Sistema de cultivo tridimensional sin suero para células madre de la glándula lagrimal

Las células madre de la glándula lagrimal (LGSC) mantienen la renovación celular de la glándula lagrimal (LG) y son la fuente de células acinares y ductales. Por lo tanto, el trasplante lgsc se considera un enfoque alternativo para tratar el daño inflamatorio severo y la enfermedad del ojo seco con deficiencia acuosa (AÑAD)^1,2,3. Se han aplicado varios métodos de cultivo para enriquecer LGSCs. Tiwari et al. separaron y cultivaron células primarias de LG utilizando colágeno I y gel de matriz complementado con varios factores de crecimiento; sin embargo, las células LG no pudieron ser cultivadas continuamente⁴. Utilizando cultivo bidimensional (2D), las células madre derivadas de LG de ratón fueron aisladas por You et ^al.5 y Ackermann et al. ⁶, se encontró que expresa los genes marcadores de células madre / progenitoras, Oct4, Sox2, Nanog y nestina, y podría ser subcultivado. Sin embargo, no hay indicios claros de que estas células puedan diferenciarse en células acinares o ductales, y no existe un experimento de trasplante para verificar el potencial de diferenciación in vivo.

Recientemente, las células c-kit⁺ dim/EpCAM⁺/Sca1^-/CD34^-/CD45^- se aislaron de LIG de ratón mediante citometría de flujo, se encontró que expresaban marcadores de células progenitoras LG, como Pax6 y Runx1, y se diferenciaron en conductos y acini in vitro. En ratones con ADD, la inyección ortotópica con estas células podría reparar las GL dañadas y restaurar la función secretora de las^{GL 2}. Sin embargo, el número de células madre aisladas por este método fue pequeño, y no hay condiciones de cultivo adecuadas para expandir las LGSC aisladas. En resumen, es necesario establecer un sistema de cultivo adecuado para aislar y cultivar eficazmente las LGSC adultas con expansión estable y continua para el estudio de las LGSC en el tratamiento de la ADICIÓN.

Los organoides derivados de células madre o células madre pluripotentes son un grupo de células que son histológicamente similares a los órganos relacionados y pueden mantener su propia renovación. Después de que el organoide del intestino de ratón fue cultivado con éxito por Sato et al. en 2009⁷, se cultivaron organoides de otros órganos en sucesión, según el sistema de cultivo de Sato, como la vesícula biliar⁸, el hígado⁹, el páncreas¹⁰, el estómago¹¹, la mama¹², el pulmón¹³, la próstata¹⁴ y la glándula salival¹⁵ . Debido a la alta proporción de células madre adultas antes de la diferenciación celular en cultivo organoide, el método de cultivo organoide tridimensional (3D) se considera óptimo para el aislamiento y cultivo de células madre adultas de LG.

En el presente estudio se estableció un sistema de cultivo LGSC de ratón adulto mediante la optimización del método de cultivo 3D, libre de suero. Está comprobado que las LGSC cultivadas tanto en ratones normales como en ratones ADDED mostraron una capacidad estable de autorrenovación y proliferación. Después del trasplante en los GL de ratón ADDED, los LGSC colonizaron los LGs deteriorados y mejoraron la producción de lágrimas. Además, se aislaron LGSC fluorescentes rojos de ratones ROSA26^mT/mG y se cultivaron. Este trabajo proporciona una referencia confiable para el enriquecimiento LGSC in vitro y el autoinjerto LGSC en aplicación clínica para la terapia CON ADD.

Todos los experimentos en este protocolo siguieron las pautas de cuidado animal del Comité Ético de Ensayos con Animales de la Universidad Sun Yat-sen. Todas las operaciones relacionadas con la célula deben realizarse en el banco de trabajo ultralimpio en la sala de operaciones de la celda. Todas las operaciones con xileno deben llevarse a cabo en campanas extractoras.

1. Cultura primaria LGSC

1. Aislamiento LG
   1. Obtenga un ratón macho BALB / c de 6 a 8 semanas de edad y corte la piel detrás de la oreja para exponer el LG y el tejido conectivo que lo rodea. Despegue el tejido conectivo mediante disección roma con la ayuda de pinzas y retire el LG.
   2. Enjuague los LG dos veces con 4 ml de solución estéril de PBS de 10 mM para eliminar la sangre en un plato de 6 cm. Sumergir los LGs en un plato de 6 cm con 4 mL de etanol al 75% durante 10 s y enjuagar con 10 mM PBS dos veces inmediatamente.
2. Obtener células individuales de LG
   1. Utilice la solución tampón HEPES (50 mM HEPES/KOH, pH 7.4; 150 mM NaCl en agua ultrapura) para preparar 25 U/mL de dispasa. Prepare la solución de colagenasa I al 0,1% con agua ultrapura.
   2. Cortar los LGs en pequeños fragmentos (aproximadamente 1 mm³), transferirlos a un tubo centrífugo estéril de 15 ml y tratar los tejidos con 500 μL de 25 U/mL de dispasa y 500 μL de colagenasa I al 0,1% durante 1 h a 37 °C.
   3. Utilice PBS de 10 mM para preparar la solución de tripsina-EDTA (0,05 g/L de tripsina, 0,04 g/L de EDTA). Trate los fragmentos de LG del paso 1.2.2 con 1 ml de tripsina-EDTA al 0,05% durante 10 min a 37 °C y disocie los fragmentos en células individuales mediante pipeteo repetidamente.
   4. Filtre la suspensión a través de un filtro de 70 μm, recoja el filtrado en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml y centrífuga a 150 × g durante 5 min.
   5. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante, agregue 10 ml de PBS de 10 mM para lavar el pellet celular y centrífuga la suspensión.
   6. Repita el paso 1.2.5, retire el sobrenadante y agregue 1 ml de DMEM/F12 (mezcla 1:1 del medio Eagle modificado de Dulbecco y el F-12 de Ham) para resuspendir los gránulos celulares.
3. Cultura primaria LGSC
   1. Prepare el medio de células madre de la glándula lagrimal (LGSCM) que contiene DMEM / F12, 1x suplemento de N2, 1x suplemento de B27, sustituto de glutamina de 2 mM, NEAA de 0.1 mM (aminoácidos no esenciales), factor de crecimiento epidérmico murino (EGF) de 50 ng / ml, factor de crecimiento de fibroblastos de 100 ng / ml 10 (FGF10), 10 ng / ml Wnt3A y 10 μM Y-27632 (inhibidor de ROCK).
   2. Agregue 20 μL de matriz gel-matriz LGSCM (gel de matriz: LGSCM = 1: 1) en el centro del pozo de una placa de 24 pocillos. Use una punta de pipeta para expandirla a un círculo (6-8 mm de diámetro) e incube la mezcla durante 20 min a 37 ° C para recubrir previamente el pozo.
   3. Utilice un contador celular para determinar el número de células y agregue 40 μL de LGSCM con un total de 1 × 10⁴ células en 40 μL del gel de matriz. Mézclelos suavemente con una pipeta para obtener una mezcla de gel de matriz-LGSCM (gel de matriz: LGSCM = 1: 1).
   4. Use una pipeta para dejar caer cuidadosamente 80 μL de la mezcla sobre el área prerecubierta en cada pocillo de la placa de 24 pocillos en el paso 1.3.2.
   5. Incubar la mezcla durante 20 min a 37 °C y añadir 600 μL de LGSCM.
   6. Cambie el medio de cultivo en cada pozo una vez cada dos días. Después de 7 días de cultivo, busque esferas LGSC que tengan un diámetro de 100-300 μm bajo el microscopio invertido (ocular: 10x, objetivo: 4x).
      NOTA: Las LGSC se pueden cultivar durante más de 14 días en total.
4. Aislar y cultivar LGSCs primarios de ratones ROSA26^mT/mG y ratones DED (NOD/ShiLtJ) siguiendo los pasos descritos anteriormente.

2. Mantenimiento y paso lgSC

1. Eliminar bien el medio de cultivo de la esfera de cultivo.
2. Desagregar las esferas LGSC cultivadas durante 7 días mediante incubación en 20 μL de 10 U/mL de dispasa y 100 μL de 10 mM PBS durante 30 min a 37 °C.
3. Transfiera la suspensión a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrífuga a 150 × g durante 4 min. Retire el sobrenadante.
4. Tratar las esferas con 1 ml de tripsina-EDTA al 0,05% durante 5 min a 37 °C. Agregue 1 ml de inhibidor de tripsina (TI) al 0.05% y pipetee repetidamente para neutralizar la tripsina y disociar las esferas en células individuales.
5. Centrifugar a 150 × g durante 5 min y retirar el sobrenadante para obtener LGSCs en el pellet. Agregue 1 ml de LGSCM para resuspendir el pellet LGSC.
6. Coloque las celdas individuales como se describe en los pasos 1.3.1 a 1.3.6.

3. Diferenciación LGSC

1. Procedimiento 1: Extender el tiempo de cultivo de lgsCs de 7 a 14 días con el sistema de cultivo LGSC para diferenciación aleatoria.
2. Procedimiento 2: Cambiar la proporción de la mezcla de gel de matriz-LGSCM de 1:1 a 1:2 al comienzo del cultivo LGSC para la diferenciación de células ductales. Sembrar los LGSC en la matriz para la inducción durante 14 días (consulte el paso 1.3).
3. Procedimiento 3: Después del paso, reemplace el LGSCM con la mezcla de suero bovino fetal (FBS) LGSCM-10% para la diferenciación de las células acinares. Inducir la diferenciación durante 14 días.

4. Deshidratación del tejido LG

1. Obtenga tejidos LG (paso 1.1.1) y enjuague los GL con 4 ml de solución estéril de PBS de 10 mM en un plato de 6 cm durante 2 min. Mueva los tejidos a una solución de formalina al 10% para su fijación durante 24 h.
2. Enjuague los tejidos fijos con PBS de 10 mM durante 2 minutos para eliminar la formalina y transfiera el tejido a una caja de incrustación de tejido. Coloque la caja de incrustación en el deshidratador automático.
3. Utilice el deshidratador automático para deshidratar los tejidos de la siguiente manera: 70% de etanol, 2 h; 80% etanol, 2 h; 90% etanol, 30 min; 95% etanol, 30 min; etanol absoluto, 30min; etanol absoluto, 2 h; etanol absoluto: mezcla 100% xileno (1: 1), 30 min; 100% xileno, 30 min; 100% xileno, 2 h; 100% xileno: mezcla de parafina (1: 1), 30 min; parafina, 2 h; parafina, 3 h.

5. Deshidratación de organoides/esferas LG

1. Obtenga organoides/esferas LG (pasos 2.1-2.3) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y enjuague los organoides/esferas LG con 1 ml de solución estéril de PBS de 10 mM durante 2 min.
2. Centrifugar a 100 × g durante 1 min y retirar el sobrenadante.
3. Prepare la solución de paraformaldehído al 4% (PFA) de la siguiente manera: agregue 20 g de PFA a una mezcla de 400 ml de PBS de 10 mM y 40 μL de 1 M de NaOH, agite bien la solución y caliéntela en un baño de agua de 65 ° C durante 2 h hasta que el PFA se disuelva por completo. Después de enfriar a temperatura ambiente, use PBS de 10 mM para compensar el volumen a 500 ml y guárdelo a 4 ° C.
4. Agregue 1 ml de PFA al 4% en el tubo de la microcentrífuga con el gránulo organoide/esfera y coloque el tubo en un refrigerador de 4 °C durante al menos 24 h para su fijación.
5. Después de la fijación, centrífuga a 100 × g durante 1 min y retire el sobrenadante. Agregue 1 ml de PBS de 10 mM en el tubo de la microcentrífuga con el gránulo organoide/esfera y mezcle suavemente mediante pipeteo durante 2 minutos para enjuagar el PFA. Repita este paso dos veces.
6. Centrifugar a 100 × g durante 1 min y retirar el sobrenadante.
7. Hidrogel de incrustación de calor para disolver y agregar 50-60 μL de hidrogel de incrustación al pellet organoide/esfera y mezclar. Pipetear la mezcla sobre la parapelícula en forma de gota y espere 5 minutos para que se solidifique a temperatura ambiente.
8. Deshidrate el gel con los organoides/esferas en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de la siguiente manera.
   1. Agregue 1 ml de etanol al 50% al tubo, espere 30 minutos a temperatura ambiente y retire el líquido del tubo mediante pipeteo. Repita este paso cambiando la concentración de etanol a 70%, 80%, 90%, 95% sucesivamente.
   2. Agregue 1 ml de etanol absoluto al tubo, espere 30 minutos a temperatura ambiente y retire el líquido del tubo mediante pipeteo. Repita este paso.
   3. Agregue 1 ml de una mezcla de 0,5 ml de etanol absoluto y 0,5 ml de xileno 100% al tubo, espere 30 minutos a temperatura ambiente y retire el líquido del tubo mediante pipeteo.
   4. Agregue 1 ml de xileno 100% al tubo, espere 30 minutos a temperatura ambiente y retire el líquido del tubo mediante pipeteo. Repita este paso.
      NOTA: Los pasos 5.8.5-5.8.6 deben realizarse en un baño de metal a 65 °C.
   5. Agregue 1 ml de una mezcla de 0,5 ml de parafina y 0,5 ml de xileno al tubo, espere 30 min a 65 °C y retire el líquido del tubo mediante pipeteo.
   6. Agregue 1 ml de parafina al tubo, espere 30 minutos a 65 ° C y retire el líquido del tubo mediante pipeteo. Repita este paso y extienda el tiempo de procesamiento a 1 h.

6. Incrustación y seccionamiento de parafina

1. Incrustación de parafina
   1. Antes de incrustar, encienda la máquina de incrustación y precaliente para derretir la cera de parafina en el tanque de parafina.
   2. Coloque el tejido deshidratado o el gel organoide/esfera en la ranura de la caja de hierro incrustante y coloque la caja de hierro en la parafina de la máquina de incrustación.
   3. Retire la tapa de plástico y coloque la caja de incrustación de plástico en la caja de hierro para cubrirla. Mueva la caja de hierro incrustante a una mesa de enfriamiento.
   4. Después de que la parafina se haya condensado en bloques en la caja de incrustación, retírela de la caja de hierro y córtela directamente o guárdela temporalmente en un refrigerador de 4 ° C.
2. Seccionamiento de parafina
   1. Antes de cortar parafina, preensamble la cortadora de parafina y agregue agua destilada al fregadero de la cortadora para precalentarla. Comience a cortar cuando la temperatura del agua aumente a 42 ° C.
   2. Fije la muestra en la ranura de muestra de la cortadora de parafina. Ajuste el grosor de la sección a 5 μm durante el corte.
   3. Seccionar la muestra continuamente. Fije la sección completamente embaldosada en la corredera antideslizante en el tanque de la cortadora.
   4. Después de la sección, coloque los portaobjetos fijados con tejido de muestra en una incubadora bioquímica a 37 °C para secar durante 24 h. Guarde temporalmente los toboganes en un refrigerador a 4 °C.

7. Tinción de hematoxilina y eosina

1. Derretir las secciones de parafina a 60 °C durante 30 min, remojar las secciones en 100% xileno durante 15 min y repetir.
2. Trate las secciones con etanol absoluto en un agitador durante 5 min.
3. Trate las secciones con 90% de etanol, 80% de etanol y 70% de etanol en un agitador, cada uno durante 3 min.
4. Tratar las secciones con agua desionizada en una coctelera durante 5 min y 2 min sucesivamente.
5. Manche las secciones en una caja húmeda durante 5 min con 4 mg/ml de solución de hematoxilina. Enjuague las secciones en agua corriente durante 10 min.
6. Agitar las secciones en un agitador primero con agua desionizada durante 2 min y luego con 0.5% -1% de eosina durante 1 min.
7. Agitar las secciones con 70% de etanol, 80% de etanol y 90% de etanol en un agitador durante 3 min (cada uno) sucesivamente. Agitar las secciones con etanol absoluto en un agitador durante 5 min.
8. Remoje las secciones en 100% xileno durante 15 min y repita el remojo.
9. Use una pipeta o gotero para agregar 3-4 gotas de bálsamo neutro a la diapositiva y cúbrala lentamente con una diapositiva de cubierta. Seque al aire los toboganes a temperatura ambiente.

8. Tinción inmunohistoquímica (IHC)

1. Derrita las secciones de parafina a 60 °C durante 30 min, remoje las secciones en 100% xileno durante 10 min y repita este paso dos veces.
2. Agite las secciones en un agitador primero con etanol absoluto, etanol al 90% y etanol al 80% durante 2 minutos (cada uno), sucesivamente, y luego con agua desionizada durante 3 minutos. Repita la agitación con agua desionizada dos veces.
3. Agitar las secciones en un agitador primero con una mezcla de 20 mL de 30% H₂O₂ y 180 mL de metanol durante 10 min y luego agua desionizada durante 5 min. Repita este paso tres veces.
4. Transfiera las secciones al tampón de ácido cítrico precocido (1 L de agua desionizada con 3 g de Na₃C₆H₅O_{7.2H 2}O y 0.4 g C₆H₈O₇, pH 6.0), microondas durante 10 min para mantenerlas en el punto de ebullición subcrítico y enfríe a temperatura ambiente durante 30 min. Agitar las secciones con agua desionizada en una coctelera durante 5 min. Repita este paso tres veces.
5. Agite las secciones con PBS de 10 mM en una coctelera durante 5 minutos y repita este paso tres veces. Encierre el área de tejido en la caja húmeda con un marcador repelente al agua, agregue una gota de suero de cabra no inmune listo para usar para cubrir las muestras y colóquelas a temperatura ambiente durante 1 h.
6. Retire el suero, agregue anticuerpos primarios a las muestras (consulte la Tabla de materiales) e incube durante la noche a 4 ° C. Retire el anticuerpo primario, agite las secciones con PBS de 10 mM en un agitador durante 5 minutos y repita este paso de agitación con PBS de 10 mM tres veces.
7. Agregue anticuerpos secundarios (consulte la Tabla de materiales) para cubrir las muestras e incube en una caja húmeda durante 30 minutos a temperatura ambiente. Agite las secciones con PBS de 10 mM en un agitador durante 5 minutos y repita el paso de agitación tres veces.
8. Agregue la solución recién preparada de 0.03-0.05% de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) para cubrir las muestras en la caja húmeda y manchar durante 30-90 s. Enjuague las secciones con agua corriente durante 10 min.
   NOTA: Controle el tiempo de tinción observando bajo un microscopio de luz hasta que aparezca el color amarillo.
9. Agregue 4 mg/ml de solución de hematoxilina para cubrir las muestras, manche durante 5 minutos en una caja húmeda y enjuague las secciones con agua corriente durante 10 min.
10. Agitar las secciones en un agitador con 80% de etanol, 90% de etanol y etanol absoluto durante 2 min cada uno, sucesivamente, y remojar las secciones en 100% de xileno durante 30 min.
11. Use una pipeta o gotero para agregar 3-4 gotas de bálsamo neutro a la diapositiva y cúbrala lentamente con una diapositiva de cubierta. Seque al aire los toboganes a temperatura ambiente.

9. Tinción global de inmunofluorescencia de organoides/esferas

NOTA: Recoja los organoides/esferas fijados con una solución de PFA al 4% en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (consulte los pasos 5.1 a 5.4). Realice el etiquetado de fluorescencia de la siguiente manera.

1. Deshidrate los organoides/esferas añadiendo 1 ml de solución de sacarosa al 30% al tubo e incube durante la noche en un refrigerador a 4 °C.
2. Añadir 100 μL de solución de PBST (solución de PBS de 10 mM con Tritón X-100 al 0,1%) al tubo para enjuagar los organoides/esferas durante 5 min, centrifugar el tubo a 100 × g durante 1 min, y recoger el pellet. Repita este paso tres veces.
3. Agregue 0.5-1 ml de suero de cabra no inmune listo para usar al tubo y séllelo a temperatura ambiente durante 1 h. Centrifugar el tubo a 100 × g durante 1 min y recoger el pellet.
4. Agregue varias gotas de anticuerpo primario diluido para cubrir el pellet e incubar en un refrigerador a 4 ° C durante 48 h. Centrifugar el tubo a 100 × g durante 1 min y recoger el pellet.
5. Repita el paso 9.2.
6. Agregue varias gotas de un anticuerpo secundario fluorescente y una solución de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) al tubo para cubrir el pellet e incubar en un refrigerador a 4 °C durante 24 h, evitando la luz.
7. Repita el paso 9.2, evitando la luz.
8. Añadir 100 μL de solución de PBST al tubo y almacenarlo temporalmente en un frigorífico de 4 °C, lejos de la luz. Observe y fotografíe los organoides/esferas utilizando el microscopio de barrido de láminas de luz.

10. Transfección LGSC pLX-mCherry

NOTA: La producción de partículas lentivirales debe realizarse en un gabinete de bioseguridad y un banco limpio a nivel de bioseguridad BSL2.

1. Cultive la célula de empaquetamiento del lentivirus 293T en una placa de 6 pocillos con DMEM + 10% FBS a 37 °C, 5% CO₂ durante 3-5 días para alcanzar el 80% de confluencia celular.
2. Transfectar el vector de lentivirus pLX-mCherry en LGSCs.
   NOTA: La preparación del reactivo está indicada para un pocillo de una placa de 6 pocillos.
   1. Prepare dos tubos centrífugos estériles de 1,5 ml y agregue 250 μL de DMEM/F12 a cada tubo.
   2. Agregue 7.5 μL de reactivo de transfección a un tubo y mezcle bien el reactivo mediante pipeteo.
   3. Añadir 2 μg de plásmido pLX-mCherry sin endotoxina y plásmido de empaquetamiento de lentivirus en otro tubo, y añadir el reactivo de transfección (2 μL/μg de plásmido).
   4. Mezcle el líquido en ambos tubos de centrífuga y deje reposar las mezclas durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   5. Retire el medio de cultivo de las células 293T y agregue la mezcla desde el paso 10.2.4 hasta las células 293T. Cambie el medio de cultivo a DMEM fresco + 10% FBS después de 8 h.
   6. Después de 48 h, recoja el sobrenadante del virus por primera vez y filtre a través de un filtro de 0,45 μm. Después de 72 h, recoja el sobrenadante del virus por segunda vez y filtre a través de un filtro de 0,45 μm nuevamente.
      NOTA: Guarde ambos sobrenadantes filtrados en hielo hasta la transducción del lentivirus.
3. Obtenga los LGSC de ratones DED (NOD/ShiLtJ) (consulte el paso 1).
4. Agregue 1 ml del sobrenadante premontado pLX-mCherry lentivirus para resuspend las células.
5. Coloque el tubo de la centrífuga en un agitador en la incubadora de CO₂ a 37 °C. Agítelo a 100 rpm para maximizar el contacto entre el lentivirus y las células. Después de 8 h, centrifugar la mezcla a 250 × g durante 4 min y retirar el sobrenadante.
6. Añadir 1 ml de DMEM/F12 para resuspendir el pellet celular. Utilice un contador celular para determinar el número de células y sembrar un total de 1 × 10⁴ células en 100 μL de matriz gel-LGSCM (gel de matriz: LGSCM = 1:1) en cada pocillo de una placa de 24 pocillos precubierta con 20 μL de matriz gel-LGSCM (ver paso 1.3.2).
7. Después de 7 días de cultivo (ver paso 1), seleccione esferas que exhiban fluorescencia roja bajo un microscopio de fluorescencia para expandir el cultivo.

11. Trasplante ortotópico LGSC

NOTA: Todas las operaciones quirúrgicas se realizan en una sala de operaciones de SPF y todos los instrumentos quirúrgicos se esterilizan.

1. Obtener las esferas LGSC de ratones ROSA26^mT/mG con fluorescencia roja (td-Tomate) o transfección mCherry cultivada durante 7 días (ver paso 1).
2. Enfríe un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga una mezcla 1:1 de gel de matriz y DMEM/F12 sobre hielo antes de usarlo. Digiera las esferas LGSC en células individuales y resuspenda las células a una densidad de 2 × 10⁶ células / ml en el tubo.
3. Anestesiar a los ratones NOD/ShiLtJ mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg).
   NOTA: El ratón NOD / ShiLtJ es un modelo ideal con síntomas idiopáticos añadidos, que incluyen secreción lagrimal reducida, infiltración inflamatoria y ulceración orbitaria.
4. Después de la anestesia, use solución salina o ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad, y luego use tijeras oftálmicas para hacer un corte de 5-8 mm en la piel detrás de la oreja (cerca del ojo) de los ratones anestésicos para exponer los GL.
   NOTA: El yodóforo debe usarse estrictamente para la desinfección alrededor de la incisión.
5. Inyecte 2 × 10⁴ celdas en el LG del lado izquierdo e inyecte la mezcla sin células (consulte el paso 11.2) en el LG del lado derecho como control.
6. Después de la inyección, restaure los LG a sus posiciones originales con fórceps oftálmicos y suture la herida. Alimente a los ratones durante 2 meses y observe el efecto del tratamiento.
   NOTA: El material del cojín de la jaula también debe esterilizarse estrictamente después de la operación, y el material del cojín debe reemplazarse una vez al día. Después de suturar la herida, el tramadol se puede inyectar selectivamente en la vena de la cola de los ratones a la dosis estándar de 2,5 mg / kg para lograr la analgesia.
7. Anestesiar a estos ratones 2 meses después del experimento (ver paso 11.3). Filmar los síntomas de la región ocular.
   1. Durante la anestesia, busque los siguientes síntomas: relajación muscular del cuello y las extremidades; respiración profunda, lenta y constante; estrechamiento de la pupila; desaparición del reflejo corneal.
   2. Durante la anestesia y la operación, mantenga la temperatura corporal de los ratones a 37 ° C. Después de la cirugía, agregue antibióticos apropiados al agua potable para ratones para reducir el riesgo de infección de la herida. No deje a los ratones desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la reclinación esternal. No devuelva los ratones que se han sometido a cirugía a la compañía de otros ratones hasta que se recuperen por completo.
   3. Después de filmar los síntomas de la región ocular, abra el software ImageJ, haga clic en Archivo | Abrir | Selecciones a mano alzada, mantenga presionado el botón izquierdo del mouse y seleccione el área de ulceración orbitaria en la imagen. Haga clic en Analizar | Medida para obtener el área relativa de ulceración.
8. Coloque el hilo de algodón rojo fenol en el canto lateral de los ratones anestésicos durante 10 s; medir y registrar la longitud de la parte descolorida del hilo de algodón. Eutanasiar a los ratones por dislocación de la vértebra cervical después de la medición del desgarro.
9. Diseccionar los ratones y obtener los LGs para el análisis de IHC.

12. Aislamiento de ARN

NOTA: Antes del experimento, preenfríe la centrífuga a 4 °C y garantice que todos los reactivos y consumibles estén libres de contaminación por RNAse.

1. Recoja LGSC o fragmentos de LG en un tubo de microcentrífuga. Agregue 1 ml de tampón de lisis celular y lisar completamente las células o tejidos por oscilación de vórtice.
2. Agregue 0.2 ml de cloroformo y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos después de la oscilación del vórtice durante 1 minuto. Centrifugadora durante 15 min a 4 °C, 12.000 × g.
   NOTA: Después de la centrifugación, el líquido se divide en tres capas, y el ARN se encuentra en la fase acuosa transparente superior.
3. Pipetee cuidadosamente la fase acuosa transparente superior y transfiérala a un nuevo tubo de centrífuga libre de RNAse de 1,5 ml.
4. Añadir un volumen igual de alcohol isopropílico y mezclar suavemente. Deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 min y luego centrífuga durante 15 min a 4 °C, 12.000 × g.
5. Retire el sobrenadante y agregue 1 ml de etanol al 75%. Invierta el tubo para lavar el pellet y centrífuga durante 5 min a 4 °C, 7.500 × g. Repita este paso.
6. Retire el sobrenadante con cuidado y coloque el tubo de la centrífuga en el banco de trabajo ultralimpio para secarlo durante unos 20 minutos.
   NOTA: Continúe con el siguiente paso cuando el pellet blanco se vuelva translúcido. Realizar todas las operaciones sobre hielo.
7. Agregue 20 μL de agua libre de RNAse para disolver el pellet por completo. Mida la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro (consulte la Tabla de materiales) y almacene la solución de ARN a -80 °C.

13. PCR

1. Reacción de transcripción inversa
   1. Añadir 1 μg de ARN total (calcular el volumen de la solución de ARN añadida según la concentración de la solución de ARN) en el tubo de reacción de PCR e incubar a 65 °C durante 5 min para la desnaturalización.
   2. Póngalo en hielo durante 1 minuto y luego agregue agua libre de enzimas hasta que el volumen total alcance los 12 μL. Agregue 4 μL de 4x DNA Master Mix e incube a 37 ° C durante 5 min.
   3. Coloque el tubo en hielo, agregue 4 μL de 5x RT Master Mix y mézclelo suavemente. Ajuste los siguientes ajustes de PCR: 37 °C durante 15 min, 50 °C durante 5 min, 98 °C durante 5 min, 4 °C durante 1 min.
   4. Guárdelo a -20 °C o continúe con el siguiente paso después de que se complete la reacción de transcripción inversa.
2. Reacción por PCR
   1. Prepare la reacción de PCR en el tubo de PCR de la siguiente manera: 14,1 μL de agua libre de enzimas, 2 μL de dNTP, 2 μL de 10x Buffer, 0,8 μL de Primer (10 μM, 0,4 μL de Forward Primer y 0,4 μL de Reverse Primer, consulte la Tabla de Materiales), 1 μL de cDNA de transcripción inversa (consulte el paso 13.1) y 0.1 μL de enzima Taq.
   2. Coloque la reacción de PCR preparada en el aparato de PCR para PCR. Consulte las instrucciones del kit de enzimas Taq para el procedimiento de PCR (consulte la Tabla de materiales).
3. Electroforesis en gel de agarosa
   1. Utilice una balanza analítica para pesar 242 g de Tris y 37,2 g de Na₂EDTA·2H₂O y agréguelos a un vaso de precipitados de 1 L. Agregue ~ 800 ml de agua desionizada y 57.1 ml de ácido acético glacial al vaso de precipitados, mezcle bien, agregue agua desionizada a 1 L para obtener un tampón TAE 50x y guárdelo a temperatura ambiente.
      NOTA: Diluya el tampón TAE 50x con agua desionizada antes de su uso.
   2. Utilice una balanza analítica para pesar 1,2 g de agarosa y agréguela a un matraz cónico que contenga 80 ml de 1 tampón TAE. Calentar repetidamente en el horno de microondas hasta que se disuelva por completo.
   3. Enfríe el matraz con agua corriente del grifo hasta que la temperatura de la solución baje a 60 °C. Agregue 8 μL de tinción de ácido nucleico, vierta la solución en el tanque gelatinizante después de mezclar bien, coloque el peine y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 30 min.
   4. Saque el peine y cargue los productos de PCR en el gel de agarosa preparado. Realizar electroforesis a 120 V durante 30 min.
   5. Coloque el gel en el sistema de imágenes ECL Gel y fotografíe.

Establecer un sistema de cultivo 3D sin suero
En este estudio, se desarrolló LGSCM que contiene EGF, Wnt3A, FGF10 e Y-27632 para LGSC de ratón, y los LGSC se aislaron y cultivaron con éxito mediante un método de cultivo 3D (Figura 1A). Un exitoso sistema de cultivo 3D, libre de suero de LGSCs de ratones C57BL / 6, ratones NOD / ShiLtJ, ratones BALB / c y ratones ROSA26mT / mG se ha establecido utilizando este método16. Para un ratón macho, se obtuvieron 1,5-2 × 106 células de dos LG por disociación. Después de una semana de cultivo, se formaron 30-60 esferas al sembrar 1 × 104 células LG al comienzo del cultivo. Además, las células cultivadas por este método expresaron Epcam, Krt5, Krt14, P63, nestina y otros marcadores de células madre16, lo que indica que las células obtenidas tenían las propiedades de LGSCs. Krt14 y Ki67 se expresaron en todas las esferas formadas por LGSC cultivadas durante 7 días (Figura 1B), lo que indica que las LGSC tenían capacidad de autorrenovación.

Durante un cultivo de 7 días, las esferas lgscs alcanzaron un diámetro de 100 μm. La tinción de hematoxilina y eosina (H&E) mostró celularidad en el día 7 (Figura 1C y Figura 1F). Los factores de enriquecimiento de lgsCs obtenidos después de 7 días de cultivo primario y subcultivo indicaron que los LGSCs enriquecidos por este método tenían una fuerte capacidad proliferativa (Figura 1D). En este sistema, las LGSC podrían pasarse más de 40 veces, y aún mantenían las características de las células madre (Figura 1E y Figura 1G). En conclusión, este artículo describe un protocolo para establecer un sistema de cultivo 3D, libre de suero para LGSC in vitro. Las células cultivadas por este protocolo tienen capacidad proliferativa continua y estable.

Inducir la diferenciación in vitro
Se analizó la capacidad de diferenciación de las LGSC in vitro . Cuando se cultivaron durante más de 7 días, las LGSC perdieron gradualmente la capacidad de crecimiento, y la expresión de AQP5, Ltf, Krt19 y otros marcadores asociados con la diferenciación aumentó, mientras que la expresión de Krt14 disminuyó gradualmente16. Los LGSC fueron inducidos a formar más cogollos por FBS y una baja proporción de gel de matriz (Figura 2A, B). Además, la tinción de H&E indicó que FBS podría inducir a las esferas a producir estructuras más cavitantes (Figura 2C).

El trabajo anterior sugirió que la disminución de la dureza de la matriz promovió la diferenciación de las LGSC en organoides de tipo ductal. Las células de la capa basal mantuvieron las características de las células madre que expresan Krt14, mientras que las células de la capa superior basal se diferenciaron en estructuras en forma de conducto con cavidades y expresaron Krt19. Además, la adición de FBS podría inducir la diferenciación de LGSC en organoides similares a acinares, que mantuvieron las características de las células madre con una alta relación nuclear/citoplasmática. Algunas células diferenciadas similares a las acinares expresaron altos niveles de AQP5 con baja relación nuclear/citoplasmática16.

 Reparar LGSCs  in vivo
Sobre la base de los experimentos anteriores, la capacidad de los LGSC para reparar los LGG dañados se exploró mediante inyección ortotópica. Después de la inyección ortotópica de ROSA-LGSC en ratones NOD/ShiLtJ, se formaron nuevos lóbulos lagrimales adyacentes a los LG (Figura 3A-C). La mayoría de los lóbulos estaban compuestos por células acinares maduras con alta expresión de AQP5, y hubo formación de conductos intralobulares con baja expresión de AQP5 (Figura 3D-F). Después de la inyección de ROSA-LGSC durante 8 semanas, se midió la descomposición alrededor de la órbita de los receptores. Las mediciones indicaron que la inyección de LGSC redujo el área de desintegración en ~ 60% (Figura 3G, H). La disección mostró que el volumen de LG aumentó después de la inyección durante 10 semanas (Figura 3I). La cantidad de secreción de lágrima en el lado de la inyección de ROSA-LGSCs fue mayor que en el lado de control, pero menor que en ratones de tipo salvaje (Figura 3J). Estos resultados indican que las células cosechadas por este sistema de cultivo tienen las características de las LGSC y pueden ser utilizadas para la terapia con células madre en ratones con ADD y xeroftalmía.

Figura 1: Aislamiento y caracterización de LGSCs. (A) La estrategia de la cultura de paso primario y continuo de LGSC. (B) Tinción por inmunofluorescencia de LGSCs en el día 7. Las LGSC expresan el marcador de células epiteliales E-cadherina (rojo), el marcador de células madre Krt14 (rojo), el marcador de células proliferativas Ki67 (rojo). Contratinción, DAPI (azul). (C) La morfología de las LGSC en cultivo durante 1, 3, 5 y 7 días. D) Factor de enriquecimiento relativo de la cultura LGSC en la cultura primaria y la subcultura. El factor de enriquecimiento relativo es la relación entre el número total de células obtenidas después de 7 días de cultivo y el número de células sembradas en cultivo. P < 0,01. (E) Transcripción de marcadores adultos de células madre/progenitoras del LG de ratón y diferentes LGSC de paso (P1, P10, P20 y P40). (F) La morfología (izquierda) y la tinción de H&E (derecha) de lgSCs en cultivo primario en el día 7. (G) LGSC cultivados en diferentes pasajes (P1, P10, P20 y P40). Barras de escala = 50 μm (B, F, G), 100 μm (C). Abreviaturas: LG = glándula lagrimal; LGSCs = células madre LG; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindole;; NC = control negativo; TE = tripsina-EDTA; H&E = hematoxilina y eosina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Diferenciación de LGSCs in vitro. (A,B) Morfología de LGSCs cultivadas en medio normal o medio de diferenciación. (A) LGSC cultivados durante 10 días en P10 (izquierda: medio normal, derecha: medio que contiene FBS). (B) LGSC cultivados durante 14 días en P31 (izquierda: medio normal, derecha: medio con 1/3de gel de matriz). (C) Tinción H&E de las LGSC cultivadas durante 14 días (arriba: medio normal, abajo: medio que contiene FBS). Barras de escala = 100 μm (A), 200 μm (B), 50 μm (C). Abreviaturas: LG = glándula lagrimal; LGSCs = células madre LG; H&E = hematoxilina y eosina; FBS = suero fetal bovino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Injerto de alotrasplante de LGSC y alivio de los síntomas AÑADIDOS. (A-F) Tinción IHC de NOD/ShiLtJ LG trasplantado con cultivos de 7 días de ROSA-LGSCs después de 8 semanas. Utilice los lados izquierdo y derecho del mismo ratón que el grupo experimental y el grupo de control. (A-C) Tinción de IHC con anticuerpo anti-td-tomate; (D-F) Tinción de IHC con anticuerpos anti-AQP5; (A, D) LG inyectó con vehículo (mezcla 1:1 de gel de matriz y DMEM/F12), (B, E) LG inyectó con ROSA-LGSCs, (C, F) las imágenes magnificadas de los cuadrados negros en B, E (flecha roja, conducto intralobular). (G, H) La condición de la órbita ocular del ratón NOD / ShiLtJ después de la inyección de ROSA-LGSC a las 8 semanas. La inyección de LGSC alivia significativamente la descomposición alrededor de la órbita del ojo. (I) LGs del ratón NOD/ShiLtJ a las 10 semanas (izquierda: LG desde el lado inyectado por células, derecha: LG desde el lado de control). (J) Volumen de lágrimas de ratones de tipo silvestre y NOD / ShiLtJ trasplantados con cultivos de 7 días de ROSA-LGSC después de 8 semanas. El volumen de lágrimas de los GL inyectados por ROSA-LGSC es mayor que el de los GL de control, pero significativamente menor que el de los GL WT. n = 3; Ratones NOD/ShiLtJ, n = 4; P < 0,01; *P < 0,05. Barras de escala = 50 μm (A-F). Abreviaturas: LG = glándula lagrimal; LGSCs = células madre LG; IHC = inmunohistoquímico; WT = tipo salvaje; AÑADIDO = enfermedad del ojo seco con deficiencia acuosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.