Estimulación del estallido auricular transesofágico para la inducción de la fibrilación auricular en ratas

Resumen

El presente trabajo describe un protocolo experimental de estimulación de estallido auricular transesofágico para la inducción eficiente de la fibrilación auricular (FA) en ratas. El protocolo se puede utilizar en ratas con corazones sanos o remodelados, lo que permite el estudio de la fisiopatología de la FA, la identificación de nuevas dianas terapéuticas y la evaluación de nuevas estrategias terapéuticas.

Resumen

Los estudios en animales han aportado información importante a nuestra comprensión con respecto a la fisiopatología de la fibrilación auricular (FA) y el manejo terapéutico. La reentrada, uno de los principales mecanismos implicados en la patogénesis de la FA, requiere una cierta masa de tejido miocárdico para que se produzca. Debido al pequeño tamaño de las aurículas, los roedores han sido considerados durante mucho tiempo "resistentes" a la FA. Aunque se ha demostrado que la FA espontánea ocurre en ratas, se requiere un seguimiento a largo plazo (hasta 50 semanas) para que la arritmia ocurra en esos modelos. El presente trabajo describe un protocolo experimental de estimulación de ráfaga auricular transesofágica para la inducción rápida y eficiente de fa en ratas. El protocolo se puede utilizar con éxito en ratas con corazones sanos o remodelados, en presencia de una amplia variedad de factores de riesgo, lo que permite el estudio de la fisiopatología de la FA, la identificación de nuevas dianas terapéuticas y la evaluación de nuevas estrategias profilácticas y / o terapéuticas.

Introducción

La fibrilación auricular (FA) es la arritmia cardíaca sostenida más frecuente encontrada en la práctica clínica y su incidencia y prevalencia continúan aumentando dramáticamente en todo el mundo¹. Esta arritmia afecta hasta al 4% de la población mundial según estudios recientes². Sin embargo, dado que la FA paroxística puede ser asintomática y, por lo tanto, puede escapar a la detección, es probable que la verdadera prevalencia de fa sea mucho mayor que la presentada en la literatura.

La fisiopatología de la FA ha sido intensamente estudiada. Sin embargo, los mecanismos subyacentes de esta arritmia compleja permanecen incompletamente dilucidados y esto se refleja en las limitadas opciones terapéuticas, con una eficacia cuestionable. Los estudios en animales han aportado información importante a nuestra comprensión con respecto a la fisiopatología de la FA y el manejo terapéutico. La reentrada, uno de los principales mecanismos implicados en la patogénesis de la FA³, requiere una cierta masa de tejido miocárdico para que se produzca. Por lo tanto, los animales grandes generalmente han sido preferidos en los estudios de FA, mientras que, debido al pequeño tamaño de sus aurículas, los roedores se han considerado durante mucho tiempo "resistentes" a la FA. Sin embargo, el uso de animales grandes se ve obstaculizado principalmente por dificultades de manejo. Mientras tanto, aunque se ha demostrado que la FA espontánea ocurre en ratas⁴, se requiere un seguimiento a largo plazo (hasta 50 semanas) para que la arritmia ocurra en esos modelos⁵. También se han desarrollado modelos que aseguran la rápida aparición de FA en roedores pequeños. La mayoría de las veces, esos modelos utilizan estimulación eléctrica aguda, a menudo en presencia de otras afecciones favorables, como la estimulación parasimpática concomitante o la asfixia, para inducir artificialmente la FA ^6,7. Aunque eficientes, estos modelos no permiten la evaluación de características críticas relacionadas con la FA, como la remodelación eléctrica progresiva, estructural, autónoma o molecular de las aurículas, ni los efectos de los fármacos antiarrítmicos convencionales o no convencionales sobre el sustrato auricular o sobre el riesgo de proarritmia ventricular ^8,9.

El presente trabajo describe un protocolo experimental de estimulación de estallido auricular transesofágico a largo plazo para la inducción rápida y eficiente de la FA en ratas. El protocolo es adecuado tanto para estudios agudos como a largo plazo y puede usarse con éxito en ratas con corazones sanos o remodelados, en presencia de una amplia variedad de factores de riesgo, lo que permite el estudio de la fisiopatología de la FA, la identificación de nuevas dianas terapéuticas y la evaluación de nuevas estrategias profilácticas y / o terapéuticas.

Protocolo

Los procedimientos que involucran sujetos animales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Medicina, Farmacia, Ciencia y Tecnología "George Emil Palade" de Târgu Mureș, por la Autoridad Nacional Veterinaria y de Seguridad Alimentaria Sanitaria de Rumania y cumplieron con las directrices del Consejo Internacional para la Ciencia de los Animales de Laboratorio (Directiva 2010/63 / UE).

1. Protocolo de estimulación de ráfaga auricular transesofágica

1. Aleatorice ratas Wistar macho adultas (200-400 g de peso corporal) en dos grupos: STIM y SHAM.
2. Anestesiar a los animales.
   1. Para la inducción, use 2.5% de isoflurano, 4 L/min, 99.5% O₂.
   2. Para el mantenimiento, use una mezcla de ketamina/medetomidina (75.0/0.5 mg/kg) administrada por vía intraperitoneal.
   3. Compruebe la profundidad de la anestesia probando el reflejo corneal (solución de glucosa al 5%) y el reflejo de abstinencia nociceptiva (pellizco del dedo del pie). Controle la frecuencia respiratoria (una caída del 50% es aceptable durante la anestesia; la frecuencia normal está entre 70-120 respiraciones / minuto) y la temperatura corporal utilizando un termómetro rectal (la temperatura normal está entre 96.5 - 99.5 ° F o 35.9 - 37.5 ° C).
      NOTA: Continúe el procedimiento solo después de que se confirme la efectividad de la anestesia. Monitoree la profundidad de la anestesia periódicamente durante todo el protocolo. Repita la inyección intraperitoneal de ketamina/medetomidina cuando sea necesario.
   4. Aplique un ungüento oftálmico en ambos ojos para prevenir el daño corneal.
3. Coloque al animal en posición supina y colóquelo en una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal a ~ 37 ° C.
4. Conecte los tres electrodos de ECG de superficie a las extremidades de la rata en una configuración de plomo II (Figura 1A).
   1. Coloque el electrodo negativo en la extremidad anterior derecha.
   2. Coloque el electrodo positivo en la extremidad posterior izquierda.
   3. Coloque el electrodo de conexión a tierra en la extremidad anterior izquierda.
   4. Asegure los electrodos en su posición usando delgados cordones de cuerda de pulsera elástica.
5. Encienda el registro de ECG de superficie y realice un registro continuo de ECG durante todo el procedimiento (Figura 1B) utilizando un programa de adquisición comercial o desarrollado localmente¹⁰.
6. Para la estimulación eléctrica, use un catéter cuadripolar de 5-6 F conectado a un marcapasos cardíaco basado en microcontrolador¹⁰.
7. Una vez que el animal esté anestesiado, inserte el catéter a través de la cavidad oral, en el esófago. Mida la distancia entre los incisivos superiores y el corazón (evaluada por palpación) para aproximarse a la profundidad a la que se debe insertar el catéter en el esófago.
   PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no forzar el catéter, ya que existe el riesgo de perforación esofágica.
8. Confirme la posición correcta del catéter de estimulación a nivel de las aurículas de la siguiente manera.
   1. Aplicar estimulación eléctrica a una frecuencia de 400 estímulos/minuto (duración del estímulo 6 ms).
   2. Compruebe si el trazado del ECG muestra una captura constante de las aurículas (es decir, cada estímulo eléctrico es seguido por un complejo QRS estrecho) (Figura 2).
9. Determinar el umbral diastólico, es decir, el voltaje más bajo requerido para obtener la captura auricular (generalmente, entre 10 V y 20 V).
   NOTA: Realice lo siguiente para los animales del grupo STIM.
10. Una vez determinada la posición correcta del catéter, ajustar el estimulador a una frecuencia de 4.000 estímulos/minuto (duración del estímulo 6 ms), a una tensión 3 V por encima del umbral diastólico (Figura 3).
11. Aplicar a cada animal 15 ciclos sucesivos de estimulación, 20 s cada uno, con un intervalo libre de 5 min entre ciclos¹¹. Dependiendo de los objetivos del estudio, repita el protocolo para cada rata durante 10 días, a razón de 5 días / semana, a la misma hora en cada día.
12. Compruebe la eficacia de la estimulación de la siguiente manera.
    1. Identifique el tiempo de recuperación del nódulo sinusal (SNRT), que aparece al final de la estimulación rápida como un intervalo de tiempo que es más largo que la duración del ciclo registrada durante el ritmo sinusal (Figura 4A) y representa el intervalo de tiempo requerido para la reanudación del ritmo sinusal después de que finaliza la supresión de sobremarcha.
       NOTA: La supresión de sobremarcha representa la inhibición de la actividad del nódulo sinusal mediante la estimulación eléctrica del corazón a una velocidad superior al ritmo intrínseco.
    2. Identificar la ocurrencia del episodio de FA, que se define aquí como la presencia de tres o más latidos supraventriculares irregulares consecutivos (es decir, respuesta ventricular irregular con complejos QRS estrechos), con ondas P ausentes o reemplazadas por ondas "f" pequeñas y distorsionadas (Figura 4B).
13. Si el episodio de FA no termina espontáneamente en el momento en que se debe realizar el siguiente ciclo de estimulación (es decir, al final de los cinco minutos libres entre ciclos), no aplique la siguiente estimulación.
    1. Espere otros 5 minutos. Si el episodio de FA aún continúa después de esos 10 minutos, finalice el protocolo para ese día.
       NOTA: Si se desea evaluar la gravedad de la FA inducida eléctricamente, se puede realizar un monitoreo de ECG más largo.
14. Si se produce bradicardia o asistolia grave al final de la estimulación (es decir, debido a la estimulación eléctrica del nervio vago), finalice el protocolo. Si la actividad eléctrica no vuelve a la normalidad rápidamente, realizar un masaje cardíaco externo y administrar sulfato de atropina (0,05 mg/kg) por vía intraperitoneal.
15. Al final del procedimiento, invierta la anestesia con atipamezol (1 mg/kg) administrado por vía intraperitoneal. Alojar a las ratas individualmente en jaulas limpias con calor suplementario y observar periódicamente hasta que se recuperen por completo. No se requiere ningún otro cuidado específico de los animales al final del protocolo.
16. Analice los trazados de ECG de superficie y determine lo siguiente.
    1. La inducibilidad de la FA que se expresa en porcentaje (es decir, [número de ciclos de estimulación seguidos de episodios de FA / número total de ciclos de estimulación aplicados] x 100).
    2. La duración de cada episodio de AF.
    3. La presencia de episodios de FA "persistentes" (es decir, >10 min).
       NOTA: Realice lo siguiente para los animales del grupo SHAM.
17. Para las ratas en el grupo SHAM, siga los pasos 1.1 a 1.7 como se describió anteriormente, sin aplicar ninguna estimulación eléctrica.
18. Mantenga el catéter en su posición durante 80 minutos (es decir, el tiempo necesario para completar el protocolo en ratas STIM) sin aplicar ninguna estimulación eléctrica, mientras registra continuamente el ECG de superficie.
19. Al final del procedimiento, invierta la anestesia con atipamezol (1 mg/kg). No se requiere ningún otro cuidado específico de los animales al final del protocolo.
20. Analice los trazados de ECG de superficie y determine los parámetros descritos en el paso 1.16.

Resultados

En un estudio de prueba de concepto, 22 ratas Wistar macho adultas (200-400 g) fueron asignadas al azar en dos grupos: STIM (n = 15) y SHAM (n = 7). Todos los animales fueron alojados individualmente en jaulas de policarbonato, en una habitación climatizada (21-22 °C), teniendo libre acceso a agua y alimentos secos durante todo el estudio. El protocolo de estimulación transesofágica descrito anteriormente se aplicó a todos los animales durante 10 días, 5 días a la semana. Todos los animales se sometieron al mismo protoco...

Discusión

El presente artículo describe un protocolo experimental de estimulación de estallido auricular transesofágico a largo plazo para la inducción rápida y eficiente de la FA en ratas, adecuado para estudios de FA aguda y a largo plazo. El protocolo de estimulación de 10 días descrito en este documento se ha utilizado con éxito para desarrollar un "modelo de FA espontánea secundaria" (es decir, un modelo en el que, después de un período de inducción de FA por estimulación eléctrica, af se desarrolla espontáneamente)

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Antisedán (Clorhidrato de Atipamezol) 5 mg / mL, solución inyectable	Orion Corporation	06043/4004	para ratas uso 1 mg / kg
Dormitor (clorhidrato de medetomidina) 1 mg / mL, solución inyectable	Orion Corporation	06043/4003	para ratas uso 0,5 mg / kg
E-Z Anestesia Sistema Único Animal	E-Z Systems Inc	EZ-SA800	Permite la manipulación de un animal a la vez
Isoflurano 99,9%, 100 mL	Rompharm Company	N01AB06
Ketamina 10%, 25 mL			para uso en ratas 75 mg / kg
Marcapasos cardíaco basado en microcontrolador para animales			Desarrollado en nuestro laboratorio (Ver Referencia número 10 en el manuscrito)
Sistema de registro			Desarrollado en nuestro laboratorio (Ver Referencia número 10 en el manuscrito)

pequeños de ECG de superficie