Summary
Denne protokollen beskriver en iSCAT-basert bildebehandling og enkeltpartikkelsporingstilnærming som muliggjør samtidig undersøkelse av molekylmassen og den diffusive oppførselen til makromolekyler som samhandler med lipidmembraner. Trinnvise instruksjoner for prøveforberedelse, masse-til-kontrast-konvertering, filmanskaffelse og etterbehandling er gitt sammen med retninger for å forhindre potensielle fallgruver.
Abstract
Kortvarige eller forbigående interaksjoner mellom makromolekyler på og med lipidmembraner, et grensesnitt der en rekke essensielle biologiske reaksjoner finner sted, er iboende vanskelig å vurdere med standard biofysiske metoder. Innføringen av massesensitiv partikkelsporing (MSPT) utgjør et viktig skritt mot en grundig kvantitativ karakterisering av slike prosesser. Teknisk sett ble dette mulig gjennom fremkomsten av interferometrisk spredningsmikroskopi (iSCAT)-basert massefotometri (MP). Når bakgrunnsfjerningsstrategien er optimalisert for å avsløre den todimensjonale bevegelsen av membranrelaterte partikler, tillater denne teknikken sanntidsanalyse av både diffusjon og molekylær masse av umerkede makromolekyler på biologiske membraner. Her beskrives en detaljert protokoll for å utføre og analysere massesensitiv partikkelsporing av membranrelaterte systemer. Målinger utført på et kommersielt massefotometer oppnår tidsoppløsning i millisekundregimet og, avhengig av MP-systemet, en massedeteksjonsgrense ned til 50 kDa. For å vise frem potensialet til MSPT for grundig analyse av membrankatalysert makromolekyldynamikk generelt, presenteres resultater oppnådd for eksemplariske proteinsystemer som det opprinnelige membraninteragereriet annexin V.
Introduction
En gang bare oppfattet som en barriere mot det brede spekteret av omgivelses fysiske forhold, anses biologiske membraner i dag som funksjonelle enheter og katalytiske plattformer 1,2. Basert på deres evne til å lokalisere, forsterke og direkte signaler som svar på membranrelaterte makromolekylreaksjoner, utgjør lipidgrensesnitt et avgjørende element for et bredt spekter av cellulære prosesser som membranhandel og signalkaskade 3,4,5. Membrantilknytning fungerer som et kjerneanlegg for montering av stabile komplekser, og er ofte avhengig av en dynamisk likevekt mellom membranrelaterte og cytosoliske former for makromolekyler og er derfor av forbigående natur 6,7.
Til tross for deres store betydning i biologien, har det så langt vært utfordrende å utvikle metoder som kan gi tilgang til komposisjonelle, romlige og tidsmessige heterogeniteter av membranrelaterte makromolekylreaksjoner i sanntid 7,8. For å løse de underliggende molekylære prosessene er to eksperimentelle aspekter avgjørende: tilstrekkelig tidsoppløsning og enpartikkelfølsomhet. Derfor har ensemblegjennomsnittsteknikker som fluorescensgjenvinning etter fotobleaching (FRAP), men også den mye mer følsomme fluorescenskorrelasjonsspektroskopien (FCS) begrensninger, siden de i stor grad unouthil romlig informasjon fra temporal informasjon9. Et viktig skritt mot karakterisering av individuelle molekyldynamikker har dermed vært fremveksten av enkeltpartikkelsporing (SPT) i kombinasjon med svært sensitiv mikroskopi. Spesielt har to SPT-tilnærminger vist seg å være effektive i denne forbindelse. For det første banet bruken av fluoroforer som etiketter og de tilsvarende fluorescensdeteksjonssystemene veien for nanometerpresisjon og millisekunders tidsoppløsning 10,11,12. For det andre forbedret spredningsbasert deteksjon ved hjelp av gull nanopartikler både lokaliseringspresisjon og tidsoppløsning til under nanometer- og mikrosekundområdet, henholdsvis 13,14,15,16. Til tross for de mange fordelene med både tilnærminger og deres betydelige bidrag til den mekanistiske forståelsen av membranrelaterte systemer17,18, har begge teknikkene så langt vært begrenset: de krever merking av molekylene av interesse, som potensielt perturberer deres opprinnelige oppførsel og er ufølsomme for den molekylære sammensetningen av membranrelaterte partikler19,20.
Begge disse begrensningene har nylig blitt overvunnet ved innføringen av en ny interferometrisk spredning (iSCAT)-basert tilnærming kalt massefotometri (MP) 21,22,23. Denne teknikken gjør det mulig å bestemme massedistribusjoner av biomolekyler i henhold til iSCAT-kontrasten når de lander på et glassgrensesnitt. Men for deteksjon og karakterisering av mobile molekyler som diffuserer på lipidmembraner, måtte det utvikles en mer sofistikert bildeanalysetilnærming. Dette har i mellomtiden blitt implementert og gjør det mulig å oppdage, spore og bestemme den molekylære massen av enkle umerkede biomolekyler som sprer seg på et lipidgrensesnitt24,25. Denne teknikken kalles dynamisk massefotometri eller massesensitiv partikkelsporing (MSPT), og muliggjør nå vurdering av komplekse makromolekylelle interaksjoner ved direkte registrering av endringer i den molekylære massen av de sporede enhetene og åpner dermed for nye muligheter for mekanistisk analyse av membranrelatert molekylær dynamikk.
Her presenteres en detaljert protokoll for prøveforberedelse, avbildning og dataanalyseforløpet som kreves for MSPT. Spesielt diskuteres utvalgskrav og potensielle problemer som kan oppstå under måling og analyse. Videre vises det enestående potensialet til å analysere membraninteragerende makromolekylsystemer gjennom ulike representative resultater.
Protocol
1. Prøvepreparering
- Generering av multilamellar vesicles (MLVs)
- Beregn mengden kloroformoppløsede lipider i henhold til ønsket lipidblanding og nødvendig suspensjonsvolum.
MERK: En endelig vesiclekonsentrasjon på 4 mg/ml lipider anbefales for resuspension (reaksjon) bufferen. - Pipette det beregnede volumet av lipider i et 1,5 ml hetteglass med positive forskyvningspipetter utstyrt med glassspisser.
- Fordamp lipidløsningsmidlet under en svak strøm av nitrogen og roter hele tiden hetteglasset for å sikre lik fordeling av lipidene på glassveggene.
- Sørg for full fordampning av oppløsningsvæsken ved å plassere hetteglasset under en jevn strøm av nitrogen i 15 minutter.
- Fjern rester av kloroform ved å støvsuge i en vakuumdesiccator i en ekstra time.
- Rehydrer lipidblandingen i ønsket resuspensjonsbuffer (reaksjon) og virvel suspensjonen grundig til lipidfilmen er oppløst fra hetteglassets vegger.
MERK: Reaksjonsbufferen skal sikre proteinaktivitet og stabilitet. Reaksjonsbufferen som brukes i denne studien inneholder 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 150 mM KCl og 5 mM MgCl2. Vær oppmerksom på at enhver buffer som brukes til å fortynne lipider eller proteiner, må filtreres for å fjerne forstyrrende svevestøv (se trinn 5).
- Beregn mengden kloroformoppløsede lipider i henhold til ønsket lipidblanding og nødvendig suspensjonsvolum.
- Generering av små unilamellar vesicles (SUVer)
- For påfølgende fryse-tine sykluser av lipid resuspension (trinn 1.1.6), kok 500 ml vann i et beger på en varm plate (mellom 70 °C til 99 °C) og lag en beholder med flytende nitrogen.
- Støtfryse lipidrester i flytende nitrogen. Overfør hetteglasset til begeret med varmt vann til oppløsningen er helt tint. Gjenta denne fryse-tine syklusen 8-10 ganger eller til den tidligere uklare blandingen vises klar.
FORSIKTIG: Bruk riktige verneplagg og utstyr som vernebriller, hansker og pinsett for å forhindre direkte kontakt med flytende nitrogen, det frosne lipidflasken eller kokende vann. - For generering av en monodisperse vesicle-distribusjon, monter en lipidekstruder og test integriteten med reaksjonsbuffer for å sikre at den ikke lekker.
MERK: Hvis det blir observert lekkasje, må du forsiktig sette sammen lipidekstruderen på nytt til det ikke er tydelig buffersøl. - Ekstruder lipidfjæringen i 37 passerer gjennom en nukleoporemembran med en porestørrelse på 50 nm26. Antall passeringer bør være ujevnt for å sikre at den endelige SUV-blandingen krysset nukleoporemembranen og dermed er fri for lipidaggregater eller multilamellar vesicles. De ekstruderte vesiklene vil senere bli brukt til å danne støttede lipid-bilayere (se trinn 6 og 7).
MERK: SUV-er kan også dannes ved sonikering av den rehydrerte lipidblandingen. Imidlertid gir forberedelse via ekstrudering en mer monodisperse distribusjon av SUVer, noe som letter vesicle brudd under støttet lipid bilayer formasjon. Ekstruderte vesicles kan lagres i kjøleskapet i maksimalt 3 dager.
2. Rengjøring av mikroskop lysbilder
- Fordel et likt antall mikroskopskred (nr. #1,5; 0,17 mm tykkelse) med dimensjoner på 24 mm x 60 mm og 24 mm x 24 mm i polytetrafluoretylen (PTFE) mikroskopholdere.
- Overfør PTFE-holdere til beger som inneholder ultrarent vann og soniker dem i 15 minutter ved romtemperatur.
MERK: Avhengig av begeret må vannvolumet justeres for å dekke PTFE-holderen helt. - Bruk pinsett for å fjerne holderne fra begeret og erstatt vannet med ultraren isopropanol. Sett holderen inn i begeret som inneholder isopropanol og soniker igjen i 15 min.
MERK: Avhengig av begeret må isopropanolvolumet justeres for å dekke PTFE-holderen helt. - Bytt isopropanol med ultrarent vann og soniker begeret som inneholder holderne i 15 min.
- Fjern PTFE-holderne fra begeret og føn mikroskopet i holderen under en jevn strøm av nitrogengass eller trykkluft.
MERK: Sørg for riktig rengjøring av dekselsklier ved hjelp av hansker, rene beger og parafinfilm for å dekke hvert beger. Ellers kan reststøv forårsake betydelige bakgrunnssvingninger under MSPT-målinger.
3. Hydrofilisering av mikroskopskred
MERK: For å oppnå en homogen og væskestøttet lipidbilayer, er hydrofilisering av lysbilder viktig og må utføres like før strømningskammermontering.
- Plasser PTFE-holdere som bare inneholder 24 mm x 60 mm mikroskopsklier i en plasmarenser med oksygen som prosessgass og rengjør mikroskopet med plasma (parametere som brukes i dette arbeidet: 30% effekt, 0,3 mbar oksygentrykk i 30 s; se Tabell over materialer for detaljer om plasmarenseren som brukes).
MERK: For å oppnå væskemembraner må plasmarengjøringsparametere som strøm, oksygentrykk og rengjøringstid justeres for hvert instrument. Til dette formål anbefales bruk av fluorescerende merkede lipider for å sikre membranfluiditet, som kan kvantifiseres med fluorescensgjenvinning etter fotobleking (FRAP) eksperimenter27. Hvis parametrene ikke er optimalisert for det respektive oppsettet, kan membrandiffusjonen bli svekket på grunn av redusert membranfluiditet.
4. Montering av strømningskamre
- Før strømningskammermontering må du holde følgende komponenter klare: rensede mikroskopskred (24 mm x 24 mm), hydrofiliserte mikroskopskred (24 mm x 60 mm), aluminiumsfolie, flat papp, skalpell og dobbeltsidig tape.
- Pakk den flate papp med aluminiumsfolie.
- Spred de rensede 24 mm x 24 mm mikroskopskliene på aluminiumsfolien med tilstrekkelig avstand mellom hverandre.
- Fest tosidige båndstrimler til de øvre og nedre kantene på lysbildene.
- Excise hvert mikroskop glir med skalpellen, slik at den kan fjernes fra aluminiumsfolie. Resultatet er at hvert lysbilde skal ha striper med dobbeltsidig tape festet til øvre og nedre kant av lysbildet (se figur 1).
- Fest skyvet på 24 mm x 24 mm med de to dobbeltsidige båndstrimlene til det hydrofiliserte glidet på 24 mm x 60 mm for å danne en strømningsbane mellom de mindre og større mikroskoplysbildene.
MERK: For å sikre rene strømningskamre må du hele tiden bruke hansker og sørge for at arbeidsbenken er støvfri.
5. Filtrering av reaksjonsbuffere
- Sterilt filter alle reaksjonsbuffere gjennom 0,45 μm celluloseacetatmembraner for å sikre minimalt bakgrunnssignal under MSPT-målinger.
MERK: Hvis tilstedeværelsen av nukleotider, for eksempel ATP, er avgjørende for et vellykket eksperiment, må du være oppmerksom på en potensiell økning i bakgrunnssignalet. Det anbefales å bare bruke minimale mengder som fortsatt sikrer proteinaktivitet.
6. Støttet lipidbilayer (SLB) formasjon
MERK: Det anbefales å utføre dannelsen av støttede lipid-bilayers på massefotometeret for å visuelt sikre vellykket vesicle spredning og fullstendig fjerning av ufuferte vesikler.
- Fortynn nyekstruderte SUV-er (se trinn 1 for mer informasjon) til en endelig konsentrasjon på 0,4 mg/ml i den nødvendige reaksjonsbufferen. Eventuelt, for å fremme vesicle brudd, legge 2 mM CaCl2 til vesicle suspensjon.
MERK: Divalent-kasjoner kan føre til aggregering av noen lipider som PiP2. For blandinger som inneholder slike lipider, avstå fra å bruke CaCl2 for fremme av vesicle brudd eller andre divalente kasjoner i resuspension buffer. Om nødvendig for eksperimentet, kan divalente kasjoner legges til etter vellykket dannelse av den støttede lipidbilayeren. - Skyll 50 μL av vesiclefjæringen inn i strømningskammeret (trinn 4) og inkuber kammeret i 2 min.
MERK: Buffere, vesikler eller proteinløsninger kan skylles gjennom strømningskammeret med et lite stykke bløtleggingsvev. Det er imidlertid også mulig å bruke et mekanisk pumpesystem. - Fjern ufusterte vesikler gjennom gjentatt (minst tre ganger) vasking av strømningskammeret med 200 μL av reaksjonsbufferen hver gang.
MERK: Vesikles må vaskes grundig ut av strømningskammeret for å sikre et stabilt bakgrunnssignal under MSPT-målinger.
7. Generering av kalibreringskurve
MERK: For å konvertere kontrasten til oppdagede partikler til molekylær masse, må signalet kalibreres ved hjelp av proteiner av kjente størrelser. Det anbefales å justere standard proteinstørrelsesregime for å dekke spekteret av molekylære masser som forventes for interessesystemet.
- Biotinylering av standardproteiner med cysteinrester
- Beregn riktig mengde maleimid-biotin for standardproteinet i henhold til produsentens instruksjoner.
- Inkuber standardproteinet med det bestemte volumet av maleimid-biotin i 1 time ved romtemperatur.
- For å fjerne ukonjugert maleimid-biotin fra det konjugerte biotinproteinkomplekset, utfør størrelsesekskluderingskromatografi på en kolonne som passer for proteinet av interesse.
- Bestem proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en Bradford Assay.
MERK: For å lagre standardproteinet for ytterligere målinger, frys proteinet i engangs aliquots i flytende nitrogen og lagre dem ved -80 °C.
- Måling av standardproteiner for kalibreringskurven
- I et strømningskammer, lag en støttet lipidbilayer med 0,4 mg/ml ekstruderte SUVer (se trinn 1 og 6 for mer informasjon) som inneholder 0,01 mol% (v/v) Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamin-N-cap biotinyl).
- Tilsett 50 μL 2,5 nM divalent streptavidin til bilayeren i strømningskammeret og inkuber i 10 min.
MERK: Divalent streptavidin har blitt uttrykt og renset som skissert i Howarth et al.28. Tetravalent streptavidin kan også brukes. Imidlertid kan bruken av divalent streptavidin redusere mulige reaksjons stoichiometries mellom biotinylerte lipider og standardproteiner som konjugeres til en biotin moiety for å lette tildelingen av arter. - Fjern ubundet divalent streptavidin med 100 μL reaksjonsbuffer.
- Tilsett 50 μL 100 nM biotinkonjugert standardprotein til bilayeren i strømningskammeret og inkuber i 2 min.
MERK: Avhengig av biotinyleringseffektiviteten og om di- eller tetravalent streptavidin brukes, kan de optimale konsentrasjonene av biotinkonjugert standardprotein og streptavidin variere. - Utfør MSPT-måling i henhold til detaljene som er beskrevet i trinn 8.
FORSIKTIG: Bildeforholdene må være identiske for både prøve- og kalibreringsstandarder.
8. Bildebehandling
- SLB-dannelse og prøvepreparering
- Som beskrevet mer detaljert i trinn 6, introduser SUVer av ønsket lipidblanding (25 μL) til prøvestrømningskammeret og danner en støttet lipidbilayer. Vask kammeret (tre ganger) grundig med 100 μL reaksjonsbuffer for å fjerne alle ufusterte vesikler.
- Tilsett 50 μL av proteinet av interesse til prøvekammeret.
MERK: Siden MSPT er en enkeltpartikkelmetode, må proteinkonsentrasjonen holdes i pM til nM-området for å muliggjøre uforstyrret partikkeldeteksjon og sporing.
- Videoanskaffelse
- Angi ønskede bildeforhold, for eksempel størrelsen på synsfeltet (FOV), bildefrekvens, eksponeringstid og anskaffelsestid i anskaffelsesprogramvaren.
MERK: Følgende innstillinger har vist seg å fungere for MSPT på et kommersielt massefotometer (se Materialtabell): FOV på 128 piksler x 35 piksler, en bildefrekvens på 1 kHz som resulterer i omtrent 200 bilder per sekund etter påfølgende 5-ganger bildegjennomsnitt, og en eksponeringstid på 0,95 ms. - Juster fokus automatisk eller manuelt. Flytt om nødvendig FOV til en posisjon med en homogen membran ved hjelp av sidekontrollen.
- Opprett en prosjektmappe, og begynn å spille inn filmen. Når innspillingen er fullført, angir du et filnavn i dialogboksen som er bedt om av anskaffelsesprogramvaren. Filmen lagres deretter automatisk i prosjektmappen som en MP-fil for senere analyse.
MERK: Registrer minst tre repliker i forskjellige strømningskamre for å sikre integriteten til individuelle membraner og reproduserbarhet av resultater. Filmens varighet kan angis på forhånd og avhenger av typen eksperiment. I de fleste tilfeller anbefales en oppkjøpstid mellom 5 min og 7 min.
FORSIKTIG: Som standard komprimeres filmopptak på den kommersielle massefotometeroppkjøpsprogramvaren før de lagres for å redusere lagringsplassen. Filkomprimering må imidlertid deaktiveres for å aktivere egendefinert dataanalyse som beskrevet i denne protokollen. Du finner mer informasjon om hvordan du deaktiverer filkomprimering i produsentens brukerhåndbok.
- Angi ønskede bildeforhold, for eksempel størrelsen på synsfeltet (FOV), bildefrekvens, eksponeringstid og anskaffelsestid i anskaffelsesprogramvaren.
9. Dataanalyse
MERK: Dataanalysepipeline er ledsaget av to interaktive Jupyter bærbare datamaskiner (MSPT analysis.ipynb, Movie visualization.ipynb). Jupyter-notatbøkene og tilhørende spesialskrevne Python-moduler som er nødvendige for å utføre MSPT-analysen som er skissert nedenfor, er tilgjengelige i et offentlig depot: https://github.com/MSPT-toolkit/MSPT-toolkit. For detaljerte instruksjoner om analysen nedenfor, henvises leserne til MSPT analysis.ipynb som er tilgjengelig ved hjelp av lenken ovenfor.
- Videobehandling
- Fjern dominerende statisk spredning av lys med den pikselvise bakgrunnsestimeringsalgoritmen ved hjelp av image_processing.mp_reader-funksjonen .
- Hvis du vil bruke fjerningen av bakgrunnen, velger du alternativet continuous_median for parametermodus og angir en passende lengde for det glidende medianvinduet (window_length) i notatblokkinndelingen B.1. Du kan også lagre filmene etter fjerning av bakgrunnen som skal brukes til partikkeldeteksjon og banekobling (ved å sette parameteren save_processed_movies til Sann).
MERK: Juster vindusstørrelsen (window_length) til verdier mellom 101 og 2001 avhengig av partikkeltettheten på membranen, forventet diffusjonskoeffisient, oppkjøpsrammefrekvens og ønsket behandlingshastighet.
FORSIKTIG: Strategien for fjerning av bakgrunnen fungerer bra hvis membranen ikke er for tettpakket, og hvis spredningen av partiklene er tilstrekkelig rask (dvs. hver piksel er mesteparten av tiden ikke opptatt med en partikkel). Ellers vil partiklenes kontrast bli systematisk undervurdert, da de ikke kan skilles riktig fra bakgrunnssignalet. Dette kan kompenseres ved å øke median vindusstørrelse på bekostning av beregningshastighet. Vær imidlertid oppmerksom på at hvis du angir vindusstørrelsen for stor, kan det påvirke produksjonen negativt på grunn av prøvedrift. En visuell inspeksjon av de behandlede videoene er avgjørende.
- Hvis du vil bruke fjerningen av bakgrunnen, velger du alternativet continuous_median for parametermodus og angir en passende lengde for det glidende medianvinduet (window_length) i notatblokkinndelingen B.1. Du kan også lagre filmene etter fjerning av bakgrunnen som skal brukes til partikkeldeteksjon og banekobling (ved å sette parameteren save_processed_movies til Sann).
- Oppdag partikler og deres respektive posisjon gjennom hele filmen ved hjelp av funksjonen particle_fitting.particle_fitter (se notatbok b.2).
- Juster følsomheten for partikkeldeteksjon med terskelparameteren (thresh, se notatblokkdel B.1), som brukes til å markere kandidatpunkter etter bildebinarisering. Effekten av varierende terskelparametere på spotdeteksjonsfølsomhet kan undersøkes i en egen notatblokk (Movie visualization.ipynb). Resultatene av partikkeldeteksjon lagres automatisk i CSV-filer i en undermappe av filmfilen.
MERK: Å sette terskelparameteren vilkårlig lav (for eksempel for filmer tatt med det brukte massefotometeret, en terskelparameter under 0,0005) anbefales ikke, da kandidatplasser vil bli dominert av falsk støy og dermed forlenge behandlingstiden.
- Juster følsomheten for partikkeldeteksjon med terskelparameteren (thresh, se notatblokkdel B.1), som brukes til å markere kandidatpunkter etter bildebinarisering. Effekten av varierende terskelparametere på spotdeteksjonsfølsomhet kan undersøkes i en egen notatblokk (Movie visualization.ipynb). Resultatene av partikkeldeteksjon lagres automatisk i CSV-filer i en undermappe av filmfilen.
- Fjern dominerende statisk spredning av lys med den pikselvise bakgrunnsestimeringsalgoritmen ved hjelp av image_processing.mp_reader-funksjonen .
- Koble partikler i etterfølgende rammer til baner ved hjelp av Python-pakken trackpy (v.0.5.0)29.
MERK: Banekoblingen utføres mens du er på farten etter spotdeteksjon. Som et resultat lagres en ekstra CSV-fil som inneholder baneinformasjonen, i en underkatalog av Partikkeldeteksjons-CSV-filen.- Fjern baner med for få punkter ved hjelp av parameteren minimum_trajectory_length (se notatblokkdel B.1) for å muliggjøre en robust bestemmelse av diffusjonskoeffisienter. For detaljerte forklaringer om de andre parametrene for trackpy funksjoner, se trackpy dokumentasjon.
- Baneanalyse
- I notatblokkinndeling C.1 angir du bildefrekvensen (frame_rate) og pikselstørrelsen i nm (pixel_size), som ble brukt til filmanskaffelse. Opprett en liste over CSV-filer som inneholder baneinformasjonen som returneres av trackpy (se trinn 9.2) med funksjonen trajectory_analysis.get_csv_files (notatblokkinndeling C.2).
- I tillegg angir du et utdatafilnavn for HDF5-beholderen, som brukes til å lagre tilpasningsresultatene på disken (notatblokkinndeling C.3). Analyser alle baner med funksjonen trajectory_analysis.fit_trajectories i notatblokkinndeling C.4, som går gjennom listen over CSV-filer. Denne funksjonen bruker hoppavstandsfordeling (JDD)30 og gjennomsnittlig kvadrert forskyvning (MSD)31-analyse til å estimere diffusjonskoeffisienten for hver bane.
- Konverter mediankontrasten for hver bane til den tilsvarende massen ved å bruke kontrastmasseforholdet oppnådd fra MSPT-kalibreringen (se avsnitt 7). Angi hellingen (hellingen) og y-skjæringspunktet (forskyvningen) til kalibreringslinjen, som relaterer iSCAT-kontrast til molekylær masse (funksjon trajectory_analysis.apply_calibration; se notatblokkinndeling C.5). Denne funksjonen legger til en kolonne med banens medianmasse i hver dataramme.
- Evaluer den tilsynelatende partikkeltettheten på membranen med funksjonen trajectory_analysis.membrane_tetthet, som returnerer median tetthetsverdi når det gjelder oppdagede partikler og nåværende baner under hver ramme (se notatblokkdel C.6) som tilleggskolonner i datarammen.
MERK: Ettersom en del av partiklene vil gå tapt under både deteksjons- og banekoblingsprosessen, kan de faktiske partikkeltetthetene være høyere. For pålitelige resultater angående partikkeltettheter samt massehitogrammer, inspiser visuelt representative filmbilder for å bekrefte at måleforholdene er plausible for enkeltpartikkelsporing (se trinn 9.1.1).
10. Datavisualisering
- Illustrer korrelasjonen mellom masse- og diffusjonskoeffisient med todimensjonal kjernetetthetsestimering (KDE), som er basert på Python-pakken fastkde (v.1.0.19; https://pypi.org/project/fastkde/).
- Hvis du vil generere plottet, angir du HDF5-filen som inneholder MSPT-resultatene (se trinn 9.3.2 og notatblokkinndeling D.1) og velger én enkelt (notatblokkinndeling D.2) eller en sammenkoblet dataramme (notatblokkinndeling D.3) som inndatadata for plotting.generate_2D_KDE -funksjonen (notatblokkinndeling D.4).
MERK: Hvert plottet datasett bør inneholde ideelt mer enn 1000 baner for en pålitelig 2D-KDE.
Representative Results
Etter den detaljerte protokollen heri for fremstilling av støttede lipid-bilayers (SLD-er) i strømningskamre (figur 1), kan man tydelig gjenkjenne et flekkete mønster i den opprinnelige visningen av alle viste forhold (figur 2). Denne effekten er forårsaket av glassets overflateruhet, som generelt dominerer spredningssignalet og fører til visuelt uutslettelige forhold (glass, glass med SLB eller glass med SLB og vedlagte proteiner). Tilstedeværelsen av vesikler er imidlertid tydelig forskjellig på grunn av vesiklers store sprednings tverrsnitt og muliggjør observasjon av vesiclebrudd og fusjon i homogene membraner (figur 2B og supplerende film 1). Når du fjerner det statiske spredningssignalet til glassoverflaten med en forholdsmetrisk tilnærming som understreker de dynamiske elementene innen synsfeltet24,25, kan man avdekke umerkede proteiner som sprer seg på membranen (figur 2D) mens en tom SLB (figur 2C) eller selve glasset (figur 2A) vises som et støyende bilde.
Den iboende bakgrunnen for MSPT-målinger kan anslås lokalt ved å dele hver bildepunktverdi gjennom medianen n foran og etterfølgende bildepunkter i filmen med samme bildeplassering (figur 3). Som et resultat vises makromolekyler som isotropiske punktspredningsfunksjoner (PSFer) hvis bevegelse på membranen kan observeres, spores og kvantifiseres. Faktisk muliggjør tilgjengeligheten av både kontrast og dynamisk oppførsel den direkte forholdet mellom en partikkels molekylære størrelse til den respektive diffusive oppførselen, alt uten behov for merking av partikkelen. Likevel, for å tolke iSCAT-kontrasten bestemt under MSPT-eksperimenter, er det viktig å utføre en kalibrering som oversetter signalamplituden til molekylær masse. Dette kan oppnås ved å feste biomolekyler av kjent masse til en SLB via et biotin-streptavidin-biotinkompleks (figur 4A). Som en eksemplarisk strategi kan man bruke biotinylerte varianter av bovint serumalbumin (BSA), protein A (prA), alkalisk fosfatase (AP) og fibronectin (FN), som binder seg til streptavidin (STP) som i seg selv er bundet til biotinholdige lipider (Biotinyl Cap PE) i membranen. Som vist i figur 4A, gjenspeiler den stadig mer uttalte kontrasten til disse eksemplariske makromolekylene den økende molekylvekten til de respektive biotinylerte standardene. Ved å tildele hver topp av kontrast histogrammer (figur 4B) til den tilsvarende massen av standardproteinets oligomertilstand, avsløres en lineær sammenheng mellom kontrast og masse21,22 og kan deretter brukes til analyse av ukjente makromolekylsystemer (figur 4C).
Et godt eksempel som demonstrerer MSPTs anvendbarhet og evner til å analysere molekylvekter og dermed studere oligomertilstander og oligomeriseringshendelser, er hensynet til biotinylert aldolase og biotinylert IgG (figur 5). Aldolase rapporteres ofte å være en homotetramer32. Massedistribusjonen som er løst av MSPT, har imidlertid fire distinkte topper, som fremhever tilstedeværelsen av flere populasjoner (figur 5A). Mens den første mindre toppen tilsvarer ubebodd streptavidin og kan forventes på grunn av konfigurasjonen i denne typen eksperiment, kan aldolasekomplekser med bare to underenheter (2SU) eller seks underenheter (6SU) også oppdages (figur 5B). Interessant nok viser tetra- og heksameriske aldolase-streptavidin-komplekser en redusert diffusjonskoeffisient sammenlignet med dimerisk aldolase og streptavidin alene, noe som indikerer et økt viskøs drag, for eksempel via vedlegget av en annen biotinylert lipid til streptavidin. På samme måte viser biotinylert IgG tre topper i massedistribusjonen, med den første toppen igjen som samsvarer med massen av en enkelt streptavidin. Massen av den mest tallrike toppen tilsvarer massen av ett lys og en tung kjede (1SU), det vil si halvparten av et IgG-antistoff. Det fulle antistoffet med to identiske halvdeler (2SU) påviss hos ca. 11% av tilfellene. Reduksjonen av diffusjonskoeffisienten med økende komplekse størrelser indikerer interaksjoner av streptavidin med mer enn en biotinylert lipid eller ekstra dra forårsaket av den vedlagte IgG, eller begge deler.
Foruten den eneste analysen av membranavhengige oligomertilstander, gir MSPT også den spesielle fordelen med å korrelere den diffusive oppførselen til en makromolekyl av interesse med sin oligomertilstand. Representative resultater for denne typen analyse er vist for annexin V (AnV) og koleratoksin subenhet B (CTxB), som binder seg til henholdsvis dioleoylfosfatidylserine (DOPS) eller glykosfedolipider (GM1), innlemmet i membranen (figur 6A). Begge kjernetetthetsestimatene (KDEene) har uimodale fordelinger av masse og diffusjon, noe som indikerer en enkelt rikelig art med lignende diffusiv oppførsel. Toppposisjonen til molekylær masse og diffusjonskoeffisient ble funnet å være 49,8 ± 2,2 kDa og 1,4 ± 0,1 μm2/s, henholdsvis for AnV samt 62,7 ± 3,1 kDa og 0,4 ± henholdsvis 0,1 μm2/s for CTxB. De målte diffusjonskoeffisientene kan sammenlignes med tidligere rapporterte verdier hentet fra høyhastighets AFM og FRAP33,34. Den litt reduserte massen sammenlignet med massen av forventet makromolekyl (52 kDa for en AnV trimer, 65 kDa for en CTxB pentamer) kan indikere tilstedeværelsen av mindre komplekser med færre underenheter i ensemblet. Mens masseforskjellen mellom proteinene er liten og nær den angitte deteksjonsgrensen for mikroskopet (≈50 kDa), varierer deres diffusjonskoeffisienter betydelig. I en likevektsblanding, for eksempel ved å sammenligne blandingens diffusjon med fordelingen av AnV og CTxB alene, kan man konkludere med at AnV er mer rikelig på membranen enn CTxB (figur 6B). Men hvis konsentrasjonen av CTxB dobles sammenlignet med konsentrasjonen av AnV, skiftes likevekten mot CTxB som det dominerende proteinet på membranen. Som illustrert for blandinger av AnV og CTxB, tillater MSPT ikke bare å diskriminere membranrelaterte makromolekyler i henhold til deres molekylvekt, men muliggjør også diskriminering av forskjellige makromolekylpopulasjoner i henhold til deres diffusive oppførsel.
Som med alle mikroskopiteknikker er noen eksperimentelle krav avgjørende for å oppnå ønsket kvalitet på data. Et viktig eksempel i denne sammenhengen er grundig rengjorte deksler. Generelt anses dette som en forutsetning for mikroskopirelaterte enkeltmolekyleksperimenter, men MSPT er spesielt følsom for prøve urenheter. Den økte spredningen som stammer fra glassoverflaten av urene deksler forhindrer kvantitativ iSCAT-måling. Spesielt kan selv gjenværende smuss eller støvpartikler på utilstrekkelig rengjort glass forårsake bemerkelsesverdige bildeforvrengninger, gjenkjennelige som lyse flekker i den opprinnelige bildemodusen (figur 7A). Selv om disse feilene fjernes av bakgrunnsestimeringen på grunn av deres statiske natur, kan nøyaktig bestemmelse av en partikkels kontrast bli svekket og dermed påvirke den kvantitative analysen negativt. Et annet vanlig problem som oppstår i MSPT-eksperimenter er de resterende vesiklene som enten flyter (omkranset i oransje) gjennom synsfeltet eller ufukkede vesikler som sitter fast (omkranset i blått) i en bestemt posisjon på membranen og vises som store pulserende scattere (figur 7B). For å minimere forekomsten og forstyrrelsen av filmanskaffelse, anbefales det å vaske SLB grundig før du tilsetter proteinet og bruke nylagde blandinger av små unilamellar vesicles (SUVer) og divalente kasjoner.
En faktor som må tas i betraktning for utformingen av massefølsomme partikkelsporingseksperimenter er tettheten av makromolekyler forbundet med membrangrensesnittet. Høye partikkeltettheter på membranen kan faktisk forårsake problemer av to grunner: i) Koblingen av partikkeldeteksjoner fra påfølgende rammer til baner blir tvetydig og øker dermed sannsynligheten for feil og feilbedømte diffusjonskoeffisienter. ii) Massen av partikler, som ekstraheres fra amplituden til deres tilsvarende PSF-passform, blir systematisk undervurdert og massetoppene utvides fordi separasjonen av det statiske bakgrunnssignalet fra det dynamiske partikkelsignalet blir stadig vanskeligere (figur 7C). For tiden er visuell vurdering av datakvalitet i ferd med å anskaffe MSPT-videoer vanskelig på de tilgjengelige kommersielle mikroskopene fordi den implementerte ratiometriske visningen i oppkjøpsprogramvaren bruker bakgrunnsfjerningen som er etablert for massefotometri21 i stedet for den medianbaserte algoritmen beskrevet her og i referanser24,25 (figur 7D ). Den gjennomsnittlige kontinuerlige bakgrunnsfjerningen som brukes til å visualisere landingsmolekyler i massefotometri, fører til at diffuserende partikler vises som mørke fronter med lyse haler, noe som gjør at flekkene virker svært anisotrope og forstyrrer PSF-tilpasning under deteksjonsprosedyren. Dermed er bruken av den implementerte middelmådige bildebehandlingen i oppkjøpsprogramvaren uegnet for analyse av diffuse biomolekyler på membraner.
Figur 1: Prosessflytdiagram over de enkelte trinnene som kreves for å analysere proteinmembraninteraksjoner med massesensitiv partikkelsporing (MSPT). For å forberede prøver for MSPT-målinger må glassdekselsklier rengjøres grundig og aktiveres med et oksygenplasma. Etter montering i prøvestrømningskamre, er små unilamellar vesikler (SUVer) forberedt for støttet lipidbilayer (SLB) dannelse og alle reaksjonsbuffere filtreres for å redusere bakgrunnsspredning. SUVer legges til for å danne lipidbilayers i strømningskamrene. Eventuelt kan divalente kasjoner som Ca2+ ioner legges til SUVene for å fremme vesicle-brudd. Endelig skylles lave konsentrasjoner av proteinet av interesse inn i reaksjonskammeret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Opprinnelig og forholdsmetrisk visning av eksemplariske overflater som er relevante for MSPT-målinger. Representative bilder av overflaten grovhet av et glassdeksel lysbilde (A), under dannelsen av en støttet lipid bilayer (B), med en intakt støttet lipid bilayer (C) og av eksemplariske proteiner rekonstituert på en SLB (D). Alle de fire eksemplene vises i opprinnelig modus, som du kan få tilgang til under selve målingen, og som behandlede rasjonsmetriske bilder etter medianbasert bakgrunnsfjerning. Skalastolper representerer 1 μm. For dataanalyse (se ledsaget Jupyter bærbar PC; trinn 9), ble følgende parametere brukt: median vindusstørrelse (window_length) = 1001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Trinnvis diagram over stadiene som kreves for MSPT-datainnsamling og -analyse. Etter datainnsamling for utvalget av interesse på massefotometeret, behandles filmer for å fjerne den statiske bakgrunnen gjennom en pikselmessig glidende mediantilnærming. Deretter identifiseres og monteres kandidatpartikler ved hjelp av en punktspredningsfunksjon (PSF) før de kobles til partikkelbaner. For å muliggjøre bestemmelse av diffusjonskoeffisienten for hver partikkel, brukes gjennomsnittlig kvadrert forskyvningsanalyse (MSD) eller hoppavstandsfordeling (JDD). På dette stadiet kan kontrastverdier forvandles til molekylære masser i henhold til kontrastmasserelasjonen som bestemmes gjennom kalibreringsstrategien. Som et siste trinn kan baner filtreres basert på lengden eller membranpartikkeltettheten og visualiseres ved todimensjonal kjernetetthetsestimering (2D-KDE). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kalibrering av masse-til-kontrast-relasjonen for MSPT-målinger. (A) Representative metriske rammer oppnådd for eksemplariske streptavidin-standard proteinkomplekser som sprer seg på en støttet lipidbilayer som inneholder en liten prosentandel biotinylerte lipider (DOPC:DOPG:Biotinyl Cap PE-forholdet på 70:29,99:0,01 mol%). Som modellmolekylære vektstandarder vises monovalent streptavidin28 (stp only) eller divalent streptavidin28 i kompleks med enten biotinylert bovint serumalbumin (BSA), biotinylert protein A (prA), biotinylert alkalisk fosfatase (AP) eller biotinylert fibronektin (FN). Kandidatflekker er uthevet i oransje (stiplede sirkler) og vellykkede partikkeldeteksjoner er uthevet i rødt (faste sirkler). Skalastolpene representerer 1 μm. (B) Sannsynlighetstetthetsfordelinger av kontrastverdier oppnådd for de fem modellstandardproteinene. Alle viste data representerer grupperte distribusjoner av tre uavhengige eksperimenter per betingelse: STP bare n = 82 719; BSA n = 9 034; prA n = 22 204; AP n = 69 065, og FN n = 71 759 baner. Sammenlignet med partikkeltall bestemt for membraner med proteiner, er antall partikler som oppdages på en tom bilayer ubetydelig ved moderate membrantettheter (supplerende figur 1). Kontrasttopper som vurderes for massekalibrering er merket gjennom kontinuerlige linjer, mens stiplede representerer oligomertilstander som ikke vurderes. (C) Kontrast-til-masse kalibreringskurve avledet fra toppkontraster i panel D og de respektive sekvensmassene av kompleksene. Feilfelt viser standardfeilen for toppplasseringene beregnet ved bootstrapping (100 omsampler med 1000 baner hver). For dataanalyse (se Jupyter bærbar PC; trinn 9) ble følgende parametere brukt: median vindusstørrelse (window_length) = 1 001 bilder, deteksjonsterskel (tresk) = 0,00055, søkeområde (dmax) = 4 piksler, minne (max_frames_to_vanish) = 0 bilder, minimum banelengde (minimum_trajectory_length) = 7 bilder (bare STP), 9 bilder (BSA/FN), 15 bilder (prA), 10 bilder (AP). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Dechiffrering av oligomertilstander av membranrelaterte proteiner. (A) 2D-kjernetetthetsestimater av både masse- og diffusjonskoeffisient av tetravalent streptavidin i kompleks med biotinylert aldolase (venstre panel) eller med et biotinmodifisert geit anti-Kanin IgG-antistoff (høyre panel). Rekonstituering av begge kompleksene har blitt utført på en støttet lipidbilayer som inneholder henholdsvis DOPC, DOPG og Biotinyl Cap PE i forholdet 70:29.99:0.01 mol%. Totalt er 116 787 baner med tre uavhengige repliker inkludert for streptavidin-aldolasekomplekset (partikkeltetthet på 0,1 μm-2) og 348 405 for streptavidin-IgG-komposittet (partikkeltetthet på 0,1 μm-2). Bare partikler med en sporlengde på minst fem rammer ble inkludert. Marginale sannsynlighetsfordelinger av både molekylær masse (topp) og diffusjonskoeffisient (høyre) presenteres. Den svarte x i begge panelene markerer den respektive lokale maksimen til KDE. (B) Sammenligning av bestemte oligomermasser for komplekset av tetravalent streptavidin med biotinmodifisert aldolase (venstre panel) eller biotinylert IgG (høyre panel) med, i henhold til sekvensmassene, forventede molekylvekter. Forkortelsen SU innføres på vegne av proteinet til interessens underenhet. Feilfelt viser standardfeilen for toppplasseringene beregnet ved bootstrapping (100 omsampler med 1000 baner hver). For dataanalyse (se ledsaget Jupyter bærbar PC; trinn 9), ble følgende parametere brukt: median vindusstørrelse (window_length) = 1001 rammer, deteksjonsterskel (tresk) = 0,00055, søkeområde (dmax) = 4 piksler, minne (max_frames_to_vanish) = 0 bilder, minimum banelengde (minimum_trajectory_length) = 5. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Oppløsning av den diffusive oppførselen til de innfødte membraninteragerende proteinene annexin V (AnV) og koleratoksinunderenhet B (CTxB). (A) 2D-kjernetetthetsestimater av både masse- og diffusjonskoeffisienten til annexin V (venstre panel) og koleratoksinunderenhet B (høyre panel). For anV og CTxB membran rekonstituering, lipid komposisjoner av 80:20 mol% DOPC til DOPS og 99.99:0.01 mol% DOPC til GM1 har blitt brukt, henholdsvis. Totalt 206 819 baner med tre uavhengige replikeringer er inkludert for AnV (partikkeltetthet på 0,1 μm-2) og 142 895 baner for CTxB (partikkeltetthet på 0,2 μm-2). (B) 2D-kjernetetthetsberegninger av CTxB- og AnV-blandinger i forholdet 1:1 (venstre panel) eller 2:1 (høyre panel). Rekonstituering av proteinblandinger ble utført på en støttet lipidbilayer som inneholder DOPC-, DOPS- og GM1-lipider i forholdet 80:19,99:0,01 mol%. Totalt er 42 696 baner med tre uavhengige repliker inkludert for 1:1-blandingen (partikkeltetthet på 0,1 μm-2) og 264 561 baner for 2:1-forholdet (partikkeltetthet på 0,3 μm-2). For både (A) og (B) ble bare partikler med en sporlengde på minst fem rammer inkludert. Marginale sannsynlighetsfordelinger av både molekylær masse (topp) og diffusjonskoeffisient (høyre) presenteres. Den hvite x i hvert panel markerer det respektive globale maksimumet av KDE. For dataanalyse (se ledsaget Jupyter bærbar PC; trinn 9), ble følgende parametere brukt: median vindusstørrelse (window_length) = 1001 rammer, deteksjonsterskel (tresk) = 0,00055, søkeområde (dmax) = 4 piksler, minne (max_frames_to_vanish) = 0 bilder, minimum banelengde (minimum_trajectory_length) = 5. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Potensielle komplikasjoner i løpet av MSPT-målinger eller under dataanalyse. (A) Representative bilder av overflateruhet som vises både i den opprinnelige og den bearbeidede (medianbaserte bakgrunnsfjerning) ratiometriske visningen av et urent dekselglasssklie. I begge tilfeller utgjør lyse flekker gjenværende overflate urenheter som hindrer artefaktfrie målinger. (B) Eksemplariske bilder av rest vesicles innen synsfeltet etter utilstrekkelig membranvask. Både statiske (uthevet i blått) og diffuserende (uthevet i oransje) vesicles vil svekke målekvaliteten enten på grunn av pulserende og wiggling eller på grunn av deres retningsbevegelse, henholdsvis. (C) Som en enkeltpartikkelteknikk krever MSPT lave partikkeltettheter (representativt bilde, øvre panel) for å muliggjøre riktig kobling og massebestemmelse av hver partikkel. Ved høye membranpartikkeltettheter (mellompanel) er partikkeltilpasning svekket, noe som påvirker massebestemmelsen (se nedre panel). (D) Representative rasjonsmetriske bilder av partikler som sprer seg på et membrangrensesnitt etter enten middelbasert (øvre panel) eller medianbasert bakgrunnsfjerning. For diffuse partikler produserer den middelbaserte bakgrunnsfjerningsstrategien forvrengte bilder av partikkelens PSF som det fremgår av de små innsettene mellom øvre og midtre panel. Derimot kan usorterte partikkel-PSFer oppnås gjennom den medianbaserte tilnærmingen. Nedre panel: Sammenligning av linjeprofiler gjennom midten av PSF oppnådd etter middel- eller medianbasert bakgrunnsfjerning. For alle opprinnelige og forholdsmetriske bilder som vises i denne figuren, representerer skalalinjene 1 μm. For dataanalyse (se ledsaget Jupyter bærbar PC; trinn 9), ble følgende parametere brukt: median vindusstørrelse (window_length) = 1001 rammer, deteksjonsterskel (tresk) = 0,00055, søkeområde (dmax) = 4 piksler, minne (max_frames_to_vanish) = 0 bilder, minimum banelengde (minimum_trajectory_length) = 5. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Sammenligning av proteinfrie og okkuperte membraner. Representative bilder av en intakt støttet lipid bilayer før (A) og etter (B) tillegg av renset streptavidin (STP). Kandidatplasser som var vellykket tilpasset modellen PSF er omkranset i rødt. (C) Kontrastsannsynlighetsfordelinger av partikler som oppdages på en tom membran (membranbakgrunn, grå) og på en bilayer med diffuse streptavidinpartikler (blå). Begge sannsynlighetsfordelingene representerer de samlede dataene for tre uavhengige eksperimenter med identiske parametere for filmanskaffelse og analyse. For dataanalyse (se ledsaget Jupyter bærbar PC; trinn 9), ble følgende parametere brukt: median vindusstørrelse (window_length) = 1001 rammer, deteksjonsterskel (tresk) = 0,00055, søkeområde (dmax) = 4 piksler, minne (max_frames_to_vanish) = 0 bilder, minimum banelengde (minimum_trajectory_length) = 7 bilder. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende film 1: Eksemplarisk film som viser brudd og fusjon av vesikler i en homogen membran registrert med massefotometeret. Median vindusstørrelse for bildebehandling (window_length) = 1 001 bilder. Skalastang: 1 μm. Kameraet teller rekkevidde: svart = 16 892; hvit = 65 408. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Supplementary Movie 2: Eksemplariske filmer som viser spredningen av annexin V (topp) og biotinylerte aldolase (bunn) komplekser på en bilayer som hentet fra MSPT-målinger. Median vindusstørrelse for bildebehandling (window_length) = 1 001 bilder. Skalastang: 1 μm. Interferometrisk spredningskontrastområde: svart = -0,0075; hvit = 0,0075. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Discussion
Den presenterte protokollen utvider massefotometri21, en teknikk som analyserer massen av enkelt biomolekyler som adsorkulerer på glass, til et enda mer allsidig verktøy som samtidig kan måle massen og diffusjonen av umerkede membraninteragerende biomolekyler. Denne analyseutvidelsen oppnås gjennom implementering av en modifisert bakgrunnsfjerningsstrategi tilpasset molekylenes laterale bevegelse24,25. Generelt er bakgrunnsfjerningen av største betydning for iSCAT-baserte tilnærminger, siden den sterke spredningen av glassoverflatens grovhet representerer hovedanalysehindringen, og den nøyaktige bestemmelsen av hver piksels lokale bakgrunn er avgjørende for kvantifisering av partikkelmasse og plassering. Foruten bildeanalysen tilpasset partikkelbevegelse, fullfører påfølgende partikkeldeteksjon, banekobling og dataanalyse den nye utvidelsen av MP til massesensitiv partikkelsporing (MSPT).
Generelt er grundig rensede glassdekselsklier og et rent arbeidsmiljø kritiske krav for vellykket ytelse av MSPT-eksperimenter. På grunn av fraværet av makromolekylmerking er det oppkjøpte signalet iboende ikke-selektivt. Rene prøver, samt riktig prøvehåndtering, er derfor avgjørende for å sikre at observasjoner ikke kan feiltolkes. Spesielt når molekyler med lav molekylvekt undersøkes, er kontrollmålinger av proteinfrie membraner godkjent for å vurdere bakgrunnsbidrag (supplerende figur 1). I tillegg til å inkludere kontrollmålinger, anbefales det derfor å følge forberedelsestrinnene som vises i figur 2 for hvert strømningskammer. Når de kombineres, vil disse sikkerhetstiltakene sikre at det oppdagede signalet stammer fra biomolekylet av interesse og ikke for eksempel et forurenset strømningskammer, buffer eller membran.
I tillegg til forholdsregler angående eksperimentell design, må det også tas hensyn til under MSPT-bildebehandling. Under videobehandling bør verdien for tre parametere velges nøye for å sikre riktige resultater: i) lengden på medianvinduet for fjerning av bakgrunn, ii) terskelen for partikkeldeteksjon, og iii) maksimal søkeradius under koblingsoppdraget. Et større medianvindu (i) letter generelt separasjonen av diffuserende partikler fra den overliggende kvasikonstante bakgrunnen. Men for for store vindusstørrelser vil prøvedriften etter hvert bli merkbar og redusere nøyaktigheten av bakgrunnsestimeringen. Optimale innstillinger avhenger sterkt av prøveegenskaper og måleforhold. Likevel kan en verdi på 1001 brukes som et robust utgangspunkt. Terskelparameteren (ii) må justeres avhengig av den laveste molekylære massen som forventes i prøven. En verdi under 0,0005 anbefales ikke for målinger tatt med massefotometeret som brukes i denne studien. For å øke analysetidene kan du velge høyere verdier hvis en prøve med høy molekylvekt forventes. Søkeradiusen i banekobling (iii) angir den maksimale radialavstanden i piksler der partikkelens forskjøvet plassering skal søkes etter i påfølgende rammer. Det bør tilpasses den raskeste partikkelen i prøven, og hvis det favoriseres, kan et adaptivt søkeområde (se dokumentasjon av trackpy) brukes i stedet for å redusere beregningstiden. Spesielt i den første fasen av et prosjekt anbefales det å analysere filmene på nytt med varierende parametere for å validere de oppnådde resultatene.
I lys av MSPTs enkeltmolekyls natur bør det unngås å måle ved høye membranpartikkeltettheter, da de kan forstyrre nøyaktig kontrast og massebestemmelse. Det har vist seg at tettheter under en partikkel per kvadrert mikrometer er gunstige for MSPT-målinger24. En ekstra vurdering er de forventede diffusjonskoeffisientene i prøven. Selv om MSPT gjelder for et bredt spekter av diffusjonskoeffisienter, har MSPT en nedre grense for tilgjengelige diffusjonskoeffisienter. Lokal innesperring til et område på få piksler i en betydelig del av medianvindusperioden slår sammen partikkelen med den statiske bakgrunnen. For bildeforholdene som brukes i denne protokollen, anbefales ikke måling av diffusjonskoeffisienter under 0,01 μm2/s. Ved denne diffusjonshastigheten, for eksempel, er den gjennomsnittlige kvadrerte forskyvningen av en partikkel under medianvinduets halvstørrelse ca. 4 piksler og dermed av lignende størrelse som omfanget av PSF. Som en konsekvens vil det statiske bakgrunnsestimatet sannsynligvis inneholde signalbidrag fra selve partikkelen, noe som resulterer i en tilsynelatende redusert kontrast av partikkelen til den til slutt nærmer seg støynivået. Imidlertid kan makromolekyler diffusjonskoeffisienter mellom 0,05 og 10 μm2/s tydelig løses.
For ytterligere å utvide spekteret av MSPT-applikasjoner, kan man se for seg en fremgang av den medianbaserte bakgrunnsalgoritmen gjennom eliminering av piksler som midlertidig er opptatt med en partikkel, eller ved prøvedriftskorrigering som muliggjør større medianvindustørrelser. Begge tilnærmingene ville lindre problemene med målinger ved høye partikkeltettheter og langsom diffusjon. Forbedringer når det gjelder lavere massefølsomhet er i horisonten med en ny generasjon massefotometre, som kan gi tilgang til biomolekyler mindre enn 50 kDa. Derfor vil fremtidige MSPT-eksperimenter kunne studere enkeltmolekyldynamikk og membranrelaterte interaksjoner for et enda bredere spekter av membranimileringer som polstrede bilayers og makromolekylære systemer.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi setter stor pris på støtten fra Philipp Kukura, Gavin Young og Refeyn-programvareteamet og anerkjenner deres hjelp ved å dele deler av bildeanalysekoden. Vi takker Cryo-EM MPIB Core Facility for å gi tilgang til det kommersielle Refeyn-massefotometeret. F.S. anerkjenner takknemlig støtten og finansieringen gitt av Jürgen Plitzko og Wolfgang Baumeister. T.H. og P.S. fikk støtte gjennom Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Project-ID 201269156 - SFB 1032 (A09). N.H. ble støttet av et DFG-returstipend HU 2462/3-1. P.S. anerkjenner støtte gjennom forskningsnettverket MaxSynBio via det felles finansieringsinitiativet til det tyske føderale utdannings- og forskningsdepartementet (BMBF) og Max Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| annexin V | Sigma Aldrich | #SRP8026 | examplary membrane-interacting protein |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad Laboratories Inc. | #5000006 | bradford assay kit to determine protein stock concentrations |
| biotin labeled bovine albumin | Sigma Aldrich | #A8549 | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
| cholera toxin subunit B | Sigma Aldrich | #SAE0069 | examplary membrane-interacting protein |
| cover glasses, #1.5, 24 x 24 mm | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | #0102062 | |
| cover glasses, #1.5, 24 x 60 mm | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | #0102242 | |
| dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | #850375 | lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
| dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap biotinyl (18:1 Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | #870273 | lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
| dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG) | Avanti Polar Lipids | #840475 | lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
| dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) | Avanti Polar Lipids | #840035 | lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
| double-sided tape | tesa | #57912-00000-02 | needed for the assembly of glass sample chambers |
| Extruder | Avanti Polar Lipids | #610023 | Lipid extruder to enable monodisperse vesicle distributions |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #A39261 | maileimide-fused biotin that can be used to biotinylate standard proteins for MSPT |
| Fibronectin (Biotinylated) | Cytoskeleton Inc. | #FNR03-A | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
| Gel Filtration HMW Calibration Kit | Cytiva | #28403842 | standard proteins, e.g. aldolase that can be biotinylated and used as molecular weight standards for MSPT |
| GM1 Ganglioside (Brain, Ovine-Sodium Salt) | Avanti Polar Lipids | #860065 | lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Biotin | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) | #31820 | examplary protein to highlight the existence of different protein states |
| Isopropanol, 99.5%, for spectroscopy | Thermo Fisher Scientific | #10003643 | |
| Low Autofluorescence Immersion Oil | Olympus K.K. | #IMMOIL-F30CC | |
| pET21a-Streptavidin-Alive | Addgene | #20860 | required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other |
| pET21a-Streptavidin-Dead | Addgene | #20859 | required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other |
| Pierce Alkaline Phosphatase, biotinylated | Thermo Fisher Scientific | #29339 | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
| Pierce Protein A, Biotinylated | Thermo Fisher Scientific | #29989 | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
| Refeyn Acquire | Refeyn Ltd. | control software for Refeyn OneMP | |
| Refeyn One | Refeyn Ltd. | - | mass photometer |
| sterile syringe filters 0.45 µm cellulose acetate membrane | VWR International | #514-0063 | needed to filter particles from the buffer of interest |
| tetravalent streptavidin | Thermo Fisher Scientific | #SNN1001 | tetravalent streptavidin to enable the presence of several biotin binding sites |
| Whatman Nuclepore Hydrophilic Membrane, 0.05 µm Pore Size, 25 mm Circle | Cytiva | #110603 | a pore size of 50 nm is recommended for supported lipid bilayer formation in the context of MSPT |
| Zepto model 2 plasma cleaner | Diener electronic GmbH | - |
References
- Robertson, J. L. The lipid bilayer membrane and its protein constituents. Journal of General Physiology. 150 (11), 1472-1483 (2018).
- Grecco, H. E., Schmick, M., Bastiaens, P. I. H. Signaling from the Living Plasma Membrane. Cell. 144 (6), 897-909 (2011).
- Cho, W., Stahelin, R. V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34, 119-151 (2005).
- Whited, A. M., Johs, A. The interactions of peripheral membrane proteins with biological membranes. Chemistry and Physics of Lipids. 192, 51-59 (2015).
- Gonzalez, L., Scheller, R. H. Regulation of membrane trafficking: Structural insights from a Rab/effector complex. Cell. 96 (6), 755-758 (1999).
- Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
- Bagheri, Y., Ali, A. A., You, M. Current methods for detecting cell membrane transient interactions. Frontiers in Chemistry. 8, 603259 (2020).
- Miller, H., Zhou, Z., Shepherd, J., Wollman, A. J. M., Leake, M. C. Single-molecule techniques in biophysics: A review of the progress in methods and applications. Reports on Progress in Physics. 81 (2), 024601 (2018).
- Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: From methods to biophysical insights. Reports on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).
- Gelles, J., Schnapp, B. J., Sheetz, M. P. Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision. Nature. 331 (6155), 450-453 (1988).
- Funatsu, T., Harada, Y., Tokunaga, M., Saito, K., Yanagida, T. Imaging of single fluorescent molecules and individual ATP turnovers by single myosin molecules in aqueous solution. Nature. 374 (6522), 555-559 (1995).
- Schmidt, T., Schütz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H.
- Taylor, R. W., et al. Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).
- Kukura, P., et al. High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus. Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).
- Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface. Optics Express. 14 (1), 405 (2006).
- Ueno, H., et al. Simple dark-field microscopy with nanometer spatial precision and microsecond temporal resolution. Biophysical Journal. 98 (9), 2014-2023 (2010).
- Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE. Nature Structural and Molecular Biology. 18 (5), 577-583 (2011).
- Bezeljak, U., Loya, H., Kaczmarek, B., Saunders, T. E., Loose, M. Stochastic activation and bistability in a Rab GTPase regulatory network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (12), 6504-6549 (2020).
- Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63 (1), 595-617 (2012).
- Garcia-Parajo, M. F., Segers-Nolten, G. M. J., Veerman, J. A., Greve, J., Van Hulst, N. F. Real-time light-driven dynamics of the fluorescence emission in single green fluorescent protein molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7237-7242 (2000).
- Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
- Piliarik, M., Sandoghdar, V. Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites. Nature Communications. 5, 4495 (2014).
- Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy. ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).
- Heermann, T., Steiert, F., Ramm, B., Hundt, N., Schwille, P. Mass-sensitive particle tracking to elucidate the membrane-associated MinDE reaction cycle. Nature Methods. 18 (10), 1239-1246 (2021).
- Foley, E. D. B., Kushwah, M. S., Young, G., Kukura, P. Mass photometry enables label-free tracking and mass measurement of single proteins on lipid bilayers. Nature Methods. 18 (10), 1247-1252 (2021).
- Voss, O. H., Lee, H. N., Tian, L., Krzewski, K., Coligan, J. E. Liposome preparation for the analysis of lipid-receptor interaction and efferocytosis. Current Protocols in Immunology. 120, 1-21 (2018).
- Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLoS ONE. 11 (7), 0158457 (2016).
- Howarth, M., et al. A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site. Nature Methods. 3 (4), 267-273 (2006).
- Allan, D., et al.
- Weimann, L., et al. A quantitative comparison of single-dye tracking analysis tools using Monte Carlo simulations. PLoS ONE. 8 (5), 64287 (2013).
- Michalet, X. Mean square displacement analysis of single-particle trajectories with localization error: Brownian motion in an isotropic medium. Physical Review E - Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82 (4), 041914 (2010).
- Sygusch, J., Beaudry, D., Allaire, M. Molecular architecture of rabbit skeletal muscle aldolase at 2.7-A resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (22), 7846-7850 (1987).
- Heath, G. R., Scheuring, S. High-speed AFM height spectroscopy reveals µs-dynamics of unlabeled biomolecules. Nature Communications. 9 (1), 4983 (2018).
- Day, C. A., Kenworthy, A. K. Mechanisms underlying the confined diffusion of cholera toxin B-subunit in intact cell membranes. PLOS ONE. 7 (4), 34923 (2012).
