Una técnica de hemisección lateral de la médula espinal rápida y mínimamente invasiva para modelar lesiones abiertas de la médula espinal en ratas

Desafortunadamente, las lesiones de la médula espinal (LME) son lesiones frecuentes en los seres humanos. Las lesiones de la médula espinal pueden complicarse de diferentes maneras, por ejemplo, por infecciones, y es clínicamente importante estudiar estas lesiones¹. Debido a que no existe una cura única y definitiva para las lesiones de la médula espinal, aún se necesitan modelos animales para ampliar la comprensión de los investigadores y avanzar en posibles tratamientos ^2,3. A pesar de que las lesiones cerradas son las más comúnmente modeladas (compresión y contusión), es clínicamente importante entender las laceraciones, que solo pueden ser modeladas en lesiones abiertas⁴. Los modelos de heridas abiertas que utilizan transección o hemisección se pueden utilizar para demostrar una localización más precisa de una herida en comparación con los modelos de lesiones cerradas, debido a la naturaleza de la lesión (contusión frente a corte quirúrgico). Los experimentos de heridas abiertas pueden arrojar luz sobre lesiones neuronales más específicas de una manera controlada, confiable y replicable⁵. La transección completa o parcial de la médula espinal es una técnica de herida abierta ampliamente utilizada y se puede ver en detalle en el artículo de Brown y Martínez⁶.

Al estudiar la lesión abierta de la médula espinal en ratas, varios animales presentaron problemas derivados de la cirugía: las astillas óseas de la laminectomía se incrustaron en la médula espinal y causaron hinchazón; la herida ósea más grande necesitó mucho tiempo para sanar; La cirugía duró demasiado. Se desarrolló una técnica quirúrgica alternativa para eliminar estos problemas. El objetivo era desarrollar una técnica más rápida y suave para el animal. Esta técnica recientemente desarrollada es mucho más rápida que las técnicas tradicionales de LME. El abordaje quirúrgico es mínimamente invasivo, lo que da como resultado una herida ósea más pequeña y elimina los problemas derivados de la laminectomía.

Todas las técnicas de herida abierta implican la apertura de la duramadre⁷. Varios estudios recientes han examinado diferentes técnicas recientemente desarrolladas, con el objetivo de mejorar los métodos anteriores ^8,9. A pesar de que la apertura de la duramadre no se puede excluir con esta nueva técnica, causa una herida más pequeña en la duramadre al tiempo que ofrece una lesión confiable y controlada de la médula espinal. Consultando la literatura sobre las técnicas de lesión medular, muchos autores intentaron minimizar el tiempo de la cirugía mediante la implementación de cambios menores en la técnica original¹⁰. La laminectomía siempre forma parte de estos procedimientos quirúrgicos, aunque requiere mucho tiempo y requiere la realización de una herida ósea de mayor tamaño⁶. Esta técnica quirúrgica puede ser apropiada para los investigadores que utilizan modelos de lesión medular de herida abierta, específicamente la transección completa o la hemisección lateral realizada en los espacios intervertebrales (Figura 1).

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Directiva de la UE (2010/63/UE) y fueron aprobados por el comité de ética animal de la Oficina Nacional de Seguridad de la Cadena Alimentaria de Hungría (PEI/001/2894-11/2014). Durante este estudio se siguieron todas las regulaciones institucionales y gubernamentales aplicables en relación con el uso ético de los animales.

1. Preparación antes de la cirugía

1. Esterilice todos los instrumentos utilizados durante el procedimiento (consulte la Tabla de materiales) y desinfecte las superficies donde se realizará el trabajo antes del procedimiento.
2. Inyectar una dosis única de antibióticos subcutáneos de forma profiláctica.
   NOTA: Consulte la Tabla de materiales para conocer los detalles de la dosis de antibióticos.
3. Dejar a los animales en el quirófano durante 1 h para aclimatarlos y disminuir su estrés previo a la cirugía.
4. Anestesiar a la rata mediante una inyección intramuscular de una combinación de ketamina y xilacina (ketamina 80 mg/kg de peso corporal (pc) y xilacina 8 mg/kg de peso corporal).
   NOTA: Además de la anestesia, la combinación deketamina y xilacina proporciona suficiente analgesia para este procedimiento. El régimen de analgesia puede ser modificado según las pautas institucionales de uso de animales.
5. Mantenga a la rata caliente durante el procedimiento usando una mesa caliente o luz infrarroja y mantenga los ojos húmedos durante toda la anestesia con ungüento oftálmico (vuelva a aplicarlo según sea necesario).
6. Fije al animal en la mesa de operaciones con cinta quirúrgica en las patas delanteras y traseras y en la cola y, dependiendo del lugar de la lesión, también en el cuello. Si es necesario, coloque a la rata en un marco estereotáxico para estabilizarla durante la cirugía.
7. Usando una sutura quirúrgica estéril, coloque un lazo alrededor de los dientes frontales superiores de la rata y fíjelo en el borde de la mesa de operaciones.
8. Tire de la lengua hacia los lados para controlar las vías respiratorias.
9. Afeitar el pelaje de la espalda, al menos 2 cm en cada dirección de donde se realizará la incisión.
10. Desinfectar la piel de la zona quirúrgica al menos tres veces, utilizando una solución de povidona yodada y una gasa estéril. Tenga especial cuidado de remojar el pelaje que rodea el área. Asegure el sitio quirúrgico con un paño estéril.
11. Evalúe la idoneidad de la anestesia antes de realizar la primera incisión pellizcando los dedos de los pies y la cola del animal. Continúe monitoreando la idoneidad de la anestesia durante todo el procedimiento.

2. Cirugía

1. Coloque la incisión en la piel con una hoja de bisturí 20. Para abrir el área quirúrgica, coloque una incisión de 2-2,5 cm de largo a lo largo de la columna vertebral, cortando todas las capas de la piel. Coloque esta incisión paralela a la columna vertebral utilizando la vértebra L1 como punto medio, haciendo que se extienda ~ 1 cm tanto en dirección craneal como caudal a lo largo de la columna vertebral.
2. Moviliza los lados de la herida cortando el tejido conectivo que rodea los músculos.
3. Coloque dos incisiones paralelas a lo largo de la columna vertebral, penetrando en el periostio. Coloque las incisiones justo al lado de las apófisis espinales en ambos lados, abarcando la distancia entre las vértebras Th13 y L1.
4. Diseccionar los músculos unidos a las vértebras con la ayuda de un raspatorium hasta que todos los ligamentos espinales sean visibles. Poner en marcha un retractor.
5. Extirpar las apófisis espinales de la 13ª vértebra torácica y la^1ª vértebra lumbar utilizando pinzas óseas dentales para visualizar toda el área quirúrgica. A continuación, controle el procedimiento viendo una imagen microscópica ampliada (aumento de 4x-16x).
6. Use gasas estériles para controlar el sangrado durante todo el procedimiento, cuando sea necesario.
7. Levante con cuidado el resto de las apófisis espinales L1, elevando el arco vertebral L1. Corta el ligamento flavum para acceder a la médula espinal. Eleva aún más las apófisis espinales caudales, permitiendo el acceso a la duramadre espinal, que también está cortada. Inclina las apófisis espinales caudales en dirección craneal para visualizar la piamadre.
8. Mira a través de la piamadre la vena mediana posterior, mostrando la línea media de la columna vertebral.
9. Usando la vena como una bisectriz direccional, coloque una incisión con un bisturí microquirúrgico sin afectar la vena. Colocar la incisión debajo de la vena, en el plano transversal a través del diámetro anteroposterior de la médula espinal. Corta la mitad de la médula espinal moviendo la cuchilla lateralmente lejos de la línea central.
   NOTA: La incisión es unilateral, en el lado derecho, en el^4º segmento lumbar.
10. Trate de colocar la incisión para evitar cortar la arteria espinal anterior. Asegúrese de que no se aplique un exceso de presión sobre el cuerpo vertebral al cortar la médula espinal para evitar la arteria espinal anterior en el lado ventral de la médula espinal.

Figura 1: Ilustración que muestra los pasos de la nueva técnica de LME abierta en ratas. (A) Las vértebras expuestas. (B) Extirpación de las apófisis espinales (Th13 y L1). (C) El arco vertebral levantado e inclinado de la vértebra L1. (D) Hemisección realizada en el lado derecho, con la médula espinal hemiseccionada mostrada por separado, ampliada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

11. No cierre la duramadre directamente durante el cierre de la herida. Suturar firmemente (tamaño de sutura 4-0) los músculos a lo largo de las apófisis espinales, cerrando indirectamente la pequeña herida en la duramadre.
12. Cierre la capa de tejido conectivo dorsal con suturas.
13. Finalmente, sutura la piel alrededor del sitio de la incisión.

3. Cuidados postquirúrgicos y seguimiento

1. Deja que los animales se despierten en sus jaulas. Mantenga a los animales calientes usando una lámpara de calor además de la habitación con temperatura controlada. No deje a las ratas solas después de que se despierten después de la cirugía, y no las ponga juntas con otras ratas en la misma jaula.
2. Controle su frecuencia respiratoria al menos cada 10 minutos hasta que esté completamente despierto. Si es necesario, aplique una estimulación suave (p. ej., frote la cabeza) para ayudar a que se despierten de la anestesia.
3. Cuando los animales estén alerta y adecuadamente activos, transpórtelos de manera segura de regreso a la casa de los animales.
4. Mantenga a las ratas bajo estrecha vigilancia durante las primeras 24 horas después de la cirugía. Después de las primeras 24 horas después de la cirugía, revise a los animales al menos dos veces al día hasta el final del experimento, monitoreando los signos de angustia.
5. Evalúelos minuciosamente una vez al día para detectar signos de angustia utilizando el protocolo institucional de bienestar animal pertinente y tenga especial cuidado en revisar sus heridas en busca de signos de infección e inflamación.
   NOTA: El estrés y la infección afectan el bienestar de los animales y el resultado de los experimentos.
6. Administrar antibióticos por vía subcutánea todos los días hasta el final de los experimentos. Mantenga a los animales en jaulas estériles, un animal por jaula, y dele comida y agua ad libitum, igual que antes. Al final de los experimentos (o si se observa alguna reacción adversa grave durante el período de tiempo del experimento), sacrificar a los animales de forma humanitaria, de acuerdo con el protocolo institucional de bienestar animal pertinente.
   NOTA: Aquí, los animales fueron sacrificados (en un sueño profundo inducido por la combinación de ketamina y xilacina) administrando primero una perfusión fisiológica de solución salina (1/3 mL/g de peso corporal) seguida de una perfusión de paraformaldehído al 4% (1 ml/g de peso corporal).

Después de la hemisección, las ratas muestran parálisis en la extremidad posterior ipsilateral (prueba in vivo de hemisección exitosa). La evaluación exhaustiva de la muestra solo se puede realizar después de la extirpación de la médula espinal (véase la Figura 2, donde la médula espinal extirpada se puede ver tanto desde el lado ventral como desde el dorsal).

Figura 2: Vistas ventral y dorsal de la médula espinal extirpada después de la hemisección. Toda la médula espinal extirpada vista desde el lado ventral (A) y el lado dorsal (B) se muestran uno al lado del otro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En primer lugar, la médula espinal extirpada se analiza en su totalidad bajo un microscopio con un aumento de 4x-16x (para evaluar el grado y la precisión de la lesión). A continuación, la muestra se analiza más a fondo mediante histología, donde se puede ver el sitio de la lesión con mayor detalle. Para la preparación de las muestras se utilizó tinción de hematoxilina y eosina (H&E) (Figura 3).

Figura 3: Muestra histológica que muestra la hemisección. Muestra histológica teñida con hematoxilina y eosina, que muestra la hemisección, vista al microscopio (aumento de 16x). Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 2 y la Figura 3 muestran que la incisión es perfectamente aceptable en longitud y colocación. La calidad de las muestras fue al menos tan buena como la obtenida de animales cuya médula espinal fue hemiseccionada utilizando el abordaje quirúrgico tradicional con laminectomía (para una descripción detallada del método quirúrgico tradicional, ver 6). Las imágenes no difieren cualitativamente del resultado de cualquier otro abordaje quirúrgico, a pesar de que esta técnica es más rápida y no existe laminectomía.

Los resultados muestran que esta técnica se puede realizar mucho más rápido que el abordaje quirúrgico tradicional mediante laminectomía (11 min vs. 35 min). La médula espinal se expone durante 10-15 s con este método, en comparación con un mínimo de 3,5 min con laminectomía (hasta el cierre de la duramadre). En conclusión, este nuevo método de LM mínimamente invasivo sin laminectomía es mucho más rápido y no requiere ningún instrumental especializado adicional.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales que puedan haber influido en el trabajo reportado en este artículo.