Generación de patrones para microscopía de tracción de micropatrones

Katie A. Bunde; Dimitrije Stamenović; Michael L. Smith

doi:10.3791/63628

Artículo de método

Generación de patrones para microscopía de tracción de micropatrones

DOI:

10.3791/63628

⸱

17 de febrero de 2022

Katie A. Bunde¹ , Dimitrije Stamenović¹ , Michael L. Smith¹

¹Department of Biomedical Engineering, Boston University

En este artículo

Resumen

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Describimos mejoras en un método estándar para medir las fuerzas de tracción celular, basado en la impresión de microcontacto con un solo paso de patrón sustractivo de matrices de puntos de proteínas de matriz extracelular en hidrogeles blandos. Este método permite una fabricación más simple y consistente de patrones de islas, esencial para controlar la forma del grupo celular.

Resumen

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La microscopía de tracción por micropatrones permite controlar la forma de células individuales y grupos celulares. Además, la capacidad de modelar a escala de longitud micrométrica permite el uso de estas zonas de contacto modeladas para la medición de las fuerzas de tracción, ya que cada punto micromodelado permite la formación de una sola adhesión focal que luego deforma el hidrogel blando subyacente. Este enfoque se ha utilizado para una amplia gama de tipos de células, incluidas las células endoteliales, las células del músculo liso, los fibroblastos, las plaquetas y las células epiteliales.

Esta revisión describe la evolución de las técnicas que permiten la impresión de proteínas de la matriz extracelular en hidrogeles de poliacrilamida en una matriz regular de puntos de tamaño y espaciado preespecificados. Como los patrones de escala micrométrica son difíciles de imprimir directamente sobre sustratos blandos, los patrones se generan primero en cubiertas de vidrio rígido que luego se utilizan para transferir el patrón al hidrogel durante la gelificación. En primer lugar, se describe el enfoque original de impresión de microcontactos para generar matrices de pequeños puntos en el claváculo. Se requiere un segundo paso que elimina la mayor parte del patrón para dejar islas de puntos pequeños para controlar las formas de las células y los grupos de células en tales matrices de puntos modelados.

A continuación, se describe una evolución de este enfoque que permite la generación de islas de puntos utilizando un solo paso de patrón sustractivo. Este enfoque se simplifica en gran medida para el usuario, pero tiene la desventaja de una vida útil disminuida para el molde maestro necesario para hacer los patrones. Finalmente, se describen los enfoques computacionales que se han desarrollado para el análisis de imágenes de puntos desplazados y campos de tracción generados por células posteriores, y se proporcionan versiones actualizadas de estos paquetes de análisis.

Introducción

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La mayoría de los fenotipos celulares ejercen fuerzas de tracción sobre su entorno. Estas fuerzas de tracción son generadas por el citoesqueleto contráctil de una célula, que es una red de actina y miosina, y otros biopolímeros filamentosos y proteínas^{de reticulación} 1,2,3,4. Las fuerzas generadas dentro de la célula pueden transmitirse al entorno extracelular o a las células adyacentes, principalmente a través de proteínas transmembrana como las integrinas y las cadherinas, respectivamente ^5,6

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Protocolo

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1. Creación de maestros de silicona

NOTA: La mayor parte del proceso de diseño, creación y solución de problemas de maestros de silicio para el moldeo repetido de sellos PDMS se ha cubierto anteriormente²¹, por lo que solo se describirán aquí las diferencias clave en este nuevo enfoque.

Cree el diseño de la fotomáscara utilizando AutoCAD o un software de diseño similar. Cubra un lado de la fotomáscara, una pieza delgada de vidrio, con una fina capa de cromo para controlar la dispersión de la luz UV. Diseñe la fotomáscara de modo que la luz UV brillante a través de ella en la fotorresistente....

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Resultados

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Los hidrogeles PAA con el módulo de Young de E = 3,6 kPa y la relación de Poisson de ν = 0,445 se hicieron para su uso mediante este método de micropatronaje sustractivo. Los hidrogeles se hicieron para tener ~ 100 μm de espesor, lo que les permite ser fotografiados con la configuración de imágenes utilizada aquí, al tiempo que evita que las células detecten el capa rígida debajo del gel, lo que causaría problemas en los estudios centrados en la detección de rigidez celular^23,33<.......

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Discusión

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En este documento se describe un método mejorado de modelado indirecto de hidrogeles PAA. Este enfoque se basa en métodos que se han utilizado anteriormente 20,35,36,37,38,39,40,41,42. El cambio principal es que los sellos.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer al Dr. Paul Barbone del Departamento de Ingeniería Mecánica de la Universidad de Boston por las útiles discusiones y la asistencia con el análisis de datos. Este estudio fue apoyado por la subvención CMMI-1910401 de la NSF.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
(3-aminopropil)trimetoxisilano	Sigma Aldrich	#281778
1.5 mL Tubo de microcentrífuga	Fisher Scientific	#05-408-129
Tubo cónico de 15 mL	Fisher Scientific	#05-539-12
4 x 4 en 0.060 Cuarzo LR Cromo Fotomáscara	Advance Reproductions Corporation	N/A	Mascarilla diseñada a medida
6 placas de pocillos	Fisher Scientific	#07-200-83
Acetona	Fisher Scientific	#A18P-4
Solución de acrilamida, 40%	Sigma Aldrich	#A4058
AlexaFluor 488	Thermo Fisher	#A20000
Persulfato de aminonio	Fisher Scientific	#BP179-25
Bisacrilamida	Fisher Scientific	#PR-V3141
Etanol	Greenfield Global	#111000200C1GL
Cubreobjetos de vidrio, redondos de 25 mm	Fisher Scientifc	#12-545-102
Cubreobjetos de vidrio, redondos de 30 mm	Warner	#64-1499
Cámara Hamamatsu ORCA-R2 Hamamatsu		#C10600-10B
Human Plasma Valley	Biomedical	#HP1051P	Utilizado para aislar fibronectina
Ácido clorhídrico, 1.0 N	Millipore Sigma	#1.09057
ImageJ	Wayne Rasband	#1.53N
Juego de platos intercambiables	Bioptechs	#190310-35
Toallitas Kim Fisher	Scientific	#06-666-11C
Mascarilla Alinger	Karl Suss#MA6
Matlab 2021	Mathworks	#R2021a
MetaMorph Basic	Molecular Devices	#v7.7.1.0
N-hidroxisuccinimida éster	Sigma Aldrich	#130672-5G
NucBlue Tinción de celda viva	Thermo Fisher	#R37605
Olympus IX2-ZDC Microscopio invertido	Olympus	#IX81
PD-10 Columnas de desalinización GE	Healthcare	#52-1308-00
Campana giratoria fotorresistente	Headway Research	#PWM32
Limpiador de plasma	Harrick	#PDC-001
Grabador de plasma	TePla	#M4L
Fuente de luz Prior Lumen 200Pro	Prior Scientific
Obleas de silicona, oblea universitaria de 100 mm		#809
SU-8 2005	Kayaku Materiales Avanzados Inc.
Desarrollador de SU-8	Kayaku Advanced Materials Inc.
Sylgard 184 Elastómero de silicona	Essex Brownell	#DC-184-1.1
Tetrametiletilendiamina	Fisher Scientific	#BP150-20
Tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silano	Sigma Aldrich	#448931
UAPON-40XW340 Objetivo	Olympus	#N2709300
Exposición	a inundaciones UVNewport	#69910
Bandeja portadora de obleas, 110 x 11 mm	Ted Pella, Inc.	#19395-40

#L200 #NC9463827#NC9901158

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L.

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Micropatrones de prote nas impresi n por microcontacto hidrogeles de poliacrilamida medici n de la fuerza de tracci n sellos de PDMS patrones de la matriz extracelular forma de los c mulos celulares microscop a de fluorescencia adhesi n focal

Generación de patrones para microscopía de tracción de micropatrones

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