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Artículo de método

Sistema de cultivo tridimensional sin suero para células madre de la glándula lagrimal

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DOI:

10.3791/63585

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2 de junio de 2022

 ,  , 
1MOE Key Laboratory of Gene Function and Regulation, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

En este artículo

Resumen

El método tridimensional de cultivo sin suero para células madre adultas de la glándula lagrimal (LG) está bien establecido para la inducción de la formación y diferenciación de organoides LG en células acinares o similares a las ductales.

Resumen

La terapia basada en células madre de la glándula lagrimal (LG) es una estrategia prometedora para las enfermedades de la glándula lagrimal. Sin embargo, la falta de un método de cultivo confiable y libre de suero para obtener un número suficiente de células madre LG (LGSC) es un obstáculo para futuras investigaciones y aplicaciones. El método de cultivo tridimensional (3D), libre de suero para LGSC de ratones adultos está bien establecido y se muestra aquí. Las LGSC podrían ser continuamente pasajeras e inducidas a diferenciarse a células acinares o similares a las ductales.

Para el cultivo primario lgsc, los LGs de ratones de 6-8 semanas de edad fueron digeridos con dispasa, colagenasa I y tripsina-EDTA. Un total de 1 × 104 células individuales fueron sembradas en 80 μL de matriz de células madre de células madre de gel-glándula lagrimal (LGSCM) en cada pocillo de una placa de 24 pocillos, precubierta con 20 μL de matriz gel-LGSCM. La mezcla se solidificó después de la incubación durante 20 min a 37 °C, y se agregaron 600 μL de LGSCM.

Para el mantenimiento de LGSC, los LGSC cultivados durante 7 días se desagregaron en células individuales por dispasa y tripsina-EDTA. Las células individuales fueron implantadas y cultivadas de acuerdo con el método utilizado en el cultivo primario LGSC. Las LGSC podrían pasar más de 40 veces y expresar continuamente los marcadores de células madre/progenitoras Krt14, Krt5, P63 y nestina. Las LGSC cultivadas en LGSCM tienen capacidad de autorrenovación y pueden diferenciarse en células acinares o ductales in vitro e in vivo.

Introducción

Las células madre de la glándula lagrimal (LGSC) mantienen la renovación celular de la glándula lagrimal (LG) y son la fuente de células acinares y ductales. Por lo tanto, el trasplante lgsc se considera un enfoque alternativo para tratar el daño inflamatorio severo y la enfermedad del ojo seco con deficiencia acuosa (AÑAD)1,2,3. Se han aplicado varios métodos de cultivo para enriquecer LGSCs. Tiwari et al. separaron y cultivaron células primarias de LG utilizando colágeno I y gel de matriz complementado con varios factores de crecimiento; sin embargo, las células LG no pudieron ser cultivadas continuamente4. Utilizando cultivo bidimensional (2D), las células madre derivadas de LG de ratón fueron aisladas por You et al.5 y Ackermann et al. 6, se encontró que expresa los genes marcadores de células madre / progenitoras, Oct4, Sox2, Nanog y nestina, y podría ser subcultivado. Sin embargo, no hay indicios claros de que estas células puedan diferenciarse en células acinares o ductales, y no existe un experimento de trasplante para verificar el potencial de diferenciación in vivo.

Recientemente, las células c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45- se aislaron de LIG de ratón mediante citometría de flujo, se encontró que expresaban marcadores de células progenitoras LG, como Pax6 y Runx1, y se diferenciaron en conductos y acini in vitro. En ratones con ADD, la inyección ortotópica con estas células podría reparar las GL dañadas y restaurar la función secretora de lasGL 2. Sin embargo, el número de células madre aisladas por este método fue pequeño, y no hay condiciones de cultivo adecuadas para expandir las LGSC aisladas. En resumen, es necesario establecer un sistema de cultivo adecuado para aislar y cultivar eficazmente las LGSC adultas con expansión estable y continua para el estudio de las LGSC en el tratamiento de la ADICIÓN.

Los organoides derivados de células madre o células madre pluripotentes son un grupo de células que son histológicamente similares a los órganos relacionados y pueden mantener su propia renovación. Después de que el organoide del intestino de ratón fue cultivado con éxito por Sato et al. en 20097, se cultivaron organoides de otros órganos en sucesión, según el sistema de cultivo de Sato, como la vesícula biliar8, el hígado9, el páncreas10, el estómago11, la mama12, el pulmón13, la próstata14 y la glándula salival15 . Debido a la alta proporción de células madre adultas antes de la diferenciación celular en cultivo organoide, el método de cultivo organoide tridimensional (3D) se considera óptimo para el aislamiento y cultivo de células madre adultas de LG.

En el presente estudio se estableció un sistema de cultivo LGSC de ratón adulto mediante la optimización del método de cultivo 3D, libre de suero. Está comprobado que las LGSC cultivadas tanto en ratones normales como en ratones ADDED mostraron una capacidad estable de autorrenovación y proliferación. Después del trasplante en los GL de ratón ADDED, los LGSC colonizaron los LGs deteriorados y mejoraron la producción de lágrimas. Además, se aislaron LGSC fluorescentes rojos de ratones ROSA26mT/mG y se cultivaron. Este trabajo proporciona una referencia confiable para el enriquecimiento LGSC in vitro y el autoinjerto LGSC en aplicación clínica para la terapia CON ADD.

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Protocolo

Todos los experimentos en este protocolo siguieron las pautas de cuidado animal del Comité Ético de Ensayos con Animales de la Universidad Sun Yat-sen. Todas las operaciones relacionadas con la célula deben realizarse en el banco de trabajo ultralimpio en la sala de operaciones de la celda. Todas las operaciones con xileno deben llevarse a cabo en campanas extractoras.

1. Cultura primaria LGSC

  1. Aislamiento LG
    1. Obtenga un ratón macho BALB / c de 6 a 8 semanas de edad y corte la piel detrás de la oreja para exponer el LG y el tejido conectivo que lo rodea. Despegue el tejido conectivo mediante disección roma con la ayuda de pinzas y retire el LG.
    2. Enjuague los LG dos veces con 4 ml de solución estéril de PBS de 10 mM para eliminar la sangre en un plato de 6 cm. Sumergir los LGs en un plato de 6 cm con 4 mL de etanol al 75% durante 10 s y enjuagar con 10 mM PBS dos veces inmediatamente.
  2. Obtener células individuales de LG
    1. Utilice la solución tampón HEPES (50 mM HEPES/KOH, pH 7.4; 150 mM NaCl en agua ultrapura) para preparar 25 U/mL de dispasa. Prepare la solución de colagenasa I al 0,1% con agua ultrapura.
    2. Cortar los LGs en pequeños fragmentos (aproximadamente 1 mm3), transferirlos a un tubo centrífugo estéril de 15 ml y tratar los tejidos con 500 μL de 25 U/mL de dispasa y 500 μL de colagenasa I al 0,1% durante 1 h a 37 °C.
    3. Utilice PBS de 10 mM para preparar la solución de tripsina-EDTA (0,05 g/L de tripsina, 0,04 g/L de EDTA). Trate los fragmentos de LG del paso 1.2.2 con 1 ml de tripsina-EDTA al 0,05% durante 10 min a 37 °C y disocie los fragmentos en células individuales mediante pipeteo repetidamente.
    4. Filtre la suspensión a través de un filtro de 70 μm, recoja el filtrado en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml y centrífuga a 150 × g durante 5 min.
    5. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante, agregue 10 ml de PBS de 10 mM para lavar el pellet celular y centrífuga la suspensión.
    6. Repita el paso 1.2.5, retire el sobrenadante y agregue 1 ml de DMEM/F12 (mezcla 1:1 del medio Eagle modificado de Dulbecco y el F-12 de Ham) para resuspendir los gránulos celulares.
  3. Cultura primaria LGSC
    1. Prepare el medio de células madre de la glándula lagrimal (LGSCM) que contiene DMEM / F12, 1x suplemento de N2, 1x suplemento de B27, sustituto de glutamina de 2 mM, NEAA de 0.1 mM (aminoácidos no esenciales), factor de crecimiento epidérmico murino (EGF) de 50 ng / ml, factor de crecimiento de fibroblastos de 100 ng / ml 10 (FGF10), 10 ng / ml Wnt3A y 10 μM Y-27632 (inhibidor de ROCK).
    2. Agregue 20 μL de matriz gel-matriz LGSCM (gel de matriz: LGSCM = 1: 1) en el centro del pozo de una placa de 24 pocillos. Use una punta de pipeta para expandirla a un círculo (6-8 mm de diámetro) e incube la mezcla durante 20 min a 37 ° C para recubrir previamente el pozo.
    3. Utilice un contador celular para determinar el número de células y agregue 40 μL de LGSCM con un total de 1 × 104 células en 40 μL del gel de matriz. Mézclelos suavemente con una pipeta para obtener una mezcla de gel de matriz-LGSCM (gel de matriz: LGSCM = 1: 1).
    4. Use una pipeta para dejar caer cuidadosamente 80 μL de la mezcla sobre el área prerecubierta en cada pocillo de la placa de 24 pocillos en el paso 1.3.2.
    5. Incubar la mezcla durante 20 min a 37 °C y añadir 600 μL de LGSCM.
    6. Cambie el medio de cultivo en cada pozo una vez cada dos días. Después de 7 días de cultivo, busque esferas LGSC que tengan un diámetro de 100-300 μm bajo el microscopio invertido (ocular: 10x, objetivo: 4x).
      NOTA: Las LGSC se pueden cultivar durante más de 14 días en total.
  4. Aislar y cultivar LGSCs primarios de ratones ROSA26mT/mG y ratones DED (NOD/ShiLtJ) siguiendo los pasos descritos anteriormente.

2. Mantenimiento y paso lgSC

  1. Eliminar bien el medio de cultivo de la esfera de cultivo.
  2. Desagregar las esferas LGSC cultivadas durante 7 días mediante incubación en 20 μL de 10 U/mL de dispasa y 100 μL de 10 mM PBS durante 30 min a 37 °C.
  3. Transfiera la suspensión a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrífuga a 150 × g durante 4 min. Retire el sobrenadante.
  4. Tratar las esferas con 1 ml de tripsina-EDTA al 0,05% durante 5 min a 37 °C. Agregue 1 ml de inhibidor de tripsina (TI) al 0.05% y pipetee repetidamente para neutralizar la tripsina y disociar las esferas en células individuales.
  5. Centrifugar a 150 × g durante 5 min y retirar el sobrenadante para obtener LGSCs en el pellet. Agregue 1 ml de LGSCM para resuspendir el pellet LGSC.
  6. Coloque las celdas individuales como se describe en los pasos 1.3.1 a 1.3.6.

3. Diferenciación LGSC

  1. Procedimiento 1: Extender el tiempo de cultivo de lgsCs de 7 a 14 días con el sistema de cultivo LGSC para diferenciación aleatoria.
  2. Procedimiento 2: Cambiar la proporción de la mezcla de gel de matriz-LGSCM de 1:1 a 1:2 al comienzo del cultivo LGSC para la diferenciación de células ductales. Sembrar los LGSC en la matriz para la inducción durante 14 días (consulte el paso 1.3).
  3. Procedimiento 3: Después del paso, reemplace el LGSCM con la mezcla de suero bovino fetal (FBS) LGSCM-10% para la diferenciación de las células acinares. Inducir la diferenciación durante 14 días.

4. Deshidratación del tejido LG

  1. Obtenga tejidos LG (paso 1.1.1) y enjuague los GL con 4 ml de solución estéril de PBS de 10 mM en un plato de 6 cm durante 2 min. Mueva los tejidos a una solución de formalina al 10% para su fijación durante 24 h.
  2. Enjuague los tejidos fijos con PBS de 10 mM durante 2 minutos para eliminar la formalina y transfiera el tejido a una caja de incrustación de tejido. Coloque la caja de incrustación en el deshidratador automático.
  3. Utilice el deshidratador automático para deshidratar los tejidos de la siguiente manera: 70% de etanol, 2 h; 80% etanol, 2 h; 90% etanol, 30 min; 95% etanol, 30 min; etanol absoluto, 30min; etanol absoluto, 2 h; etanol absoluto: mezcla 100% xileno (1: 1), 30 min; 100% xileno, 30 min; 100% xileno, 2 h; 100% xileno: mezcla de parafina (1: 1), 30 min; parafina, 2 h; parafina, 3 h.

5. Deshidratación de organoides/esferas LG

  1. Obtenga organoides/esferas LG (pasos 2.1-2.3) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y enjuague los organoides/esferas LG con 1 ml de solución estéril de PBS de 10 mM durante 2 min.
  2. Centrifugar a 100 × g durante 1 min y retirar el sobrenadante.
  3. Prepare la solución de paraformaldehído al 4% (PFA) de la siguiente manera: agregue 20 g de PFA a una mezcla de 400 ml de PBS de 10 mM y 40 μL de 1 M de NaOH, agite bien la solución y caliéntela en un baño de agua de 65 ° C durante 2 h hasta que el PFA se disuelva por completo. Después de enfriar a temperatura ambiente, use PBS de 10 mM para compensar el volumen a 500 ml y guárdelo a 4 ° C.
  4. Agregue 1 ml de PFA al 4% en el tubo de la microcentrífuga con el gránulo organoide/esfera y coloque el tubo en un refrigerador de 4 °C durante al menos 24 h para su fijación.
  5. Después de la fijación, centrífuga a 100 × g durante 1 min y retire el sobrenadante. Agregue 1 ml de PBS de 10 mM en el tubo de la microcentrífuga con el gránulo organoide/esfera y mezcle suavemente mediante pipeteo durante 2 minutos para enjuagar el PFA. Repita este paso dos veces.
  6. Centrifugar a 100 × g durante 1 min y retirar el sobrenadante.
  7. Hidrogel de incrustación de calor para disolver y agregar 50-60 μL de hidrogel de incrustación al pellet organoide/esfera y mezclar. Pipetear la mezcla sobre la parapelícula en forma de gota y espere 5 minutos para que se solidifique a temperatura ambiente.
  8. Deshidrate el gel con los organoides/esferas en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de la siguiente manera.
    1. Agregue 1 ml de etanol al 50% al tubo, espere 30 minutos a temperatura ambiente y retire el líquido del tubo mediante pipeteo. Repita este paso cambiando la concentración de etanol a 70%, 80%, 90%, 95% sucesivamente.
    2. Agregue 1 ml de etanol absoluto al tubo, espere 30 minutos a temperatura ambiente y retire el líquido del tubo mediante pipeteo. Repita este paso.
    3. Agregue 1 ml de una mezcla de 0,5 ml de etanol absoluto y 0,5 ml de xileno 100% al tubo, espere 30 minutos a temperatura ambiente y retire el líquido del tubo mediante pipeteo.
    4. Agregue 1 ml de xileno 100% al tubo, espere 30 minutos a temperatura ambiente y retire el líquido del tubo mediante pipeteo. Repita este paso.
      NOTA: Los pasos 5.8.5-5.8.6 deben realizarse en un baño de metal a 65 °C.
    5. Agregue 1 ml de una mezcla de 0,5 ml de parafina y 0,5 ml de xileno al tubo, espere 30 min a 65 °C y retire el líquido del tubo mediante pipeteo.
    6. Agregue 1 ml de parafina al tubo, espere 30 minutos a 65 ° C y retire el líquido del tubo mediante pipeteo. Repita este paso y extienda el tiempo de procesamiento a 1 h.

6. Incrustación y seccionamiento de parafina

  1. Incrustación de parafina
    1. Antes de incrustar, encienda la máquina de incrustación y precaliente para derretir la cera de parafina en el tanque de parafina.
    2. Coloque el tejido deshidratado o el gel organoide/esfera en la ranura de la caja de hierro incrustante y coloque la caja de hierro en la parafina de la máquina de incrustación.
    3. Retire la tapa de plástico y coloque la caja de incrustación de plástico en la caja de hierro para cubrirla. Mueva la caja de hierro incrustante a una mesa de enfriamiento.
    4. Después de que la parafina se haya condensado en bloques en la caja de incrustación, retírela de la caja de hierro y córtela directamente o guárdela temporalmente en un refrigerador de 4 ° C.
  2. Seccionamiento de parafina
    1. Antes de cortar parafina, preensamble la cortadora de parafina y agregue agua destilada al fregadero de la cortadora para precalentarla. Comience a cortar cuando la temperatura del agua aumente a 42 ° C.
    2. Fije la muestra en la ranura de muestra de la cortadora de parafina. Ajuste el grosor de la sección a 5 μm durante el corte.
    3. Seccionar la muestra continuamente. Fije la sección completamente embaldosada en la corredera antideslizante en el tanque de la cortadora.
    4. Después de la sección, coloque los portaobjetos fijados con tejido de muestra en una incubadora bioquímica a 37 °C para secar durante 24 h. Guarde temporalmente los toboganes en un refrigerador a 4 °C.

7. Tinción de hematoxilina y eosina

  1. Derretir las secciones de parafina a 60 °C durante 30 min, remojar las secciones en 100% xileno durante 15 min y repetir.
  2. Trate las secciones con etanol absoluto en un agitador durante 5 min.
  3. Trate las secciones con 90% de etanol, 80% de etanol y 70% de etanol en un agitador, cada uno durante 3 min.
  4. Tratar las secciones con agua desionizada en una coctelera durante 5 min y 2 min sucesivamente.
  5. Manche las secciones en una caja húmeda durante 5 min con 4 mg/ml de solución de hematoxilina. Enjuague las secciones en agua corriente durante 10 min.
  6. Agitar las secciones en un agitador primero con agua desionizada durante 2 min y luego con 0.5% -1% de eosina durante 1 min.
  7. Agitar las secciones con 70% de etanol, 80% de etanol y 90% de etanol en un agitador durante 3 min (cada uno) sucesivamente. Agitar las secciones con etanol absoluto en un agitador durante 5 min.
  8. Remoje las secciones en 100% xileno durante 15 min y repita el remojo.
  9. Use una pipeta o gotero para agregar 3-4 gotas de bálsamo neutro a la diapositiva y cúbrala lentamente con una diapositiva de cubierta. Seque al aire los toboganes a temperatura ambiente.

8. Tinción inmunohistoquímica (IHC)

  1. Derrita las secciones de parafina a 60 °C durante 30 min, remoje las secciones en 100% xileno durante 10 min y repita este paso dos veces.
  2. Agite las secciones en un agitador primero con etanol absoluto, etanol al 90% y etanol al 80% durante 2 minutos (cada uno), sucesivamente, y luego con agua desionizada durante 3 minutos. Repita la agitación con agua desionizada dos veces.
  3. Agitar las secciones en un agitador primero con una mezcla de 20 mL de 30% H2O2 y 180 mL de metanol durante 10 min y luego agua desionizada durante 5 min. Repita este paso tres veces.
  4. Transfiera las secciones al tampón de ácido cítrico precocido (1 L de agua desionizada con 3 g de Na3C6H5O7.2H 2O y 0.4 g C6H8O7, pH 6.0), microondas durante 10 min para mantenerlas en el punto de ebullición subcrítico y enfríe a temperatura ambiente durante 30 min. Agitar las secciones con agua desionizada en una coctelera durante 5 min. Repita este paso tres veces.
  5. Agite las secciones con PBS de 10 mM en una coctelera durante 5 minutos y repita este paso tres veces. Encierre el área de tejido en la caja húmeda con un marcador repelente al agua, agregue una gota de suero de cabra no inmune listo para usar para cubrir las muestras y colóquelas a temperatura ambiente durante 1 h.
  6. Retire el suero, agregue anticuerpos primarios a las muestras (consulte la Tabla de materiales) e incube durante la noche a 4 ° C. Retire el anticuerpo primario, agite las secciones con PBS de 10 mM en un agitador durante 5 minutos y repita este paso de agitación con PBS de 10 mM tres veces.
  7. Agregue anticuerpos secundarios (consulte la Tabla de materiales) para cubrir las muestras e incube en una caja húmeda durante 30 minutos a temperatura ambiente. Agite las secciones con PBS de 10 mM en un agitador durante 5 minutos y repita el paso de agitación tres veces.
  8. Agregue la solución recién preparada de 0.03-0.05% de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) para cubrir las muestras en la caja húmeda y manchar durante 30-90 s. Enjuague las secciones con agua corriente durante 10 min.
    NOTA: Controle el tiempo de tinción observando bajo un microscopio de luz hasta que aparezca el color amarillo.
  9. Agregue 4 mg/ml de solución de hematoxilina para cubrir las muestras, manche durante 5 minutos en una caja húmeda y enjuague las secciones con agua corriente durante 10 min.
  10. Agitar las secciones en un agitador con 80% de etanol, 90% de etanol y etanol absoluto durante 2 min cada uno, sucesivamente, y remojar las secciones en 100% de xileno durante 30 min.
  11. Use una pipeta o gotero para agregar 3-4 gotas de bálsamo neutro a la diapositiva y cúbrala lentamente con una diapositiva de cubierta. Seque al aire los toboganes a temperatura ambiente.

9. Tinción global de inmunofluorescencia de organoides/esferas

NOTA: Recoja los organoides/esferas fijados con una solución de PFA al 4% en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (consulte los pasos 5.1 a 5.4). Realice el etiquetado de fluorescencia de la siguiente manera.

  1. Deshidrate los organoides/esferas añadiendo 1 ml de solución de sacarosa al 30% al tubo e incube durante la noche en un refrigerador a 4 °C.
  2. Añadir 100 μL de solución de PBST (solución de PBS de 10 mM con Tritón X-100 al 0,1%) al tubo para enjuagar los organoides/esferas durante 5 min, centrifugar el tubo a 100 × g durante 1 min, y recoger el pellet. Repita este paso tres veces.
  3. Agregue 0.5-1 ml de suero de cabra no inmune listo para usar al tubo y séllelo a temperatura ambiente durante 1 h. Centrifugar el tubo a 100 × g durante 1 min y recoger el pellet.
  4. Agregue varias gotas de anticuerpo primario diluido para cubrir el pellet e incubar en un refrigerador a 4 ° C durante 48 h. Centrifugar el tubo a 100 × g durante 1 min y recoger el pellet.
  5. Repita el paso 9.2.
  6. Agregue varias gotas de un anticuerpo secundario fluorescente y una solución de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) al tubo para cubrir el pellet e incubar en un refrigerador a 4 °C durante 24 h, evitando la luz.
  7. Repita el paso 9.2, evitando la luz.
  8. Añadir 100 μL de solución de PBST al tubo y almacenarlo temporalmente en un frigorífico de 4 °C, lejos de la luz. Observe y fotografíe los organoides/esferas utilizando el microscopio de barrido de láminas de luz.

10. Transfección LGSC pLX-mCherry

NOTA: La producción de partículas lentivirales debe realizarse en un gabinete de bioseguridad y un banco limpio a nivel de bioseguridad BSL2.

  1. Cultive la célula de empaquetamiento del lentivirus 293T en una placa de 6 pocillos con DMEM + 10% FBS a 37 °C, 5% CO2 durante 3-5 días para alcanzar el 80% de confluencia celular.
  2. Transfectar el vector de lentivirus pLX-mCherry en LGSCs.
    NOTA: La preparación del reactivo está indicada para un pocillo de una placa de 6 pocillos.
    1. Prepare dos tubos centrífugos estériles de 1,5 ml y agregue 250 μL de DMEM/F12 a cada tubo.
    2. Agregue 7.5 μL de reactivo de transfección a un tubo y mezcle bien el reactivo mediante pipeteo.
    3. Añadir 2 μg de plásmido pLX-mCherry sin endotoxina y plásmido de empaquetamiento de lentivirus en otro tubo, y añadir el reactivo de transfección (2 μL/μg de plásmido).
    4. Mezcle el líquido en ambos tubos de centrífuga y deje reposar las mezclas durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    5. Retire el medio de cultivo de las células 293T y agregue la mezcla desde el paso 10.2.4 hasta las células 293T. Cambie el medio de cultivo a DMEM fresco + 10% FBS después de 8 h.
    6. Después de 48 h, recoja el sobrenadante del virus por primera vez y filtre a través de un filtro de 0,45 μm. Después de 72 h, recoja el sobrenadante del virus por segunda vez y filtre a través de un filtro de 0,45 μm nuevamente.
      NOTA: Guarde ambos sobrenadantes filtrados en hielo hasta la transducción del lentivirus.
  3. Obtenga los LGSC de ratones DED (NOD/ShiLtJ) (consulte el paso 1).
  4. Agregue 1 ml del sobrenadante premontado pLX-mCherry lentivirus para resuspend las células.
  5. Coloque el tubo de la centrífuga en un agitador en la incubadora de CO2 a 37 °C. Agítelo a 100 rpm para maximizar el contacto entre el lentivirus y las células. Después de 8 h, centrifugar la mezcla a 250 × g durante 4 min y retirar el sobrenadante.
  6. Añadir 1 ml de DMEM/F12 para resuspendir el pellet celular. Utilice un contador celular para determinar el número de células y sembrar un total de 1 × 104 células en 100 μL de matriz gel-LGSCM (gel de matriz: LGSCM = 1:1) en cada pocillo de una placa de 24 pocillos precubierta con 20 μL de matriz gel-LGSCM (ver paso 1.3.2).
  7. Después de 7 días de cultivo (ver paso 1), seleccione esferas que exhiban fluorescencia roja bajo un microscopio de fluorescencia para expandir el cultivo.

11. Trasplante ortotópico LGSC

NOTA: Todas las operaciones quirúrgicas se realizan en una sala de operaciones de SPF y todos los instrumentos quirúrgicos se esterilizan.

  1. Obtener las esferas LGSC de ratones ROSA26mT/mG con fluorescencia roja (td-Tomate) o transfección mCherry cultivada durante 7 días (ver paso 1).
  2. Enfríe un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga una mezcla 1:1 de gel de matriz y DMEM/F12 sobre hielo antes de usarlo. Digiera las esferas LGSC en células individuales y resuspenda las células a una densidad de 2 × 106 células / ml en el tubo.
  3. Anestesiar a los ratones NOD/ShiLtJ mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg).
    NOTA: El ratón NOD / ShiLtJ es un modelo ideal con síntomas idiopáticos añadidos, que incluyen secreción lagrimal reducida, infiltración inflamatoria y ulceración orbitaria.
  4. Después de la anestesia, use solución salina o ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad, y luego use tijeras oftálmicas para hacer un corte de 5-8 mm en la piel detrás de la oreja (cerca del ojo) de los ratones anestésicos para exponer los GL.
    NOTA: El yodóforo debe usarse estrictamente para la desinfección alrededor de la incisión.
  5. Inyecte 2 × 104 celdas en el LG del lado izquierdo e inyecte la mezcla sin células (consulte el paso 11.2) en el LG del lado derecho como control.
  6. Después de la inyección, restaure los LG a sus posiciones originales con fórceps oftálmicos y suture la herida. Alimente a los ratones durante 2 meses y observe el efecto del tratamiento.
    NOTA: El material del cojín de la jaula también debe esterilizarse estrictamente después de la operación, y el material del cojín debe reemplazarse una vez al día. Después de suturar la herida, el tramadol se puede inyectar selectivamente en la vena de la cola de los ratones a la dosis estándar de 2,5 mg / kg para lograr la analgesia.
  7. Anestesiar a estos ratones 2 meses después del experimento (ver paso 11.3). Filmar los síntomas de la región ocular.
    1. Durante la anestesia, busque los siguientes síntomas: relajación muscular del cuello y las extremidades; respiración profunda, lenta y constante; estrechamiento de la pupila; desaparición del reflejo corneal.
    2. Durante la anestesia y la operación, mantenga la temperatura corporal de los ratones a 37 ° C. Después de la cirugía, agregue antibióticos apropiados al agua potable para ratones para reducir el riesgo de infección de la herida. No deje a los ratones desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la reclinación esternal. No devuelva los ratones que se han sometido a cirugía a la compañía de otros ratones hasta que se recuperen por completo.
    3. Después de filmar los síntomas de la región ocular, abra el software ImageJ, haga clic en Archivo | Abrir | Selecciones a mano alzada, mantenga presionado el botón izquierdo del mouse y seleccione el área de ulceración orbitaria en la imagen. Haga clic en Analizar | Medida para obtener el área relativa de ulceración.
  8. Coloque el hilo de algodón rojo fenol en el canto lateral de los ratones anestésicos durante 10 s; medir y registrar la longitud de la parte descolorida del hilo de algodón. Eutanasiar a los ratones por dislocación de la vértebra cervical después de la medición del desgarro.
  9. Diseccionar los ratones y obtener los LGs para el análisis de IHC.

12. Aislamiento de ARN

NOTA: Antes del experimento, preenfríe la centrífuga a 4 °C y garantice que todos los reactivos y consumibles estén libres de contaminación por RNAse.

  1. Recoja LGSC o fragmentos de LG en un tubo de microcentrífuga. Agregue 1 ml de tampón de lisis celular y lisar completamente las células o tejidos por oscilación de vórtice.
  2. Agregue 0.2 ml de cloroformo y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos después de la oscilación del vórtice durante 1 minuto. Centrifugadora durante 15 min a 4 °C, 12.000 × g.
    NOTA: Después de la centrifugación, el líquido se divide en tres capas, y el ARN se encuentra en la fase acuosa transparente superior.
  3. Pipetee cuidadosamente la fase acuosa transparente superior y transfiérala a un nuevo tubo de centrífuga libre de RNAse de 1,5 ml.
  4. Añadir un volumen igual de alcohol isopropílico y mezclar suavemente. Deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 min y luego centrífuga durante 15 min a 4 °C, 12.000 × g.
  5. Retire el sobrenadante y agregue 1 ml de etanol al 75%. Invierta el tubo para lavar el pellet y centrífuga durante 5 min a 4 °C, 7.500 × g. Repita este paso.
  6. Retire el sobrenadante con cuidado y coloque el tubo de la centrífuga en el banco de trabajo ultralimpio para secarlo durante unos 20 minutos.
    NOTA: Continúe con el siguiente paso cuando el pellet blanco se vuelva translúcido. Realizar todas las operaciones sobre hielo.
  7. Agregue 20 μL de agua libre de RNAse para disolver el pellet por completo. Mida la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro (consulte la Tabla de materiales) y almacene la solución de ARN a -80 °C.

13. PCR

  1. Reacción de transcripción inversa
    1. Añadir 1 μg de ARN total (calcular el volumen de la solución de ARN añadida según la concentración de la solución de ARN) en el tubo de reacción de PCR e incubar a 65 °C durante 5 min para la desnaturalización.
    2. Póngalo en hielo durante 1 minuto y luego agregue agua libre de enzimas hasta que el volumen total alcance los 12 μL. Agregue 4 μL de 4x DNA Master Mix e incube a 37 ° C durante 5 min.
    3. Coloque el tubo en hielo, agregue 4 μL de 5x RT Master Mix y mézclelo suavemente. Ajuste los siguientes ajustes de PCR: 37 °C durante 15 min, 50 °C durante 5 min, 98 °C durante 5 min, 4 °C durante 1 min.
    4. Guárdelo a -20 °C o continúe con el siguiente paso después de que se complete la reacción de transcripción inversa.
  2. Reacción por PCR
    1. Prepare la reacción de PCR en el tubo de PCR de la siguiente manera: 14,1 μL de agua libre de enzimas, 2 μL de dNTP, 2 μL de 10x Buffer, 0,8 μL de Primer (10 μM, 0,4 μL de Forward Primer y 0,4 μL de Reverse Primer, consulte la Tabla de Materiales), 1 μL de cDNA de transcripción inversa (consulte el paso 13.1) y 0.1 μL de enzima Taq.
    2. Coloque la reacción de PCR preparada en el aparato de PCR para PCR. Consulte las instrucciones del kit de enzimas Taq para el procedimiento de PCR (consulte la Tabla de materiales).
  3. Electroforesis en gel de agarosa
    1. Utilice una balanza analítica para pesar 242 g de Tris y 37,2 g de Na2EDTA·2H2O y agréguelos a un vaso de precipitados de 1 L. Agregue ~ 800 ml de agua desionizada y 57.1 ml de ácido acético glacial al vaso de precipitados, mezcle bien, agregue agua desionizada a 1 L para obtener un tampón TAE 50x y guárdelo a temperatura ambiente.
      NOTA: Diluya el tampón TAE 50x con agua desionizada antes de su uso.
    2. Utilice una balanza analítica para pesar 1,2 g de agarosa y agréguela a un matraz cónico que contenga 80 ml de 1 tampón TAE. Calentar repetidamente en el horno de microondas hasta que se disuelva por completo.
    3. Enfríe el matraz con agua corriente del grifo hasta que la temperatura de la solución baje a 60 °C. Agregue 8 μL de tinción de ácido nucleico, vierta la solución en el tanque gelatinizante después de mezclar bien, coloque el peine y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 30 min.
    4. Saque el peine y cargue los productos de PCR en el gel de agarosa preparado. Realizar electroforesis a 120 V durante 30 min.
    5. Coloque el gel en el sistema de imágenes ECL Gel y fotografíe.

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Resultados

Establecer un sistema de cultivo 3D sin suero
En este estudio, se desarrolló LGSCM que contiene EGF, Wnt3A, FGF10 e Y-27632 para LGSC de ratón, y los LGSC se aislaron y cultivaron con éxito mediante un método de cultivo 3D (Figura 1A). Un exitoso sistema de cultivo 3D, libre de suero de LGSCs de ratones C57BL / 6, ratones NOD / ShiLtJ, ratones BALB / c y ratones ROSA26mT / mG se ha establecido utilizando este método16. Para un ratón mach...

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Discusión

Existen métodos bien establecidos para el aislamiento y el cultivo in vitro de células madre lagrimales para el cultivo de células madre lagrimales y la reparación de lesiones LG. Shatos et al.17 y Ackermannet al. 6 células madre lagrimales cultivadas y subcultivadas con éxito de ratas y ratones mediante métodos de cultivo 2D, respectivamente, lo que permite trasplantar células madre lagrimales para el tratamiento del TDA. Los estudios sobre células madre<...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 31871413) y dos Programas de Ciencia y Tecnología de Guangdong (2017B020230002 y 2016B030231001). Estamos realmente agradecidos a los investigadores que nos han ayudado durante el estudio y a los miembros del personal que trabajan en el centro de animales por su apoyo en el cuidado de los animales.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Animal (Ratón)
Bal B/CCentro de Investigación de Animales Modelo de la Universidad
C57 BL/6JCentro de Animales de Laboratorio de la Universidad
NOD/ShiLtJCentro de Investigación de Animales Modelo de la Universidad
ROSA26mT/mGCentro de Investigación de Animales Modelo de la Universidad
Equipo
Balanza analíticaSartorius
deThermo
BLAU
Contador de célulasCountStar
CO2 incubadora de temperatura constanteThermo
ECL Sistema de imagen en gelGE healthcare
Baño eléctrico para baño de aguaYiheng Technology
Aparato de electroforesisBioRad
Fluorescencia instrumento de PCR cuantitativoRoche
Frozen Tissue SlicerCentrífuga horizontal Lecia
CENCE
Microscopio de fluorescencia invertidaNikon
Microscopio invertidoOlympus
Micrografía láser de barrido laminarCarl Zeiss Contenedor de
nitrógeno líquidoThermo
Baja temperatura alta centrífuga de velocidadEppendorf
MicropipetaGilson
Horno de microondasPanasonic
Espectrofotómetro ultravioleta NanodropMedición térmicala concentración
Máquina de corte de parafinaAmplificador Thermo
PCREppendorf
Comprobador de valores de pHSartorius
4 ° C RefrigeradorHaier
Oscilador termostático de cultivoZHICHENG
Instrumento de inclusión de parafina tisularThermo
 -80° C Refrigerador de temperatura ultrabajaThermo
 -20° C Refrigerador de temperatura ultrabajaThermo
Sistema de purificación de agua ultrapuraELGA
u>Reactivo
Animal Experiment
HCGSigma9002-61-3
PMSGSigma14158-65-7
Pentobarbital SódicoSigma57-33-0
B27Gibco17504044
Colagenasa IGibco17018029
DispasaBD 354235
DMEMSigmaD6429
DMEM/F12SigmaD0697
DMSO Sigma67-68-5
EDTASangon BiotechA500895
Suero Fetal BovinoGibco04-001-1ACS
GlutaMaxGibco35050087
Humano FGF10PeproTech100-26
Matrigel (Gel de matriz)BD356231
Murine NogginPeproTech250-38
Murine Wnt3APeproTech315-20
Murine EGFPeproTech315-09
NEAAGibco11140050
N2Gibco17502048
R-espondina 1PeproTech120-38
Inhibidor de tripsina (TI)SigmaT6522Derivado de Glycine max; puede inhibir la tripsina, la quimotripsina y la plasminasa en menor medida. Un mg inhibirá 1.0-3.0 mg de tripsina.
TripsinaSigma  T4799
Y-27632SelleckS1049
HE tinción & Inmunotinción
Alexa Fluor 488 burro anti-ratón IgG ThermoA-21202Dilución utilizada: IHC) 2 μ g/mL, (IF) 0,2 μ g/mL
Alexa Fluor 488 burro anti-Conejo IgG ThermoA-21206Dilución utilizada: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 2 μ g/mL
Alexa Fluor 568 burro anti-ratón IgG ThermoA-10037Dilución utilizada: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 2 μ g/mL
Alexa Fluor 568 burro anti-Conejo IgG ThermoA-10042Dilución utilizada: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 4 μ g/mL
Anticuerpo anti-AQP5 contra conejosAbcamab104751Dilución utilizada: (IHC) 1 μ g/mL, (IF) 0,1 μ g/mL
Anticuerpo anti-E-cadherina RataAbcamab11512Dilución utilizada: (IF)  5 μ g/mL
Anti-Queratina14 anticuerpo de conejoAbcamab181595Dilución utilizada: (IHC) 1 μ g/mL, (IF) 2 μ g/mL
Anticuerpo anti-Ki67 contra conejosAbcamab15580Dilución utilizada: (IHC) 1 μ g/mL, (IF) 1 μ g/mL
Anticuerpo anti-mCherry ratónAbcamab125096Dilución utilizada: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 2 μ g/mL
Anticuerpo anti-mCherry conejoAbcamab167453Dilución utilizada: (IF)  2 μ g/mL
C6H8O7Sangon BiotechA501702-0500
Ácido cítricoSangon Biotech201-069-1
DAB Kit (20x)CWBIO CW0125
DAPIThermo62248
EosinBASO68115
Montaje fluorescente MedioDakoS3023
FormalinaSangon BiotechA501912-0500
Cabra anti-Ratón Anticuerpo IgG (HRP)Abcamab6789Dilución utilizada: 2 μ g/mL
Anticuerpo IgG anti-Conejo de Cabra (HRP)Abcamab6721Dilución utilizada: 2 μ g/mL
HematoxilinaBASO517-28-2
Histogel (Hidrogel de incrustación)ThermoHG-400-012
30% H2O2Guangzhou QuímicaKD10
30% Solución de peróxido de hidrógenoGuangzhou Química7722-84-1
MetanolGuangzhou Química67-56-1
Na3C6H5O7.2H2OSangon BiotechA501293-0500
Bálsamo neutroSHANGHAI YIYANGYY-Bálsamo
Suero de cabra no inmunizadoBOSTERAR0009
ParafinaSangon BiotechA601891-0500
ParaformaldehídoDAMAO200-001-8
SacarosaGuangzhou Química57-50-1
Citrato de sodio tribásico dihidratadoSangon Biotech200-675-3
SacarosaGuangzhou QuímicaIB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. CompuestoSAKURASAKURA.4583
Tritón X-100DINGGUO9002-93-1
XilenoGuangzhou Química128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
AgaroseSigma9012-36-6
AlcoholGuangzhou Química64-17-5
CloroformoGuangzhou Química865-49-6
Bromuro de etidioSangon Biotech214-984-6
Alcohol isopropílicoGuangzhou Química67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master MixRoche488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master MixTOYOBO-Taq
ADN polimerasaTAKARAR10T1
Goldview (ácido nucleico tinción)BioSharpBS357A
TRIzolMagenR4801-02
Construcción vectorial & Transfección celular
OXID-Ampicilina
Sigma69-52-3
CloranfenicolSigma56-75-7
Kit de extracción de plásmidos sin endotoxinasThermoA36227
KanamycinSigma25389-94-0
Lipo3000 Plásmido Kit de transfecciónThermoL3000015
LR Kit de reacciónThermo11791019
Kit de extracción de plásmidosTIANGENDP103
Trans5α Célula químicamente competenteTRANSGENCD201-01
TrytoneOXID-Extractode
levaduraOXID<
fuerte>Primers y secuenciaEmpresa
Imprimación: AQP5
Secuencia:
F: CATGAACCCAGCCCGATCTT
R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC		Synbio Tech
Primer: β-actin
Sequence:
F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTT		Synbio Tech
Primer: Epcam
Sequence:
F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT
R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG		Synbio Tech
Primer: Krt5
Sequence:
F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG
R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC		Synbio Tech
Primer: Krt14
Sequence:
F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA
R: GCCACCTCCGTGGTTC		Synbio Tech
Primer: Krt19
Sequence:
F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG
R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT		Synbio Tech
Primer: Ltf
Sequence:
F: CACATGCTGTCGTCGTCCCCGA
R: CGATGCCCTGATGGACGA		Synbio Tech
Primer: Nestin
Sequence:
F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC
R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT		Synbio Tech
Primer: P63
Sequence:
F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA
R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC		Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus vector sin cargaAddgene
pENRTY-mCherryLaboratorio Xiaofeng Qin, Universidad
de NanjingSun Yat-sende Nanjing de Nanjing Deshidratador automático Cámara de recuento sangre de de ARN<neutro Sun Yat-sen

Referencias

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