השתלה של מיקרוגליה שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם במוח עכברים מדוכאי חיסון דרך נתיב טרנסנסאלי לא פולשני

Summary

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר השתלה של מיקרוגליה אנושית (iPSMG) שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במוח דרך מסלול טרנסנסאלי בעכברים מדוכאי חיסון. השיטה להכנת והשתלת טרנסנסאל של תאים וניהול תערובת ציטוקינים לשמירה על iPSMG מוצגת.

Abstract

מיקרוגליה הם האוכלוסייה המיוחדת של תאים דמויי מקרופאגים במוח. הם ממלאים תפקידים חיוניים הן בתפקודי המוח הפיזיולוגיים והן בתפקודי המוח הפתולוגיים. רוב ההבנה הנוכחית שלנו לגבי מיקרוגליה מבוססת על ניסויים שבוצעו בעכבר. המיקרוגליה האנושית נבדלת מהמיקרוגליה של העכבר, ולכן התגובה והמאפיינים של מיקרוגליה של עכברים לא תמיד מייצגים את זו של המיקרוגליה האנושית. יתר על כן, בשל קשיים אתיים וטכניים, המחקר על מיקרוגליה אנושית מוגבל למערכת תרביות במבחנה , שאינה נכנעת למאפיינים in vivo של מיקרוגליה. כדי להתגבר על בעיות אלה, פותחה שיטה פשוטה להשתלה לא פולשנית של מיקרוגליה אנושית שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSMG) במוח העכברים החיסוניים באמצעות מסלול טרנסנסאלי בשילוב עם דלדול פרמקולוגי של מיקרוגליה אנדוגנית באמצעות אנטגוניסט קולטן גורם 1 (CSF1R) המעורר מושבה. פרוטוקול זה מספק דרך להשתלה לא פולשנית של תאים במוח העכבר ולכן עשוי להיות בעל ערך להערכת תפקידה של המיקרוגליה האנושית בתפקודי המוח הפיזיולוגיים והפתולוגיים.

Introduction

מיקרוגליה הם אוכלוסייה מיוחדת של תאים דמויי מקרופאגים במערכת העצבים המרכזית (CNS) וממלאים תפקידים חיוניים בשליטה על תפקודי מוח שונים כמו התפתחות מעגלים עצביים, ויסות העברה עצבית ושמירה על הומאוסטזיס במוח ^1,2,3. אף על פי שמורין מיקרוגליה חולקים פונקציות רבות עם אלה מבני אדם, הם מראים הבדלים ספציפיים למין. לפיכך, התגובה של מיקרוגליה של עכבר לגירויים שונים לא תמיד מייצגת את זו של המיקרוגליה האנושית ^4,5,6. למרות שמחקרים רבים ניתחו מיקרוגליה אנושית, ניסויים אלה מוגבלים למחקרים במבחנה. מיקרוגליה אנושית מתורבתת במבחנה מראה תכונות מורפולוגיות וביטוי גנים שונים מאוד מאלה של in vivo. לפיכך, ניסויים במבחנה לא תמיד יכולים להיכנע למאפיינים in vivo של מיקרוגליה אנושית. לכן, יש צורך במערכת ניסיונית לחקר המיקרוגליה האנושית in vivo.

לאחרונה, כדי לחקור את המאפיינים in vivo של מיקרוגליה אנושית, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שנוצרו במבחנה (iPSCs) או מיקרוגליה אנושית שמקורה בתאי גזע עובריים מושתלים בניתוח במוח עכברים 7,8,9,10,11,12,13,14. באמצעות גישה זו, תכונות in vivo שונות של מיקרוגליה אנושית אופיינו. עם זאת, השימוש הנרחב בשיטה זו מוגבל משתי סיבות. הראשונה היא הדרישה של עכברים הסובלים ממחסור במערכת החיסון. לפיכך, כדי לחקור את תפקידה של המיקרוגליה האנושית במחלות נוירודגנרטיביות שונות, יש לחצות עכברים נושאי מוטציות במחלות לעכברים הסובלים ממחסור במערכת החיסון, מה שדורש זמן ומאמץ משמעותיים. יתר על כן, בהפרעות נוירולוגיות שונות, תאי חיסון היקפיים, כמו תאי T, יכולים לווסת תפקודים מיקרוגליאליים 15,16,17. לכן, ניסויים שבוצעו בעכברים הסובלים ממחסור במערכת החיסון עשויים שלא לייצג מאפיינים בתום לב של מיקרוגליה אנושית in vivo. שנית, ניתוחים פולשניים להשתלת מיקרוגליה דורשים ציוד והכשרה נוספים. יתר על כן, פגיעה מוחית במהלך השתלה פולשנית עשויה לשנות פנוטיפים מיקרוגליאליים.

בפרוטוקול זה מתוארת השתלה טרנסנזלית לא פולשנית (Tsn) של iPSMG לעכברים מסוג בר חסרי יכולת חיסונית¹⁸. בשילוב פרמקולוגי ON/OFF של אנטגוניסט CSF1R PLX5622 המדלדל את המיקרוגליה¹⁹ וה-Tsn של עכברים אנדוגניים, iPSMG יכול להיות מושתל באופן לא פולשני במוח העכבר. יתר על כן, עם היישום של ציטוקינים אנושיים אקסוגניים, ה- iPSMG המושתל נשאר בר קיימא במשך 60 יום באופן ספציפי לאזור ללא כל מדכאי חיסון.

Protocol

כל בעלי החיים ששימשו במחקר זה הושגו, שוכנו, טופלו ונעשה בהם שימוש בהתאם ל"עקרונות המנחים בטיפול ובשימוש בבעלי חיים בתחום המדעים הפיזיולוגיים" שפורסמו על ידי האגודה הפיזיולוגית של יפן²⁰, ובאישור הקודם של הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת יאמאנאשי (יאמאנאשי, יפן).

1. הכנת מדיום תאים, מדיום השתלה ותערובת הרדמה

1. הכינו את מדיום התא על ידי הוספת 10% סרום בקר עוברי ו-0.1% פניצילין/סטרפטומיצין ב-DMEM.
2. הכן את מדיום ההשתלה על ידי הוספת hCSF1 (250 ng/mL) ו- hTGF-β1 (100 ng/mL) למדיום התא.
3. הכינו את תערובת ההרדמה להזרקה תוך-צפקית על ידי ערבוב של 0.45 מ"ל של מדטומידין הידרוכלוריד, 1.2 מ"ל של מידזולם ו-1.5 מ"ל של טרטרט בוטורפאנול ב-11.8 מ"ל של מי מלח רגילים.

2. הכנת iPSMG

הערה: iPSMG קפוא (טבלת חומרים) נשמרו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

1. להפשיר את התאים הקפואים במהירות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. סובבו את הדגימות עד שכל הקרח הנראה נמס.
2. הוסיפו את ה-iPSMG המופשר למדיה התרבותית שחוממה ל-37 מעלות צלזיוס. הוסיפו 1 מ"ל של תאים מופשרים המכילים מדיום (1 × 10⁶ תאים) ל-10 מ"ל של מדיית התרבית.
3. צנטריפוגה של התאים ב 300 x g במשך 5 דקות כדי לקבל גלולת תא.
4. לאחר צנטריפוגה, הסר את כל הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדור התא. הסרה מלאה של סופרנטנט רצויה כדי להפחית את דילול ריכוז הציטוקינים במדיום ההשתלה.
5. הוסף את מדיום ההשתלה כדי לקבל ריכוז תאים של 1 x 10⁵ תאים / μL.
6. מניחים את ה-iPSMG על הקרח ומיד ממשיכים להשתלה.
   הערה: הכנת iPSMG להשתלה מתבצעת על ספסל נקי כדי למנוע זיהום.

3. הכנת עכבר להשתלת טרנסנסאל (Tsn)

1. האכילו את העכברים הזכרים מסוג בר (C57BL/6J, בני 8 שבועות) עם PLX5622 המכיל תזונה למשך 7 ימים.
2. בסוף היום השביעי, להפסיק את^דיאטת PLX ולהאכיל את העכברים בתזונה רגילה עד סוף המחקר.
   הערה: PLX5622 המכילה דיאטה מוכנה על ידי הוספת 1.2 גרם של PLX5622 ב 1 ק"ג של AIN-93G (טבלת חומרים).

4. השתלה טרנסנסאלית של תאים

1. 24 שעות לאחר הפסקת ההזנה של PLX, שוקלים את העכברים ומרדימים אותם באמצעות הזרקה תוך-צפקית של תערובת ההרדמה (0.2 מ"ל/20 גרם).
2. לאחר שהעכברים מורדמים לחלוטין כפי שהוערך על ידי חוסר תגובה לרפלקס הגמילה מהדוושה (צביטה חזקה בבוהן), תנו 2.5 μL של היאלורונידאז ב-PBS (100 U/mL) בשעה אחת לפני Tsn של iPSMG לכל נחיר פעמיים באמצעות קצה פיפטה של 10 μL כדי להגביר את החדירות של רירית האף.
3. לאחר היישום של hyaluronidase, למקם את העכברים במצב שכיבה.
4. חזור על שלב 4.2 10 דקות לפני השתלת טרנסנסאל של iPSMG.
5. יש למרוח 2.5 μL של תרחיף התא על נחיר אחד של העכבר באמצעות קצה פיפטה של 10 μL.
6. מניחים את העכבר במצב שכיבה למשך 5 דקות לפני מתן השעיית התא לנחיר השני.
7. חזור על שלבים 4.5 ו- 4.6 ארבע פעמים, תוך החלת נפח כולל של 20 μL לכל חיה.
8. מניחים את העכבר במצב שכיבה על משטח חום של 37 מעלות צלזיוס עד להתאוששות מהרדמה.
9. בשעה 48 שעות לאחר הפסקת האכלת PLX, חזור שוב על שלבים 4.1-4.7 על אותם עכברים.
   הערה: יש לציין כי iPSMG ממוקמים על קרח במהלך ההשתלה.

5. יישום ציטוקינים

1. מרדימים את העכברים על ידי הזרקה תוך-צפקית של תערובת הרדמה (0.2 מ"ל/20 גרם).
2. יש למרוח 2.5 μL של מדיום ההשתלה על נחיר אחד של העכבר באמצעות קצה פיפטה של 10 μL.
3. מניחים את העכבר בתנוחת השכיבה למשך 5 דקות לפני מתן מדיום ההשתלה לנחיר השני.
4. חזור על שלבים 5.2 ו- 5.3 ארבע פעמים, תוך החלת נפח כולל של 20 μL לכל חיה.
   הערה: יש לציין כי מתן טרנסנסאלי של מדיום השתלה (ציטוקינים אנושיים) נדרש כל 12 שעות עבור הכדאיות של iPSMG מושתל עד סוף המחקר.

Representative Results

טכניקה זו מאפשרת לחוקר להשתיל באופן לא פולשני iPSMG לתוך ההיפוקמפוס והמוח הקטן אך לא לתוך קליפת המוח של העכבר. לאחר השלמת המחקר, עכברים מורדמים היו נתונים לזלוף טרנסקרדיאלי של PBS קר כקרח(−), ואחריו קר כקרח 4% (w/v) paraformaldehyde ב- PBS. המוחות היו מבודדים, הוכנסו למשך הלילה ב-4% (w/v) פרפורמלדהיד, והוקפו בהקפאה ב-PBS שהכיל 30% (w/v) סוכרוז. יתר על כן, המוחות הוקפאו בתרכובת הטבעה ונחתכו (מקטעים קורונליים בעובי 20 מיקרומטר) על קריוסטאט. החלקים נשטפו שלוש פעמים ב-PBS(−) (10 דקות כל אחד) ונחדרו ונחסמו עם 0.5% (v/v) Triton X-100 בסרום עיזים רגיל של 10% למשך שעה אחת. לאחר מכן הודגמו המקטעים עם סמן ציטופלסמה אנטי-אנושי ספציפי, STEM121 (1:100) ואנטי Iba1 (1:1000) במשך 5 ימים. לאחר מכן, החלקים נשטפו שלוש פעמים עם PBS(−) במשך 10 דקות כל אחד והודגמו עם נוגדנים משניים: Alexa Fluor 488-, או עכבר מצומד 546, או IgGs ארנב (1:1000) במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפה עם PBS(-) שלוש פעמים, חלקים הותקנו על מגלשות באמצעות אמצעי הרכבה אנטיפידה. מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בעדשה אובייקטיבית פי 40 שימש לרכישת תמונות פלואורסצנטיות. הכדאיות של iPSMG לאחר חודשיים לאחר ההשתלה בהיפוקמפוס ובקורטקס נראית באיור 1. ניתן לקבוע את מספר התאים המושתלים על ידי ספירת תאים שהם חיוביים הן לנוגדנים ספציפיים לבני אדם והן לסמנים פאן-מיקרוגליאליים/מונוציטים, בעוד שמיקרוגליה של עכברים אנדוגניים חיובית לסמן פאן-מיקרוגליאלי/מונוציטים רק כפי שתואר קודם לכן¹⁸. ה-iPSMGs המושתלים מחליפים את המיקרוגליה של העכברים, מראים מורפולוגיות משתוללות בהיפוקמפוס, ואינן מזוהות בקליפת המוח¹⁸.

איור 1: הכדאיות של iPSMG בקליפת המוח ובהיפוקמפוס במשך חודשיים לאחר Tsn. הפאנל השמאלי מראה חיסון עם סמן פאן-מיקרוגליאלי/מונוציטים, Iba1 (ירוק). הפאנל האמצעי מראה חיסון עם סמן ציטופלסמה ספציפי לאדם STEM121 (אדום). הפאנל הימני מציג תמונה ממוזגת של Iba1 ו- STEM121 immunostaining. (A) בעכברי בקרה זוהו רק מיקרוגליה של עכברים (Iba1+/STEM121-) הן בקליפת המוח והן בהיפוקמפוס. (B) בעכברים שהושתלו ב-iPSMG, בקליפת המוח זוהו רק מיקרוגליה של עכברים (Iba1⁺/STEM121^-), ואילו בהיפוקמפוס iPSMG (Iba1⁺/STEM121⁺) זוהו. החצים בתמונה מראים מיקרוגליה של עכבר, ואילו ראשי החצים מראים iPSMG. מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בעדשה אובייקטיבית פי 40 שימש לרכישת תמונה פלואורסצנטית. גודל תמונה מרבי: 1024 x 1024 פיקסלים. גורם זום: 2. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

הפרוטוקול כאן מתאר את ההשתלה הלא פולשנית של iPSMG במוח העכבר. הייחודיות של הפרוטוקול הנוכחי היא שעל ידי שילוב שיטות PLX ON/OFF פרמקולוגיות והשתלות תוך-ורידיות, iPSMG יכול להיות מושתל באופן לא פולשני במוח העכבר הדימונו-תחרותי. iPSMG מושתל יצר את רוב המיקרוגליה בהיפוקמפוס ובמוח הקטן על ידי כיבוש הנישה הפנויה עד 60 יום אך לא בקליפת המוח.

הנקודות הקריטיות ל-Tsn היעיל של iPSMG הן (i) יעילות דלדול של מיקרוגליה של עכברים אנדוגניים (ii) מתן ציטוקינים אנושיים כל 12 שעות. מיקרוגליה שומרים על הטריטוריה שלהם במוח. דלדול יעיל של מיקרוגליה של עכבר נדרש כדי לספק נישה עבור השתלה של iPSMG מושתל. כאשר דלדול של מיקרוגליה של עכבר אנדוגני אינו מספיק, התיישבות של היפוקמפוס העכבר ומוח הקטן על ידי iPSMG אינם נצפים. הכדאיות של מיקרוגליה תלויה באיתות CSF1R ו- TGFBR 19,21,22. hCSF1 מדווח כי הוא מגדיל באופן סלקטיבי את הכדאיות של מיקרוגליה אנושית, ו- hTGF-β1 נדרש עבור הכדאיות של מיקרוגליה, כמו גם משכך את הדלקת כאשר הוא ניתן כל 12 שעות 21,23,24. בהיעדר ציטוקינים אנושיים אקסוגניים, iPSMG אינם נצפים במוח העכבר. יתר על כן, יש להקפיד שלא להפעיל באופן מכני את iPSMG על ידי צנרת מוגזמת או בכל אמצעי אחר לפני Tsn, שכן הוא משנה באופן בלתי הפיך את מאפייני iPSMG כמו גם את יעילות ההשתלה. אם Tsn משביע רצון של iPSMG אינו נראה, יש לקבוע את הכדאיות של iPSMG לפני ההשתלה, כמו גם את דלדול המיקרוגליה האנדוגנית. אם דלדול של microglia עכבר אנדוגני אינו יותר מ 90%, זמן ההזנה PLX5622 עשוי להשתנות כדי להגביר את דלדול.

בהשוואה לשיטת השתלה כירורגית קונבנציונלית שהיא פולשנית ודורשת ציוד והכשרה נוספים, Tsn מאפשרת השתלה בצורה לא פולשנית, פשוטה, יציבה וקלה. בנוסף, שיטה זו מאפשרת השתלה של iPSMG במוחות של עכברים מדוכאי חיסון; לפיכך, ניתן להשתמש בעכברי מודל מחלה חיסונית כדי לחקור את התגובה של iPSMG.

החיסרון הגדול ביותר של השיטה הנוכחית הוא ההטרוגניות האזורית בהשרפת iPSMG. אם נדרשת השתלת iPSMG ספציפית לאזור המוח, הפרוטוקול הנוכחי אינו מתאים מכיוון שה-iPSMG המושתל נשאר חרוט במשך 60 יום רק בהיפוקמפוס ובמוח הקטן אך לא בקליפת המוח הקטן, אך לא בקליפת המוח הקטן. יתר על כן, הצורך לנהל ציטוקינים אנושיים אקסוגניים באופן תוך-ורידי כל 12 שעות הוא גם מגבלה של הפרוטוקול הנוכחי מכיוון שהוא דורש עבודה נרחבת ויקר.

לסיכום, פרוטוקול מפורט עבור Tsn של iPSMG לתוך המוחות של עכברים immunocompetent מסופק. בשילוב עם ON/OFF פרמקולוגי של מיקרוגליה של עכבר על ידי PLX5622, פרוטוקול זה מאפשר השתלה מוצלחת של iPSMG. מכיוון שניתן לראות תאים מושתלים בהיפוקמפוס ובמוח הקטן במשך פרק זמן ממושך שבו מיושמים ציטוקינים אקסוגניים, השיטה הנוכחית עשויה להיות בעלת ערך להערכת תפקיד המיקרוגליה האנושית במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים באזורים אלה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	10566
AIN 93G	Oriental Yeast Co
Anti-Iba1 antibody	FUJIFILM	019–19741
Anti-STEM121 antibody	Takara Bioscience	Y40410
Butorphanol tartrate	Kyoritsu Seiyaku	8019
Confocal microscope	Olympus	FV1200
Fetal bovine serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30070.03
Frozen iPSMG	Shionogi & Co., Ltd		Laboratory for Drug Discovery and Disease Research
Human colony stimulating factor 1 (hCSF1)	PeproTech	300-25
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H-3506
Medetomidine hydrochloride	Meiji Seika	VETLI5
Midazolam	Astellas	18005A2
Paraformaldehyde	Wako Pure Chemical Industries	162-16065
Penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Pipette	Eppendorf	3120000011
Pipette tip	Eppendorf	30076028
PLX5622	Amadis Chemical	A930097
Transforming growth factor-β1 (Tgf-b1)	PeproTech	100-21
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
VECTA SHIELD Hard Set Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1400-10	antifade mounting medium