Artículo de método

Lesión traumática de los nervios periféricos en ratones

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DOI:

10.3791/63551

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25 de marzo de 2022

 ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Korea University Guro Hospital, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Center for Orthopaedics and Translational Science, The Pennsylvania State University College of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El presente protocolo describe las lesiones traumáticas de los nervios periféricos (TPNI), incluyendo el aplastamiento calibrado con precisión, la laceración estrictamente alineada y desalineada, así como los espacios injertados y no injertados del nervio ciático en ratones. Se desarrollan sensores diseñados a medida para medir el traumatismo nervioso, inducido con herramientas comúnmente disponibles para garantizar resultados reproducibles posteriores a la TPNI.

Resumen

La lesión traumática de los nervios periféricos (TPNI) es una causa frecuente de morbilidad después de un traumatismo ortopédico. Los métodos reproducibles y precisos para lesionar el nervio y denervar el músculo han sido durante mucho tiempo un objetivo en la investigación musculoesquelética. Muchas extremidades lesionadas traumáticamente tienen un traumatismo nervioso que define el resultado a largo plazo del paciente. A lo largo de varios años, se han desarrollado métodos precisos para producir lesiones nerviosas microquirúrgicas, como aplastamientos, laceraciones e injertos de espacio nervioso, lo que permite evaluar los resultados de forma reproducible. Además, se crean nuevos métodos para lesiones por aplastamiento calibradas que ofrecen correlaciones clínicamente relevantes con los resultados utilizados para evaluar a los pacientes humanos. Los principios de manipulación mínima para garantizar una baja variabilidad en la lesión nerviosa permiten agregar aún más lesiones tisulares asociadas a estos modelos. Esto incluye el aplastamiento muscular directo y otros componentes de la lesión de las extremidades. Finalmente, la evaluación de la atrofia y el análisis preciso de los resultados conductuales hacen de estos métodos un paquete completo para estudiar el trauma musculoesquelético que incorpora de manera realista todos los elementos de la lesión traumática de las extremidades humanas.

Introducción

La lesión traumática de los nervios periféricos (TPNI) es una causa frecuente de morbilidad tras un traumatismo ortopédico 1,2,3. Anualmente, aproximadamente el 3% de los pacientes con traumatismos sufren lesiones nerviosas 1,4, con una incidencia de 350.000 casos5, lo que resulta en 50.000 reparaciones quirúrgicas6. Las TPNI ocurren en un amplio rango de gravedad, y la recuperación funcional depende directamente del tipo y la gravedad de estas lesiones 7,8,9. Los traumatismos menos graves (p. ej., aplastamiento leve, laceración incompleta, etc.) lesionarán primero la vaina de mielina y los axones, mientras que las fuerzas más graves (p. ej., aplastamiento grave, laceraciones completas, etc.) alterarán los tejidos nerviosos conectivos; Por ejemplo, el endoneuro, el perineuro y el epineuro, además de la mielina y los axones 1,10. Los pacientes con TPNI esperan que la función nerviosa regrese con el tiempo y que la atrofia muscular se revierta. Décadas de investigación no han proporcionado tratamientos precisos para mejorar o asegurar la recuperación completa a pesar de los avances en los procedimientos de tratamiento11,12.

Las transecciones nerviosas no sanarán sin una reparación quirúrgica, que a menudo se realiza bajo el microscopio. Las reparaciones generalmente se realizan de principio a fin, haciendo un esfuerzo para garantizar que el sitio de reparación no esté bajo tensión. El injerto de nervio se utiliza para garantizar que las reparaciones no se tensen13,14. A pesar de los métodos aparentemente avanzados utilizados en estas reparaciones, la recuperación funcional es generalmente poco impresionante11,12. La rehabilitación suele ser incompleta e insatisfactoria. La recuperación funcional óptima requiere la regeneración de los axones para que atraviesen el sitio de la lesión (puente nervioso) e inerven el órgano objetivo. Estos procesos se complican por la desviación axonal o el retraso del crecimiento, lo que resulta en atrofia muscular y eventual incapacidad para recuperarse 15,16,17,18. Se ha demostrado que los resultados funcionales después de la reparación del nervio (p. ej., sutura de extremo a extremo, isoinjerto, etc.) dependen de la precisión de la aposición fascicular19,20. Por lo tanto, la direccionalidad adecuada de los muñones nerviosos seccionados y sus fascículos es fundamental en la reparación nerviosa, sin la cual se puede esperar una recuperación funcional deficiente incluso con una regeneración axonal óptima. La reparación microquirúrgica de la sutura en sí misma es un proceso traumático, y poco se ha producido en términos de métodos novedosos para mejorar drásticamente los resultados. El campo carece de modelos animales de transección nerviosa reproducibles, lo que da lugar a brechas predecibles que permiten mediciones de recuperación confiables a nivel funcional y tisular. Dichos métodos, de estar disponibles, permitirían caracterizar la regeneración nerviosa sin los problemas de cambios variables en la vascularización neural y la atrofia post-denervación21,22. Muchos grupos se esfuerzan por utilizar mejores modelos que limiten este tipo de variabilidad. Una forma es asegurarse de que las reparaciones nerviosas se manipulen mínimamente y que los muñones nerviosos se opongan perfectamente.

Esto se logra mejor mediante el uso de una técnica estandarizada de transección de nervios periféricos llamada corte escalonado y pegamento de fibrina (STG). Las reparaciones en este modelo STG se aseguran con pegamento de fibrina, y las distancias entre espacios se estandarizan y minimizan21,22. El propio pegamento de fibrina se emplea en los seres humanos para estas reparaciones, probablemente por las mismas razones, junto con sus efectos beneficiosos sobre la formación de cicatrices posteriores a la reparación23,24. La clave del método actual es que la reparación del nervio comienza antes de que se complete la laceración, lo que garantiza un patrón de lesión fijo. Este método actual exhibió una similitud cercana a la fisiopatología característica de la transección nerviosa con la sutura epineural estándar de oro, y el impacto negativo del pegamento de fibrina no se observó en la regeneración nerviosa. La reparación de la transección del nervio ciático con pegamento de fibrina en ratones mejora la elongación del axón en comparación con la regeneración temprana del nervio mediante sutura, y estos hallazgos son consistentes con la STG. La STG también se beneficia del principio de manipulación mínima, en el que el nervio nunca se toca para la posición de la sutura21. Esto estandariza efectivamente el trauma nervioso asociado con la reparación en el modelo. Se utilizaron principios similares para investigar la desalineación volteando el nervio antes de pegar22. Esto permitió la comparación directa de las lesiones nerviosas en las que casi la misma cantidad de manipulación contribuyó a las diferencias en la alineación sin aumentar el espacio o el traumatismo. Esto facilitó el examen directo del efecto de la alineación sobre los cambios neurovasculares inducidos por lesiones nerviosas21,22, la atrofia muscular21,22 y la recuperación funcional21,22. La presente investigación es todo lo que permite el estudio de los muñones nerviosos desalineados de manera intencional y precisa.

La mayoría de los nervios en TPNI no están cortados, no tienen espacio ni defecto, y parecen ser capaces de recuperarse, y sin embargo, en muchos de estos casos, las extremidades permanecen permanentemente disfuncionales por lesiones nerviosas y confusas intervenciones. Las TPNI experimentales se realizan habitualmente en lesiones por aplastamiento del nervio ciático (SNCI) de roedores utilizando destornilladores de aguja de bloqueo (ND), fórceps o dispositivos similares, y un cirujano experimentado para crear una lesión por aplastamiento precisa y reproducible 25,26,27,28,29,30 . Los modelos animales SNCI dependen de la precisión innata del operador para limitar la variación de presión, pero esto nunca se mide explícitamente. Esto da lugar a una variabilidad entre los animales y los estudios, sin una orientación clara sobre la presión estandarizada. Por lo tanto, se anticipa que la capacidad de emitir y notificar con precisión una serie coherente y precisa de lesiones con varias intensidades conocidas puede beneficiar al campo de la TPNI. Un modelo perfecto puede proporcionar un SNCI de la gravedad de una lesión nerviosa conocida en cada animal por cualquier laboratorio o investigador para un auténtico interestudio y replicabilidad del dispositivo. Para abordar esta deficiencia, se construyó un dispositivo digital calibrado único que contiene una resistencia sensible a la fuerza (FSR), competente para informar la presión (en tiempo real) aplicada a un nervio. A continuación, se probó la replicabilidad de diversas presiones de lesiones por aplastamiento desplegadas por diversos tipos de pinzas y ND31.

Finalmente, se desarrolló un método específico para abordar las brechas en el nervio32. Las brechas nerviosas en la literatura se inducen mediante la extirpación de una sección de nervio y luego reparándola de nuevo en el defecto 13,33,34. La manipulación requerida para este procedimiento quirúrgico a menudo se combina con la sutura, y los muñones del nervio se retraen de manera variable 21,32,34. Se basó en el razonamiento de que el uso de injertos nerviosos isogénicos de gran tamaño, la retracción del muñón nervioso nunca será un problema32. El método requería la operación simultánea en dos o tres animales a la vez, tomando un injerto de 7 mm para colocarlo en un defecto de 5 mm inducido en otro animal. El tamaño del defecto del segundo animal se utilizaba para injertar un defecto aún más pequeño en otro animal si era necesario. Esto dio como resultado un método integral para la cirugía simultánea para injertar defectos con nervios del donante que siempre son más grandes que el defecto nervioso para garantizar una reparación sin tensión. Junto con el requisito de manipulación mínima, esto ofrece una vía para estudiar la longitud del injerto directamente en animales singénicos sin espacios de injerto asimétricos que son omnipresentes en la literatura 20,32,34.

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Protocolo

El diseño experimental y los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina de la Universidad Estatal de Pensilvania. Para los estudios se utilizaron ratones machos C57BL/6J adultos, de 10 semanas de edad, con un peso de 20-25 g. Los animales fueron alojados en el animalario bajo condiciones de manejo estéril y fueron aclimatados al menos 5 días antes de realizar los estudios.

1. Preparación animal

  1. Anestesiar profundamente a los animales con un cóctel de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal con una aguja de 26 G.
  2. Afeitar la extremidad trasera derecha y la parte inferior de la espalda de los animales con una recortadora y luego limpiar con alcohol preparado con una solución de povidona yodada al 10% utilizando aplicadores estériles con punta de algodón (ver Tabla de Materiales).
  3. Aplique un ungüento lubricante oftálmico en los ojos con aplicadores estériles con punta de algodón para evitar la sequedad de los ojos.
  4. Después de la preparación, coloque a los animales sobre una almohadilla térmica homeotérmica (consulte la tabla de materiales) para mantener la temperatura corporal a 37 ° C.
  5. Pega las extremidades traseras de los ratones en la almohadilla térmica y colócalas con cuidado de manera simétrica para que la articulación de la rodilla forme un ángulo recto con el cuerpo.
  6. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos en autoclave y luego colóquelos en la almohadilla estéril.
    NOTA: El cirujano debe usar una mascarilla, bata y guantes estériles antes de realizar cirugías.

2. Generación del modelo de Lesión Traumática de los Nervios Periféricos (TPNI)

  1. Después de la preparación, haga una incisión lateral en la piel (~2 cm) a lo largo del fémur utilizando una tijera y un microscopio binocular de precisión con zoom estereoscópico (véase la tabla de materiales).
  2. Exponga sin rodeos el nervio ciático (SN) a través de la banda iliotibial con tijeras de disección y pinzas microquirúrgicas. Evite cualquier daño mecánico iatrogénico en el SN.
  3. Cierre la piel con grapas quirúrgicas después de las cirugías de TPNI (pasos 4-9). Administrar buprenorfina de liberación lenta (0,05 mg/kg) (ver Tabla de Materiales) por vía subcutánea a todos los animales como analgésico.
  4. Realice una lesión por aplastamiento del nervio ciático (SNCI) siguiendo los pasos a continuación.
    1. Coloque el SN aproximadamente 3 mm proximal a la trifurcación en forma plana entre las puntas de las pinzas (Figura 1A).
      NOTA: Se debe tener mucho cuidado para evitar una posición deforme, lo que trae variaciones en los resultados experimentales entre animales/grupos.
    2. Realice la SNCI utilizando pinzas calibradas y plantillas de aluminio personalizadas (Figura 1C)31,35 para dar como resultado una presión específica sobre un ancho fijo (3,5 mm).
      NOTA: Los detalles del dispositivo sensor de presión digital para SNCI que utiliza pinzas calibradas y plantillas de mandrinado personalizadas se mencionan en nuestros informes publicados anteriormente31,35. Las plantillas personalizadas se fabricaban perforando agujeros en pequeñas piezas de aluminio. Se ha confirmado que estas plantillas producen presiones específicas utilizando un sensor de presión digital, utilizando piezas y especificaciones disponibles públicamente y descritas anteriormente 31,35.
    3. Después de la colocación, empuje la plantilla suavemente para alcanzar el bloque de las pinzas y, después de 30 s, suelte lentamente la plantilla y confirme la lesión por la estructura alterada del nervio (Figura 1B).
      NOTA: Las alteraciones estructurales del nervio confirman el grado de gravedad de la lesión. Esto se puede verificar usando microscopía en casos de juicio.
    4. Después de la IRSN, entierre el nervio entre los músculos con cuidado para evitar lesiones iatrogénicas por parte de un cirujano.
      NOTA: Las lesiones por aplastamiento causadas por pinzas calibradas fueron exactas, confiables y reproducibles, lo cual se estableció utilizando el dispositivo sensor de presión de pellizcode precisión 31 (Figura 1D). En la Figura 2A, B, se muestra el curso temporal de la presión en tiempo real de la lesión por aplastamiento mediante diferentes plantillas con pinzas.
  5. Realizar transección y pegamento (TG).
    1. Transecte el SN completamente ~3 mm proximal a la trifurcación del SN con tijeras de disección.
    2. Después de la transección, repare el espacio nervioso al instante aplicando 10 μL de pegamento de fibrina (consulte la Tabla de materiales) alrededor del sitio de la transección para limitar el desplazamiento adicional de los extremos nerviosos cortados. El tiempo de coagulación del pegamento de fibrina fue de ~15 s.
      NOTA: El espacio SN fue descontrolado y desordenado después de la transección debido a la retracción, lo que podría ser una variable para el resultado resultante.
  6. Realice la transección y el pegamento escalonados (STG).
    1. Transecte el SN de manera incompleta (80% de su ancho) ~ 3 mm proximal a la trifurcación del SN utilizando tijeras de disección para evitar la formación de espacios.
    2. A continuación, aplique 10 μL de cola de fibrina alrededor del sitio de corte y seccione completamente el 20% restante del nervio antes de completar la coagulación (~ 10 s) del pegamento.
      NOTA: Este método disminuyó eficazmente la formación de espacios causados por la retracción elástica de los extremos nerviosos cortados, pero también estuvo libre de manipulación quirúrgica adicional para el nervio, a diferencia del modelo TG (Figura 3A).
  7. Realice volteo y transección con pegamento (FTG).
    1. Primero, transeche el SN al 40% de su ancho desde cada lado (Figura 3B).
    2. Voltear transversalmente el muñón distal y aplicar 10 μL de pegamento de fibrina alrededor del sitio de la transección.
    3. A continuación, seccione completamente el nervio central del 20% antes de completar la coagulación (~10 s) del pegamento de fibrina.
    4. Confirme la transección completa bajo un microscopio directo.
  8. Realice el espacio y el injerto de nervio siguiendo los pasos a continuación.
    1. En un modelo de injerto y espacio nervioso graduado, utilice pares de ratones en serie para el injerto de nervio singénico en cascada32 en 1 conjunto de experimentos.
    2. En un ratón (por ejemplo, el ratón #1), cree un espacio nervioso de 7 mm (G-7/0) en el SN derecho, donde el nervio se diseccionó ~3 mm proximal a la trifurcación del SN y a una distancia de 7 mm de esta utilizando una escala graduada estéril (Figura 3C).
      NOTA: Se creó un espacio nervioso irreparable al diseccionar un nervio ciático de 7 mm sin injerto. Este ratón está etiquetado como G-7/0 porque se toma un injerto de 7 mm, pero no se realiza ninguna reparación.
    3. Después de la disección, transfiera inmediatamente el nervio seccionado a la condición estéril de la placa de Petri que contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS) y entierre el muñón proximal del SN (ratón # 1) debajo del músculo con 10 μL de pegamento de fibrina.
    4. A continuación, en el ratón #2, cree un espacio nervioso de 5 mm en el SN derecho e injerte la sección nerviosa disecada de 7 mm del ratón #1 utilizando pegamento de fibrina (10 μL, ~10 s) en ambos extremos (G-5/7) (Figura 3C).
      NOTA: Durante el injerto, se debe tener especial cuidado para evitar desalineaciones y otras lesiones iatrogénicas del SN por parte del cirujano.
  9. Realizar transecciones y suturas escalonadas (STS).
    1. Cortar el nervio ciático a lo largo del 80% de su anchura (Figura 3D) y reparar los muñones con puntos epineurales de nylon 9-0.
    2. Una vez finalizado, corte la parte restante del nervio y repare con una sola puntada de nailon 9-0.
    3. Invierte el nervio para exponer la parte posterior de la laceración y usa dos puntos de nailon 9-0 para completar la reparación.

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Resultados

El dispositivo sensor de presión digital hecho a medida (Figura 1D) funciona detectando el cambio en la resistencia del FSR cuando se aplica una fuerza. Este dispositivo detecta y registra las cantidades de presión más modestas que se le aplican con un tiempo de respuesta de <5 μs, una frecuencia de muestreo de 20 Hz y un rango de presión de 2,5-25 lbs31. Las diferencias en la presión SNCI inducida por las pinzas (Figura 1C) (

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Discusión

La historia de la investigación en TPNI se extiende a lo largo de varias décadas11,12. Los primeros experimentos con perros y especies más grandes establecieron la importancia de los modelos animales en el estudio de los resultados de la TPNI 36,37,38. Con el tiempo, estos modelos se han trasladado a roedores más pequeños, con sus medida...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los NIH (K08 AR060164-01A) y el DOD (W81XWH-16-1-0725; W81XWH-19-1-0773) además del apoyo institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad Estatal de Pensilvania, Hershey, PA 17033, EE. UU.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Preparación de alcoholCOVIDIEN5110
BuprenorfinaZooPharmBSRLAB0.5-211706
C57BL/6JJackson Laboratories, Bar HarborN/A
Aplicadores con punta de algodónPuritan25-8062WC
Tijera de disecciónASSIASSI.
Pegamento de fibrina-TISSEELBaxter1501263
Resistencia sensible a la fuerza (FSR)N/APinzas FlexiForce A301
FST-Dumont5SF Inox, 11252-00
GraphPad PrismGraphPad Software Inc.Versión 8.4.3.
Almohadilla térmica homeotérmicaKent ScientificRJ1675
Ketamina/KetavedVEDCOVED1220
Pinzas microquirúrgicasMiltex Premium instrumentsBL1901
Pomada lubricante oftálmicaAkorn Animal HealthNDC 59399-162-35
Placa de PetriVWR25384-092
Solución salina tamponada con fosfatoGibco14190-144
Povidona yodadaSolimoL0017765SA
Dispositivo sensor de presión de pellizco de precisiónTijera N/Aa medida
Miltex Premium21-536
Microscopio binocular estereoscópico con zoomWorld Precision InstrumentsModelo PZMIII
Guantes estérilesCardinal Health9L19E511
3M-PreciseDS-25
Cinta quirúrgica3M-Microphore1530-0
SuturasEthiconBV130-5
JeringaBD309597
Philips ElectronicsMG3750
Xilacina/AnasedAkorn Salud Animal, Inc.
SDC18R8, Grapas quirúrgicas Recortadora de VAM4811

Referencias

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