El método tridimensional de cultivo sin suero para células madre adultas de la glándula lagrimal (LG) está bien establecido para la inducción de la formación y diferenciación de organoides LG en células acinares o similares a las ductales.
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Artículo de método
Sistema de cultivo tridimensional sin suero para células madre de la glándula lagrimal
En este artículo
Resumen
Resumen
La terapia basada en células madre de la glándula lagrimal (LG) es una estrategia prometedora para las enfermedades de la glándula lagrimal. Sin embargo, la falta de un método de cultivo confiable y libre de suero para obtener un número suficiente de células madre LG (LGSC) es un obstáculo para futuras investigaciones y aplicaciones. El método de cultivo tridimensional (3D), libre de suero para LGSC de ratones adultos está bien establecido y se muestra aquí. Las LGSC podrían ser continuamente pasajeras e inducidas a diferenciarse a células acinares o similares a las ductales.
Para el cultivo primario lgsc, los LGs de ratones de 6-8 semanas de edad fueron digeridos con dispasa, colagenasa I y tripsina-EDTA. Un total de 1 × 104 células individuales fueron sembradas en 80 μL de matriz de células madre de células madre de gel-glándula lagrimal (LGSCM) en cada pocillo de una placa de 24 pocillos, precubierta con 20 μL de matriz gel-LGSCM. La mezcla se solidificó después de la incubación durante 20 min a 37 °C, y se agregaron 600 μL de LGSCM.
Para el mantenimiento de LGSC, los LGSC cultivados durante 7 días se desagregaron en células individuales por dispasa y tripsina-EDTA. Las células individuales fueron implantadas y cultivadas de acuerdo con el método utilizado en el cultivo primario LGSC. Las LGSC podrían pasar más de 40 veces y expresar continuamente los marcadores de células madre/progenitoras Krt14, Krt5, P63 y nestina. Las LGSC cultivadas en LGSCM tienen capacidad de autorrenovación y pueden diferenciarse en células acinares o ductales in vitro e in vivo.
Introducción
Las células madre de la glándula lagrimal (LGSC) mantienen la renovación celular de la glándula lagrimal (LG) y son la fuente de células acinares y ductales. Por lo tanto, el trasplante lgsc se considera un enfoque alternativo para tratar el daño inflamatorio severo y la enfermedad del ojo seco con deficiencia acuosa (AÑAD)1,2,3. Se han aplicado varios métodos de cultivo para enriquecer LGSCs. Tiwari et al. separaron y cultivaron células primarias de LG utilizando colágeno I y gel de matriz complementado con varios factores de crecimiento; sin embargo, las células LG....
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Protocolo
Todos los experimentos en este protocolo siguieron las pautas de cuidado animal del Comité Ético de Ensayos con Animales de la Universidad Sun Yat-sen. Todas las operaciones relacionadas con la célula deben realizarse en el banco de trabajo ultralimpio en la sala de operaciones de la celda. Todas las operaciones con xileno deben llevarse a cabo en campanas extractoras.
1. Cultura primaria LGSC
- Aislamiento LG
- Obtenga un ratón macho BALB / c de 6 a 8 semanas de edad y corte la piel detrás de la oreja para exponer el LG y el tejido conectivo que lo rodea. Despegue el tejido conectivo mediante disección roma c....
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Resultados
Establecer un sistema de cultivo 3D sin suero
En este estudio, se desarrolló LGSCM que contiene EGF, Wnt3A, FGF10 e Y-27632 para LGSC de ratón, y los LGSC se aislaron y cultivaron con éxito mediante un método de cultivo 3D (Figura 1A). Un exitoso sistema de cultivo 3D, libre de suero de LGSCs de ratones C57BL / 6, ratones NOD / ShiLtJ, ratones BALB / c y ratones ROSA26mT / mG se ha establecido utilizando este método16. Para un ratón mach.......
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Discusión
Existen métodos bien establecidos para el aislamiento y el cultivo in vitro de células madre lagrimales para el cultivo de células madre lagrimales y la reparación de lesiones LG. Shatos et al.17 y Ackermannet al. 6 células madre lagrimales cultivadas y subcultivadas con éxito de ratas y ratones mediante métodos de cultivo 2D, respectivamente, lo que permite trasplantar células madre lagrimales para el tratamiento del TDA. Los estudios sobre células madre<.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 31871413) y dos Programas de Ciencia y Tecnología de Guangdong (2017B020230002 y 2016B030231001). Estamos realmente agradecidos a los investigadores que nos han ayudado durante el estudio y a los miembros del personal que trabajan en el centro de animales por su apoyo en el cuidado de los animales.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Animal (Ratón) | |||
| Bal B/C | Centro de Investigación de Animales Modelo de la Universidad | ||
| C57 BL/6J | Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad | ||
| NOD/ShiLtJ | Centro de Investigación de Animales Modelo de la Universidad | ||
| ROSA26mT/mG | Centro de Investigación de Animales Modelo de la Universidad | ||
| Equipo | |||
| Balanza analítica | Sartorius | ||
| de | Thermo | ||
| BLAU | |||
| Contador de células | CountStar | ||
| CO2 incubadora de temperatura constante | Thermo | ||
| ECL Sistema de imagen en gel | GE healthcare | ||
| Baño eléctrico para baño de agua | Yiheng Technology | ||
| Aparato de electroforesis | BioRad | ||
| Fluorescencia instrumento de PCR cuantitativo | Roche | ||
| Frozen Tissue Slicer | Centrífuga horizontal Lecia | ||
| CENCE | |||
| Microscopio de fluorescencia invertida | Nikon | ||
| Microscopio invertido | Olympus | ||
| Micrografía láser de barrido laminar | Carl Zeiss Contenedor de | ||
| nitrógeno líquido | Thermo | ||
| Baja temperatura alta centrífuga de velocidad | Eppendorf | ||
| Micropipeta | Gilson | ||
| Horno de microondas | Panasonic | ||
| Espectrofotómetro ultravioleta Nanodrop | Medición térmica | la concentración | |
| Máquina de corte de parafina | Amplificador Thermo | ||
| PCR | Eppendorf | ||
| Comprobador de valores de pH | Sartorius | ||
| 4 ° C Refrigerador | Haier | ||
| Oscilador termostático de cultivo | ZHICHENG | ||
| Instrumento de inclusión de parafina tisular | Thermo | ||
| -80° C Refrigerador de temperatura ultrabaja | Thermo | ||
| -20° C Refrigerador de temperatura ultrabaja | Thermo | ||
| Sistema de purificación de agua ultrapura | ELGA | ||
| u>Reactivo | |||
| Animal Experiment | |||
| HCG | Sigma | 9002-61-3 | |
| PMSG | Sigma | 14158-65-7 | |
| Pentobarbital Sódico | Sigma | 57-33-0 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Colagenasa I | Gibco | 17018029 | |
| Dispasa | BD 354235 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D0697 | |
| DMSO Sigma | 67-68-5 | ||
| EDTA | Sangon Biotech | A500895 | |
| Suero Fetal Bovino | Gibco | 04-001-1ACS | |
| GlutaMax | Gibco | 35050087 | |
| Humano FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| Matrigel (Gel de matriz) | BD | 356231 | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Murine Wnt3A | PeproTech | 315-20 | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| R-espondina 1 | PeproTech | 120-38 | |
| Inhibidor de tripsina (TI) | Sigma | T6522 | Derivado de Glycine max; puede inhibir la tripsina, la quimotripsina y la plasminasa en menor medida. Un mg inhibirá 1.0-3.0 mg de tripsina. |
| Tripsina | Sigma | T4799 | |
| Y-27632 | Selleck | S1049 | |
| HE tinción & Inmunotinción | |||
| Alexa Fluor 488 burro anti-ratón IgG Thermo | A-21202 | Dilución utilizada: IHC) 2 μ g/mL, (IF) 0,2 μ g/mL | |
| Alexa Fluor 488 burro anti-Conejo IgG Thermo | A-21206 | Dilución utilizada: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 2 μ g/mL | |
| Alexa Fluor 568 burro anti-ratón IgG Thermo | A-10037 | Dilución utilizada: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 2 μ g/mL | |
| Alexa Fluor 568 burro anti-Conejo IgG Thermo | A-10042 | Dilución utilizada: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 4 μ g/mL | |
| Anticuerpo anti-AQP5 contra conejos | Abcam | ab104751 | Dilución utilizada: (IHC) 1 μ g/mL, (IF) 0,1 μ g/mL |
| Anticuerpo anti-E-cadherina Rata | Abcam | ab11512 | Dilución utilizada: (IF) 5 μ g/mL |
| Anti-Queratina14 anticuerpo de conejo | Abcam | ab181595 | Dilución utilizada: (IHC) 1 μ g/mL, (IF) 2 μ g/mL |
| Anticuerpo anti-Ki67 contra conejos | Abcam | ab15580 | Dilución utilizada: (IHC) 1 μ g/mL, (IF) 1 μ g/mL |
| Anticuerpo anti-mCherry ratón | Abcam | ab125096 | Dilución utilizada: (IHC) 2 μ g/mL, (IF) 2 μ g/mL |
| Anticuerpo anti-mCherry conejo | Abcam | ab167453 | Dilución utilizada: (IF) 2 μ g/mL |
| C6H8O7 | Sangon Biotech | A501702-0500 | |
| Ácido cítrico | Sangon Biotech | 201-069-1 | |
| DAB Kit (20x) | CWBIO CW0125 | ||
| DAPI | Thermo | 62248 | |
| Eosin | BASO | 68115 | |
| Montaje fluorescente Medio | Dako | S3023 | |
| Formalina | Sangon Biotech | A501912-0500 | |
| Cabra anti-Ratón Anticuerpo IgG (HRP) | Abcam | ab6789 | Dilución utilizada: 2 μ g/mL |
| Anticuerpo IgG anti-Conejo de Cabra (HRP) | Abcam | ab6721 | Dilución utilizada: 2 μ g/mL |
| Hematoxilina | BASO | 517-28-2 | |
| Histogel (Hidrogel de incrustación) | Thermo | HG-400-012 | |
| 30% H2O2 | Guangzhou Química | KD10 | |
| 30% Solución de peróxido de hidrógeno | Guangzhou Química | 7722-84-1 | |
| Metanol | Guangzhou Química | 67-56-1 | |
| Na3C6H5O7.2H2O | Sangon Biotech | A501293-0500 | |
| Bálsamo neutro | SHANGHAI YIYANG | YY-Bálsamo | |
| Suero de cabra no inmunizado | BOSTER | AR0009 | |
| Parafina | Sangon Biotech | A601891-0500 | |
| Paraformaldehído | DAMAO | 200-001-8 | |
| Sacarosa | Guangzhou Química | 57-50-1 | |
| Citrato de sodio tribásico dihidratado | Sangon Biotech | 200-675-3 | |
| Sacarosa | Guangzhou Química | IB11-AR-500G | |
| Tissue-Tek O.T.C. Compuesto | SAKURA | SAKURA.4583 | |
| Tritón X-100 | DINGGUO | 9002-93-1 | |
| Xileno | Guangzhou Química | 128686-03-3 | |
| RT-PCR & qRT-PCR | |||
| Agarose | Sigma | 9012-36-6 | |
| Alcohol | Guangzhou Química | 64-17-5 | |
| Cloroformo | Guangzhou Química | 865-49-6 | |
| Bromuro de etidio | Sangon Biotech | 214-984-6 | |
| Alcohol isopropílico | Guangzhou Química | 67-63-0 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 488735200H | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO-Taq | ||
| ADN polimerasa | TAKARA | R10T1 | |
| Goldview (ácido nucleico tinción) | BioSharp | BS357A | |
| TRIzol | Magen | R4801-02 | |
| Construcción vectorial & Transfección celular | |||
| OXID-Ampicilina | |||
| Sigma | 69-52-3 | ||
| Cloranfenicol | Sigma | 56-75-7 | |
| Kit de extracción de plásmidos sin endotoxinas | Thermo | A36227 | |
| Kanamycin | Sigma | 25389-94-0 | |
| Lipo3000 Plásmido Kit de transfección | Thermo | L3000015 | |
| LR Kit de reacción | Thermo | 11791019 | |
| Kit de extracción de plásmidos | TIANGEN | DP103 | |
| Trans5α Célula químicamente competente | TRANSGEN | CD201-01 | |
| Trytone | OXID-Extracto | de | |
| levadura | OXID | < | |
| fuerte>Primers y secuencia | Empresa | ||
| Imprimación: AQP5 Secuencia: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC | Synbio Tech | ||
| Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTT | Synbio Tech | ||
| Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG | Synbio Tech | ||
| Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC | Synbio Tech | ||
| Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCGTGGTTC | Synbio Tech | ||
| Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT | Synbio Tech | ||
| Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTCGTCCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA | Synbio Tech | ||
| Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT | Synbio Tech | ||
| Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC | Synbio Tech | ||
| Vector | |||
| pLX302 lentivirus vector sin carga | Addgene | ||
| pENRTY-mCherry | Laboratorio Xiaofeng Qin, Universidad |
Referencias
- Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
- Gromova, A., et al.
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Reimpresiones y permisos
