Este protocolo muestra cómo obtener una "huella digital" espectrométrica de masas de cardiolipina leucocitaria para el diagnóstico del síndrome de Barth. La evaluación de la relación monolisocardiolipina a cardiolipina elevada discrimina a los pacientes con síndrome de Barth de los pacientes con insuficiencia cardíaca de control con 100% de sensibilidad y especificidad.
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Artículo de método
Huellas dactilares cardiolipina en leucocitos por espectrometría de masas para un diagnóstico rápido del síndrome de Barth
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Resumen
Resumen
La cardiolipina (CL), un fosfolípido dimérico que lleva cuatro cadenas de ácidos grasos en su estructura, es el marcador lipídico de las mitocondrias, en el que desempeña un papel crucial en el funcionamiento de la membrana interna. Su metabolito monolisocardiolipina (MLCL) está fisiológicamente casi ausente en el extracto lipídico de células animales y su aparición es el sello distintivo del síndrome de Barth (BTHS), una enfermedad genética rara y a menudo mal diagnosticada que causa miocardiopatía grave en la infancia. El método descrito aquí genera una "huella dactilar de cardiolipina" y permite un ensayo simple de los niveles relativos de las especies de CL y MLCL en los perfiles lipídicos celulares. En el caso de los leucocitos, solo se requiere 1 ml de sangre para medir la relación MLCL / CL a través de la ionización por desorción por láser asistida por matriz: tiempo de vuelo / espectrometría de masas (MALDI-TOF / MS) justo dentro de las 2 h posteriores a la extracción de sangre. El ensayo es sencillo y se puede integrar fácilmente en el trabajo de rutina de un laboratorio de bioquímica clínica para detectar BTHS. La prueba muestra una sensibilidad y especificidad del 100% para BTHS, lo que la convierte en una prueba de diagnóstico adecuada.
Introducción
El síndrome de Barth (BTHS) es una enfermedad rara ligada al cromosoma X caracterizada por miocardiopatía de inicio temprano, miopatía del músculo esquelético, retraso en el crecimiento, neutropenia, disfunción variable de la cadena respiratoria mitocondrial y estructura mitocondrial anormal 1,2,3,4,5. BTHS tiene una prevalencia de un caso por millón de hombres con actualmente menos de 250 casos conocidos en todo el mundo, aunque es ampliamente aceptado que la enfermedad está infradi....
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Protocolo
Las muestras de sangre de donantes sanos y pacientes con insuficiencia cardíaca se recogieron en el Hospital Policlínico de Bari (Italia), mientras que las muestras de pacientes con BTHS fueron obtenidas por la clínica BTHS del Servicio Nacional de Salud del Reino Unido en el Hospital Real para Niños de Bristol (Reino Unido). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de donantes, pacientes y padres sanos (cuando corresponda) y las aprobaciones de los respectivos comités de ética.
NOTA: Si no se usa inmediatamente, la sangre (en tubo de gel K-EDTA) se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de 24-48 h.
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Resultados
En este estudio, se ha descrito un método simple y rápido para aislar leucocitos de 1 ml de sangre total y obtener huellas dactilares de CL por MALDI-TOF/MS (ver Figura 2). La Figura 3 muestra la comparación de las huellas dactilares representativas de CL de leucocitos, obtenidas de sujetos de control y niños jóvenes con BTHS, en el rango de masa CL y MLCL (m / z). La Tabla 1 enumera las especies de CL y MLCL detectadas en estos espectr.......
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Discusión
El síndrome de Barth es un error innato del metabolismo y una afección que cambia la vida y que es probable que no se diagnostiquelo suficiente 2,6. Como se mencionó anteriormente, un factor que contribuye puede ser la falta de una prueba de diagnóstico directa. Aquí, se describió un método simple y rápido para medir la relación MLCL/CL por MALDI-TOF/MS en leucocitos para el cribado de BTHS. Además, los espectrómetros de masas MALDI-TOF están ampliamente dis.......
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Divulgaciones
Todos los autores declaran que el estudio se realizó en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Agradecimientos
Estamos agradecidos con las personas con BTHS y sus familias por participar en nuestra investigación. Agradecemos a barth Syndrome Foundation US y Barth Syndrome UK Trust por su apoyo y por ayudar con la recolección de las muestras de sangre en la reunión anual en Bristol. Este estudio fue financiado por Barth Syndrome Foundation US, Barth Italia Onlus y Apulia Region.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipina | Avanti Polar Lipids | 750332 | Lipid estándar para la calibración de MALDI-TOF |
| 1,1′ 2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipina | Avanti Lípidos polares | 710335 | Patrón lipídico para la calibración de MALDI-TOF |
| 1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina | Avanti Polar Lipids | 878130 | Patrón lipídico para la calibración de MALDI-TOF |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glicero-3-fosfato | Avanti Polar Lipids | 830845 | Patrón de lípidos para la calibración de MALDI-TOF |
| 1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) | Avanti Polar Lipids | 840445 | Lipid estándar para la calibración de MALDI-TOF |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840033 | Patrón de lípidos para la calibración de MALDI-TOF |
| 2-Propanol, reactivo ACS, ≥ 99.5% | Merck Life Science S.r.l. | ||
| 9-Aminoacridina hemihidrato, 98% | Acros Organics | 134410010 | |
| acetonitrilo, reactivo ACS, ≥ 99.5% | Merck Life Science S.r.l. | ||
| Cloroformo, reactivo ACS, ≥ 99.8% | Merck Life Science S.r.l. | ||
| Dextrano de Leuconostoc spp. Sr. 450.000-650.000 | Merck Life Science S.r.l. | 31392 | |
| Flex Analysis 3.3 | Bruker Daltonics | Software | |
| MALDI-TOF espectrómetro de masas Microflex LRF | Bruker Daltonics | ||
| Microsoft Excel | Microsoft Office | Software | |
| OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate | Merck Life Science S.r.l. | 6505-OP | |
| Cloruro de potasio, reactivo ACS, 99,0-100,5% | Merck Life Science S.r.l. | P3911 | |
| Cloruro de sodio, reactivo ACS, ≥ 99.0% | Merck Life Science S.r.l. | S9888 |
Referencias
- Barth, P. G., et al. X-linked cardioskeletal myopathy and neutropenia (Barth syndrome): respiratory-chain abnormalities in cultured fibroblasts. Journal of Inherited Metabolic Disease. 19 (2), 157-160 (1996).
- Steward, C. G., et al.
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Reimpresiones y permisos
