control antimicrobiano es un problema común y el desarrollo de nuevos antibióticos con frecuencia lleva décadas. Después de la irradiación con luz violeta, la fotoinactivación intermediada por FMN puede aniquilar bacterias patógenas ambientales. Este estudio presenta un protocolo antimicrobiano efectivo in vitro utilizando luz violeta para conducir la fotólisis FMN y así generar figure-introduction-4 para aPDI. La viabilidad microbiana de S. aureus se utiliza para determinar la viabilidad de la aPDI inducida por FMN.

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Protocolo

1. Configuración del sistema de fotólisis

  1. Monte seis diodos emisores de luz (LED) (DC 12 V) en el interior de un vaso de plástico opaco (8 cm x 7 cm) como se muestra en la Figura 1 para establecer un sistema de fotólisis31.
  2. Agregue reactivos (ver más abajo) en los tubos de ensayo de vidrio (13 mm de diámetro y 100 mm de altura) y asegure los tubos en la parte superior de la copa como se muestra en la Figura 1. Coloque la configuración experimental en una habitación con una temperatura constante de 25 ± 3 °C.
  3. Monitoree y registre la temperatura de las unidades de prueba a lo largo de las reacciones fotolíticas mediante un termómetro infrarrojo.
    NOTA: La Figura 2 muestra los espectros de emisión para luces azules, verdes, rojas y violetas, tal como se registran con un espectrómetro óptico UV-Vis calibrado. Las longitudes de onda correspondientes al máximo de absorbancia para las luces LED azules, verdes, rojas y violetas utilizadas en el estudio son 465, 529, 632 y 405 nm, respectivamente. Los chips LED pueden calentar el aparato durante los experimentos de irradiación. Por lo tanto, todo el sistema de fotorreacción en cada experimento se colocó en una habitación donde la temperatura se mantuvo constante a 25 ± 3 ° C.

2. El efecto de la longitud de onda de la luz en la fotólisis de FMN (Figura 3)

  1. Preparar una solución de FMN 0,1 mM en tampón fosfato de potasio (PB) de 100 mM (pH 7,8). Exponga muestras de FMN (3 ml cada una) a luz azul, verde, roja o violeta a una intensidad de 10 W/m2 durante 5 min. Mantenga 3 ml de solución de FMN en la oscuridad como control.
  2. Registrar la absorbancia de muestras de FMN irradiadas en el rango de 250-750 nm utilizando un espectrofotómetro UV/Visible.

3. Método de reducción de tetrazolio azul nitro (NBT) para detectar figure-protocol-1 (Figura 4).

NOTA: El método de reducción de NBT utilizado aquí se modificó ligeramente del ensayo para la fotorreacción de riboflavina. El método de reducción de NBT se utiliza para evaluar el nivel de electrografía generada a partir de figure-protocol-2 la fotólisis FMN. El FMN excitado fotoquímicamente es primero reducido por L-metionina en una semiquinona, que luego dona un electrón al oxígeno dando lugar a figure-protocol-331. El as-generated figure-protocol-4 reduce NBT a formazan, que tiene una absorbancia característica a 560 nm32.

  1. Añadir 109,3 mg de L-metionina a 73,3 ml de PB (100 mM; pH 7,8). Vortex la solución para disolver la L-metionina.
  2. Después de que la L-metionina esté completamente disuelta, agregue 10 mg de polvo de NBT y 1.53 ml de 0.117 mM FMN a la solución. Por cada 1 ml de la solución de reacción (es decir, una mezcla de FMN, L-metionina y NBT) aplicada, las concentraciones finales de FMN, metionina y NBT son 2.4 x 10-6 M, 1.0 x 10-2 M y 1.6 x 10-4 M, respectivamente.
  3. Exponer la solución de reacción (1 ml) a la irradiación de luz LED azul o violeta a 10 W/m2 durante 1-5 min.
  4. Detectar la especie (a partir de la absorbancia a 560 nm) producida por la figure-protocol-5 reacción fotoquímica, que reduce NBT y produce formazan.

4. Viabilidad de S. aureus después de la fotólisis FMN (Figura 5)

  1. Transmitir una colonia de S. aureus (BCRC 10451) de una placa cultivada a 10 ml de caldo de lisogenia tomada en un tubo de ensayo con tapón de rosca de 15 ml. Cultivar en una coctelera a 37 °C durante 16 h.
  2. Transfiera 0,5 ml del cultivo a un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Agregue agua esterilizada en el tubo de centrífuga para diluir el cultivo a una densidad óptica de 0.5 a 600 nm (OD600) (~ 6 x 107 UFC/ml).
  3. Transfiera 0,5 ml del cultivo a un tubo centrífugo de 1,5 ml, centrifugar a 14.000 x g durante 10 min y decantar el sobrenadante para obtener un pellet celular.
  4. Añadir 1 ml de solución tamponada con FMN (30, 60 y 120 μM de FMN en PB) a los gránulos celulares obtenidos como en el paso 4.3, y vórtice. Para el control irradiado, añadir 1 ml de PB solo.
  5. Transfiera 1 ml de soluciones celulares bacterianas viables que contengan 30 μM de FMN y PB solas en tubos de vidrio, e irradiarlas con luz violeta a 10 W / m2 durante 30 min.
  6. Transfiera 1 ml de soluciones celulares bacterianas viables que contengan 30, 60 y 120 μM FMN y PB solos en tubos de vidrio e irradie con luz azul a 20 W / m2 durante 120 min. Coloque otro tubo de vidrio con 1 ml de solución celular bacteriana viable que contenga 120 μM de FMN e irradie con luz azul a 20 W / m2 durante 60 min.
  7. Coloque tubos de ensayo como se describe en los pasos 4.5 y 4.6 y cúbralos con láminas gruesas de aluminio. Estos tubos sirven como controles oscuros.
  8. Mantener la cámara de irradiación (así como los controles oscuros) en una cámara frigorífica a 9 ± 1 °C durante el período de irradiación de 30-120 minutos.
    NOTA: El calor liberado por las luces LED no se puede ignorar ya que los chips LED colocados dentro de la taza pueden calentar el sistema de fotorreacción durante los experimentos de irradiación. Por lo tanto, los experimentos se llevaron a cabo en una cámara frigorífica mantenida a 9 ± 1 °C.
  9. Después de la irradiación, transferir 0,2 ml de cada una de las soluciones de reacción a una placa de agar Luria (LA). Extienda las bacterias sobre la placa con una varilla de vidrio en forma de L e incube durante la noche a 37 °C.
  10. Calcule el recuento viable de placas y las tasas de inactivación de S. aureus después del crecimiento nocturno.
    NOTA: La tasa de inactivación de S. aureus se calcula como el porcentaje de reducción, que es igual a [1 -I / D] ×100%, donde I y D denotan, respectivamente, el número de UFC en la muestra irradiada y el control oscuro. El porcentaje de reducción se define como un valor negativo de la tasa de inactivación.

5. Detección de figure-protocol-6 en S. aureus (Figura 6)

  1. Prepare las muestras de S. aureus como se describe en el paso 4.
  2. Diluir la densidad bacteriana de las muestras con agua esterilizada a una densidad óptica de 0,5 a 600 nm (OD600, ~6 x 106 UFC/ml). Transfiera 0,5 ml del cultivo a un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a 14.000 x g durante 10 min y decantar el sobrenadante para obtener un pellet celular.
  3. Agregue 0.1093 g de L-metionina, 0.1 g de NBT y 25 ml de FMN (400, 240 o 120 μM) a 75 ml de PB. Por cada 1 ml del reactivo aplicado, las concentraciones finales de FMN, metionina y NBT son 100 (60 o 30) x 10-6 M, 7.3 x 10-3 M y 1.2 x 10-3 M, respectivamente.
  4. Añadir 1 ml de cada solución reactiva (es decir, con concentraciones variables de FMN) a los gránulos celulares obtenidos como en la etapa 5.2. Irradiar las soluciones con luz violeta a 10 W/m2 durante 10 min.
  5. Centrifugar la mezcla a 14.000 x g durante 10 min y decantar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) para extraer el NBT reducido. Detectar las especies producidas figure-protocol-7 a partir de la absorbancia a 560 nm.

6. Análisis estadístico

  1. Expresar los datos como media ± desviación estándar (DE) de tres pruebas independientes.
  2. Aplique una prueba t homocedástica de dos muestras para evaluar si dos mediciones son diferentes. Los valores de p < 0,05 se consideran estadísticamente significativos.

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Resultados

Efecto de la longitud de onda de la luz en FMN
Los espectros de absorbancia de 0,1 mM FMN que se irradian utilizando LED azules, verdes, rojos y violetas se muestran en la Figura 3. Hay dos picos para FMN (372 nm y 444 nm) para el control oscuro. La luz verde y roja no tienen ningún efecto porque los cambios en los espectros son insignificantes. Por otro lado, la absorbancia respectiva de FMN a 444 nm se reduce en aproximadamente un 19% y 34%, respectivamente, después de ...

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Discusión

Un fotosensibilizador aumenta la reacción fotoquímica de los compuestos químicos para generar ROS. Los microorganismos patógenos pueden ser inactivados por irradiación de luz en presencia de fotosensibilizadores. Este estudio determina la aPDI de S. aureus debido a ROS generadas por irradiación de luz violeta de un fotosensibilizador exógeno, FMN.

Como se muestra en la Figura 3, para FMN, la absorbancia a 444 nm se reduce significativamente después de 5 m...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Dr. Tak-Wah Wong y al Sr. Zong-Jhe Hsieh por su apoyo con los experimentos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Luces LED azules, verdes y rojasVita LED Technologies Co., Tainan, TaiwánDC 12 V 5050
Dimethyl SulfoxideSigma-Aldrich, St. Louis, MO190186
Termómetro infrarrojoRaytek Co. Santa Cruz, CAMT4
LB caldoDifco Co., NJ
L-MetioninaSigma-Aldrich, St. Louis, MO1.05707
NBTBio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canadá
Suministro de energíaChina tech Co., Nueva ciudad de Taipei, TaiwánYP30-3-2
Riboflavina 5′-fosfatoSigma-Aldrich, St. Louis, MOR7774
RNaseNueva Inglaterra BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Medidor de energía solarTenmars Electronics Co., Taipei, TaiwánTM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureusCentro de Investigación y Recolección de Recursos Biológicos (BCRC), Hsinchu, Taiwán10451
Espectrómetro óptico UV-VisOcean Optics, Dunedin, FLUSB4000
Espectrofotómetro UV-VisHitachi High-Tech Science Corporation, Tokio, JapónU-2900
LED violetaLong-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China

Referencias

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