En flammefri metode for sterilisering av C. elegans picks, spateler og skalpeller

Summary

Denne artikkelen beskriver en metode for sterilisering av ormplukk, spatler og skalpeller ved hjelp av en mikroforbrenningsovn i stedet for en åpen flamme.

Abstract

Caenorhabtidis elegans (C. elegans) er en optimal modellorganisme for forskning og utdanning ved primært bachelorinstitusjoner. Undergraduates kan raskt lære den sterile teknikken som kreves for å opprettholde C. elegans kulturer. Sterilisering av platinaplukk som brukes til å overføre ormer fra en tallerken til en annen, gjøres tradisjonelt ved å holde plukket i en flamme fra en Bunsen-brenner eller etanollykt. Bunsen-brennere krever imidlertid en gasskilde, og begge utstyrsdelene utgjør risikoen for utilsiktet brann forbundet med åpen flamme. Demonstrert her er en teknikk for sterilisering av ormvalg, spatler og skalpeller ved hjelp av en infrarød bakteriologisk sløyfe mikroforbrenningsovn. Dette utstyret krever bare en stikkontakt og minimerer potensielle brannfarer. Ved å senke risiko- og gasskravene er denne teknikken velegnet til forskning og undervisning i en bachelor setting.

Introduction

Modellorganismen C. elegans er velegnet for både forskning og utdanning ved primært lavere institusjoner (PUIer) på grunn av lave kostnader, enkel vedlikehold og anvendelsesområde 1,2,3,4. For å håndtere ormer - for eksempel for å flytte en orm fra en plate til en annen, kan eksperimentere bruke et ormplukk. En rekke valg kan gjøres eller kjøpes for bruk med C. elegans. Picks er vanligvis laget ved hjelp av en platina- eller platina/ iridiumspiss, montert i et glass-, metall- eller trehåndtak. Glasshåndtak kan gjøres internt ved å smelte en Pasteur pipette rundt en platinatråd til ledningen er sikker. Ytterligere informasjon om C. elegans husdyrhold, inkludert hvordan man vokser og vedlikeholder ormer og deres matkilder, finnes i WormBook⁵ og andre kilder ^6,7,8.

Når du arbeider med C. elegans, brukes aseptiske teknikker vanligvis for å forhindre forurensning med mikrober og sopp. Eksempler på aseptiske teknikker inkluderer sterilisering av instrumenter, autoklavering av reagenser og gjennomføring av arbeid i sterile felt. Ormplukkinger steriliseres vanligvis ved hjelp av åpen flamme⁹. I tillegg plukker sterilisering av ormen forbrenner ormer, og forhindrer dermed utilsiktet blanding av stammer når du arbeider med flere ormstammer. Typiske metoder for sterilisering av ormvalg innebærer åpen flamme fra enten en Bunsen-brenner, etanollykt eller standard lighter (tabell 1). Vi ble motivert til å søke tryggere alternativer til eksisterende metoder i laboratoriet da en bachelorstudent uvitende sølte etanol mens han fylte en etanollykt og ved et uhell startet en liten brann når han antente lykten. Dessverre er det rapportert mange ulykker ved hjelp av etanollykter 10,11,12. Heldigvis er alternative steriliseringsmetoder validert for bruk i mikrobiologi, og formålet med denne artikkelen er å demonstrere hvordan du bruker dette utstyret til å sterilisere instrumenter for bruk med C. elegans.

I mikrobiologiske laboratorier er aseptisk teknikk også kritisk. Serologiske løkker og ledninger laget av platina steriliseres enten ved hjelp av åpen flamme¹³ eller en mikroforbrenningsovn 14,15,16. Andre navn på mikroforbrenningsovner inkluderer mikrosterilisatorer eller bactoforbrenningsovner. Fordelene med mikroforbrenningsapparatet over tradisjonelle flammemetoder inkluderer redusert brannfare, eliminering av sprut av brente materialer og evne til å jobbe i en laminær strømningshette / biosikkerhetsskap 16,17,18. Faktisk anbefaler både American Society of Microbiology og Verdens helseorganisasjon å bruke mikroforbrenningsovner over bruk av en åpen flamme 17,19,20. Sammenlignet med Bunsen-brennere krever mikroforbrenningsovner heller ikke en gassledning, som noen laboratorier kanskje ikke har, eller kanskje ikke har plassert på hver benk for studenter å bruke. Inspirert av disse fordelene ble det utviklet en protokoll for å erstatte bruken av flamme med mikroforbrenningsovner for sterilisering av vanlige instrumenter som picks, spatulas og skalpeller i C. elegans-laboratoriet. Denne metoden kan være egnet for instruktører og forskere som ønsker å forbedre sikkerheten og/eller fleksibiliteten når de arbeider med C. elegans.

Protocol

1. Klargjør mikroforbrenningsovnen

1. Fest en sløyfeholdertilbehørsguide til mikroforbrenningsovnen ved å feste den på den ytre fatet.
2. Koble mikroforbrenningsovnen til en standard 120 V- eller 230 V stikkontakt etter behov.
   MERK: Dette kan gjøres på en benkeplate eller i en laminær strømningshette.
3. Vri mikroforbrenningsovnen til den høye innstillingen og la den varme opp i 10-20 minutter, avhengig av produsentens instruksjoner for å oppnå en optimal temperatur på 800-825 ^oC.
   MERK: Hvis forbrenningsovnen holdes på i mer enn 3 timer, kan den lavere temperaturinnstillingen (500 ^oC) brukes som standby-innstilling. I henhold til produsentens brukerhåndbøker forlenger dette utstyrets brukbare levetid.

2. Steriliser pick, spatel eller skalpell

1. Sett instrumentet inn i det sylindriske steriliseringsområdet uten å berøre sidene ved å skyve langs føringen²¹.
   MERK: Hvis du steriliserer en skalpell, er det viktig å unngå å berøre keramikkveggen med bladet. Skraping av keramikkveggen kan kompromittere varmeenhetens integritet.
2. Hold instrumentet i steriliseringsområdet i 5-7 s.
3. Fjern instrumentet uten å berøre sidene ved å skyve bakover langs føringen.
4. For valg, la instrumentet avkjøles i 3-5 s før du berører en orm for å unngå å brenne den.
   MERK: Skalpeller eller spateler som ikke har lov til å kjøle seg ned, vil synge agaren.
5. Etter å ha plukket ormer, sett inn plukket i kammeret igjen i 5-7 s for å brenne noen ormer på plukket.

3. Komparativ metode - sterilisering av instrumenter ved hjelp av en Bunsen brenner

1. Koble Bunsen-brenneren til gassledningen ved hjelp av gummirør. Sørg for å feste slangen godt og plasser brenneren vekk fra gjenstander over hodet.
2. Slå på gassen ved å dreie knappen på gassledningen.
3. Tenn brenneren med en spiss eller lighter.
4. Juster flammen ved hjelp av gassknappen og luftinntaket til en blå kjegle er synlig.
5. Hold plukkingen, slikkepotten eller skalpellen i flammen til den lyser rødt.
6. La instrumentet avkjøles i 3-5 sekunder før du berører en orm for å unngå å brenne det.
   MERK: Skalpeller eller spateler som ikke har lov til å kjøle seg ned, vil synge agaren.
7. Etter å ha plukket ormer, sett inn plukket i flammen for å brenne noen ormer på plukket.

4. Eksperimentere

1. Kultur OP50 Escherichia coli (E. coli) bakterier i Luria Broth²² over natten på en 37 ^oC shaker.
2. Etter nattkulturen fortynner du kulturen i sterilt vann i forholdet 1:100.
   MERK: Denne fortynningsfaktoren ble valgt for å sikre separasjon av kolonier etter plating.
3. Dypp et ormplukk sterilisert ved hjelp av en Bunsen-brenner i bakterieløsningen, steriliser på nytt med Bunsen-brenneren og virvle den i 100 ml sterilt vann.
4. Tallerken 100 μL vann på en 10 cm LB agar^22,23 Petri parabolen, spre vannet ved hjelp av en steril celle spreder, og inkuber ved romtemperatur i 24 timer med lokket på.
5. Utfør trinn 4.3-4.4 ved hjelp av en ormplukk sterilisert ved hjelp av en mikroforbrenningsovn.
6. Som en positiv kontroll, utfør trinn 4.3-4.4 uten re-sterilisering.
7. Som en negativ kontroll, utfør trinn 4.3-4.4 ved hjelp av sterilt vann i stedet for bakterieløsningen.
8. Tell koloniene manuelt etter inkubasjonsperioden.

Representative Results

Et enkelt eksperiment (avsnitt 4) ble utviklet for å demonstrere de relative kontamineringsratene ved hjelp av en mikroforbrenningsovn kontra en flamme (figur 1, tabell 2). Selv om disse resultatene representerer forurensningsrater på tvers av metoder, ville det ikke være nødvendig å gjenta denne metoden for å bruke mikroforbrenningsteknikken. Eksperimentet ble kjørt i triplikat. Negativ kontroll var sterilt vann uten bakterier. Den positive kontrollen brukte verken steriliseringsteknikk: plukket ble dyppet i den fortynnede OP50-kulturen og deretter overført direkte til det sterile vannet. Alle replikeringer og betingelser ble kjørt parallelt samme dag. I alle de tre negative kontrollplatene ble det talt null kolonier. En gjennomsnittlig telling på 4,7 (± 0,3 SEM) kolonier ble oppnådd da Bunsen-brenneren ble brukt til å sterilisere picks. Et gjennomsnittlig antall på 3,3 (±1,2 SEM) kolonier ble observert i mikroforbrenningstilstanden. Imidlertid ble det oppnådd et gjennomsnittlig antall på 298,3 (±17,9 SEM) kolonier i positiv kontrolltilstand. En 2-tailed t-test forutsatt lik varians som sammenlignet Bunsen-brenneren med mikroforbrenningsovn ga ingen statistisk signifikant forskjell, p = 0,35. Dermed oppnådde mikroforbrenningsovnen sterilitetsresultater like effektive for Bunsen-brenneren.

Figur 1: Bakteriell telling på tvers av steriliseringsmetoder. Picks ble dyppet i 1:100 OP50 kultur i sterilt vann og deretter sterilisert ved hjelp av en Bunsen brenner eller mikro-forbrenningsovn. Picks ble deretter dyppet i sterilt vann, belagt på LB agar ^22,23, og inkubert i 24 timer ved romtemperatur, og kolonier ble telt manuelt. Positiv kontroll hadde ingen sterilisering, og negativ kontroll brukte sterilt vann uten bakterier. n = 3 replikerer per betingelse. Merk: y-aksen er brutt for å tillate separasjon av datapunkter i relevante deler av grafen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Steriliseringsmetode	Kostnad	Krav til laboratorier	Fordeler		Ulemper
Mikroforbrenningsovn	$365–530	120 V- eller 230 V-uttak	• Bærbar • Ingen åpen flamme eller eksponert varmeelement • Kan brukes i laminære strømningshetter og biologiske sikkerhetsskap		• Oppvarmingstid • Høyere kostnader
Bunsen brenner	$24–169	Gassledning	• Raskt oppsett • Lav pris		• Åpen flamme • Anbefales ikke til bruk i laminær strømningshette eller biologisk sikkerhetsskap
Etanol lampe	$11	Ingen	• Raskt oppsett • Lav pris • Påfyllbar		• Åpen flamme • Sikkerhetsrisiko ved påfylling • Anbefales ikke til bruk i laminær strømningshette eller biologisk sikkerhetsskap • Ikke tillatt ved enkelte institusjoner
Lekter	$5–8	Ingen	• Lav pris • Tilgjengelig • Engangsbruk • Påfyllbar		• Åpen flamme • Håndoperert • Anbefales ikke til bruk i laminær strømningshette eller biologisk sikkerhetsskap

Tabell 1: Sammenligning av metoder for sterilisering av instrumenter. Fire metoder for sterilisering av instrumenter ble sammenlignet basert på fordeler, ulemper, kostnader og laboratoriekrav.

Replikere	Betingelse
	Mikroforbrenningsovn	Bunsen brenner	Negativ kontroll	Positve-kontroll
1	1	5	0	278
2	4	4	0	334
3	5	5	0	283
Bety	3.3	4.7	0.0	298.3
SEM	1.2	0.3	0.0	17.9

Tabell 2: Rådata for bakteriell telling på tvers av steriliseringsmetoder. Picks ble dyppet i 1:100 OP50 kultur i sterilt vann og deretter sterilisert ved hjelp av en Bunsen brenner eller mikro-forbrenningsovn. Picks ble deretter dyppet i sterilt vann, belagt på LB agar ^22,23, og inkubert i 24 timer ved romtemperatur, og kolonier ble telt manuelt. Positiv kontroll hadde ingen sterilisering, og negativ kontroll brukte sterilt vann uten bakterier. n = 3 replikerer per betingelse. Middelverdi og SEM rapportert under individuelle tellinger.

Discussion

C. elegans er en modellorganisme som er godt egnet for øvelser i undervisningslaboratorier. Bruk av mikroforbrenningsovner i stedet for åpne flammer gir fordeler i både forskningslaboratorier og klasseromslaboratorier. Faktisk kan bachelor laboratoriekurs utgjøre en høyere risiko for utilsiktede branner gitt antall nyutdannede forskere i rommet. I tillegg øker risikoen for brann når etanol brukes til å sterilisere instrumenter nær flammekilden, da etanoldamp er antennelig. Bærbarheten gir også en fordel for klasserom der gassledninger ikke er installert på hver benk. Denne metoden har vært benyttet i undervisnings- og forskningslaboratorier ved vår institusjon, noe som ikke har resultert i noen økning i forurensning og null laboratoriesikkerhetsulykker siden innlemmelsen i 2016.

For å sikre kompatibilitet med mikroforbrenningsovner ble en rekke valg med forskjellige monteringer, trådsammensetninger og trådmålere testet. Trådsammensetning inkluderte 100% platina samt 90% platina / 10% iridium med en trådtykkelse på 30-32 G, og uavhengig av tykkelse og sammensetning kompromitterte oppvarmingsmetoden ikke trådintegritet. Monteringene inkluderte to forskjellige typer kommersielt tilgjengelige pick-håndtak og egenlagde glassmonteringer fra Pasteur-pipetter. Vær oppmerksom på at valgene ikke lyser rødt som de gjør i flammen. Imidlertid oppnås tilstrekkelig sterilisering fortsatt så lenge sterilisatoren har nådd riktig temperatur. Dermed er det viktig å la mikroforbrenningsovnen varme opp i 10 eller 20 min, som angitt i produsentens instruksjoner. Å holde instrumentet i kammeret i minst 5 s for å oppnå sterilisering er også kritisk. Å forlate instrumentet i kammeret lenger enn 7 s vil ikke forårsake skade på instrumentet, men er unødvendig. Selv om dette er en relativt grei prosedyre med minimale trinn og sannsynligvis ikke trenger feilsøking, kan det ta litt øvelse å lære å stabilisere instrumentet i fatet uten å berøre sidene.

For å erstatte en åpen flamme må en steriliseringsmetode dekke alle bruksområdene som brukes i et laboratorium. I tillegg til steriliseringsinstrumenter kan C. elegans laboratorier også bruke Bunsen-brennere til å lage et sterilt felt for å gjøre andre oppgaver som å helle plater eller inokulere kulturer¹³. Men om dette skaper et sterilt felt eller trekker inn fortsatt levedyktige forurensninger, forblir kontroversielt¹⁴. Selv om det ikke er et alternativ ved alle institusjoner, kan et biosikkerhetsskap eller laminær strømningshette brukes til disse formålene, slik at et laboratorium kan fungere uten bruk av åpne flammer. Bruksanvisninger for de fleste mikroforbrenningsovner anbefaler mot bruk for sterilisering av skalpellblader fordi skraping av de indre veggene skader sterilisatoren. Men hvis man forsiktig bruker en guide, kan man sterilisere et skalpellblad eller spatel uten å berøre de indre veggene. Dette utvider bruken av teknikken for å tillate chunking uten å bruke flamme og gjør det mulig for et C. elegans-laboratorium å fungere uten å bytte teknikker mellom sterilisering av forskjellige gjenstander.

Som beskrevet i tabell 1, tilbyr mikroforbrenningsovner økt sikkerhet, økt kompatibilitet med laminære strømningshetter og økt bærbarhett over flammebaserte metoder, men har begrensninger. De er dyrere enn de andre metodene og krever oppvarmingstid før steriliseringstemperaturer oppnås. Til slutt kan denne metoden som rutinemessig brukes i mange mikrobiologiske laboratorier, være anvendelig i noen C. elegans forsknings- og undervisningslaboratorier som søker å forbedre laboratoriesikkerheten uten å gå på kompromiss med steriliteten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
90% platinum 10% iridium wire	Tritech	PT-9010	Other sources and wire compositions may be used.
Agarose	Sigma Aldrich	A6013	LB agar ingredient
Bunsen burner	Fisher Scientific	50-110-1225	Other Bunsen burners may be used
Ethanol Lamp	Carolina	706604	Included here as a reference to Table 1
Lighter	Carolina	706636	Included here as a reference to Table 1
Loop holder accessory	Fisher	22-630-002	Referred to in the manuscript as "guide"
Micro-incinerator	Thomas Scientific	1154J15	There are many companies that sell similar equipment. Similar models also sold by Benchmark Scientific (B1001),  Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400), and BT Lab Systems (BT1702).
N2 worms	CGC	N2
NaCl	Sigma Aldrich	S5886	LB ingredient
OP50 E. coli	CGC	OP50
Petri dish	Fisher	08-772B
Pick handle	Tritech	TWPH1
Scalpel blade	Fisher	12-000-161
Scalpel handle	Fisher	12-000-164
Spatula	Fisher	14-374	Other spatulas will work
Sterile cell spreaders	VWR	76206-438	Other cell spreaders may be used as long as they are sterile
Tryptone	Sigma Aldrich	T7293	LB ingredient
Yeast Extract	Sigma Aldrich	Y1625	LB ingredient