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Artículo de método

Generación de patrones para microscopía de tracción de micropatrones

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DOI:

10.3791/63628

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17 de febrero de 2022

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Boston University

En este artículo

Resumen

Describimos mejoras en un método estándar para medir las fuerzas de tracción celular, basado en la impresión de microcontacto con un solo paso de patrón sustractivo de matrices de puntos de proteínas de matriz extracelular en hidrogeles blandos. Este método permite una fabricación más simple y consistente de patrones de islas, esencial para controlar la forma del grupo celular.

Resumen

La microscopía de tracción por micropatrones permite controlar la forma de células individuales y grupos celulares. Además, la capacidad de modelar a escala de longitud micrométrica permite el uso de estas zonas de contacto modeladas para la medición de las fuerzas de tracción, ya que cada punto micromodelado permite la formación de una sola adhesión focal que luego deforma el hidrogel blando subyacente. Este enfoque se ha utilizado para una amplia gama de tipos de células, incluidas las células endoteliales, las células del músculo liso, los fibroblastos, las plaquetas y las células epiteliales.

Esta revisión describe la evolución de las técnicas que permiten la impresión de proteínas de la matriz extracelular en hidrogeles de poliacrilamida en una matriz regular de puntos de tamaño y espaciado preespecificados. Como los patrones de escala micrométrica son difíciles de imprimir directamente sobre sustratos blandos, los patrones se generan primero en cubiertas de vidrio rígido que luego se utilizan para transferir el patrón al hidrogel durante la gelificación. En primer lugar, se describe el enfoque original de impresión de microcontactos para generar matrices de pequeños puntos en el claváculo. Se requiere un segundo paso que elimina la mayor parte del patrón para dejar islas de puntos pequeños para controlar las formas de las células y los grupos de células en tales matrices de puntos modelados.

A continuación, se describe una evolución de este enfoque que permite la generación de islas de puntos utilizando un solo paso de patrón sustractivo. Este enfoque se simplifica en gran medida para el usuario, pero tiene la desventaja de una vida útil disminuida para el molde maestro necesario para hacer los patrones. Finalmente, se describen los enfoques computacionales que se han desarrollado para el análisis de imágenes de puntos desplazados y campos de tracción generados por células posteriores, y se proporcionan versiones actualizadas de estos paquetes de análisis.

Introducción

La mayoría de los fenotipos celulares ejercen fuerzas de tracción sobre su entorno. Estas fuerzas de tracción son generadas por el citoesqueleto contráctil de una célula, que es una red de actina y miosina, y otros biopolímeros filamentosos y proteínasde reticulación 1,2,3,4. Las fuerzas generadas dentro de la célula pueden transmitirse al entorno extracelular o a las células adyacentes, principalmente a través de proteínas transmembrana como las integrinas y las cadherinas, respectivamente 5,6. La forma en que una célula se propaga o contrae,y las magnitudes de las fuerzas de tracción asociadas a esos movimientos-- es el resultado de una conversación íntima con su entorno, que depende en gran medida del tipo y cantidad de proteína presente en la matriz extracelular (ECM)7,8 y de la rigidez de la ECM. De hecho, la microscopía de fuerza de tracción se ha convertido en una herramienta invaluable para comprender la capacidad de respuesta de las células a estímulos locales como la rigidez del sustrato, las tensiones y tensiones mecánicas impuestas o el contacto con otras células. Esta información es directamente relevante para la comprensión de enfermedades como el cáncer yel asma 9,10,11,12.

Se requiere un sistema que se pueda utilizar para medir la deformación inducida por la fuerza de un sustrato de propiedades de material conocidas para calcular las fuerzas de tracción. Estos cambios deben rastrearse a lo largo del tiempo, lo que requiere técnicas de procesamiento de imágenes e imágenes. Uno de los primeros métodos utilizados para determinar las fuerzas de tracción celular fue la observación y análisis de la contracción de hidrogeles de colágeno sembrados con células, aunque este método fue solo semicuantitativo13. Otro método más refinado fue medir las fuerzas de tracción ejercidas por células individuales determinando las fuerzas resultantes de la deformación de una lámina delgada de silicona14. Posteriormente, se desarrollaron técnicas de medición más cuantitativas, y estos métodos también permitieron el uso de hidrogeles blandos como la poliacrilamida (PAA)12,15,16. Cuando se utilizan estos materiales blandos, las fuerzas de tracción podrían determinarse a partir del desplazamiento inducido por la fuerza de perlas desplazadas aleatoriamente incrustadas en el hidrogel y las propiedades mecánicas del gel16,17. Otro avance vino con el desarrollo de matrices de micropostes hechas de polidimetilsiloxano blando (PDMS) para que su deflexión pudiera medirse y convertirse en fuerza utilizando la teoría del haz18.

Finalmente, se desarrollaron métodos para micromodelar hidrogeles blandos, ya que estos enfoques permiten el control de las áreas de contacto para la adhesión celular. Al medir la deformación del micromodelo dentro del área de contacto de una célula, las fuerzas de tracción podrían calcularse fácilmente porque no se requiere una imagen de referencia libre de fuerza19. Este método ha sido ampliamente adoptado, ya que permite el modelado indirecto de una matriz regular de puntos de adhesión de proteínas fluorescentes discretas del tamaño de micras en geles PAA para la medición de fuerzas de tracción celular20. Para calcular estas fuerzas, se ha desarrollado un algoritmo de procesamiento de imágenes, que puede rastrear los movimientos de cada punto micropatronado sin requerir la entrada del usuario21.

Si bien este método es simple para crear cuadrículas completas de patrones de puntos, es más complicado cuando se desean patrones de parches aislados (o islas) de puntos. Las islas micropatronadas son útiles cuando se necesita el control de la forma, y en cierta medida del tamaño, de los grupos de células. Para crear estas islas, el método mencionado de impresión de microcontactos requiere dos pasos distintos: i) usar un sello PDMS para crear un patrón de puntos de alta fidelidad en un coverslip, y luego ii) usar un segundo sello PDMS diferente para eliminar la mayoría de esos puntos, dejando atrás islas aisladas de puntos21. La dificultad de crear islas con este método original se ve agravada por el hecho de que hacer patrones de cuadrícula consistentes en el primer paso del proceso es un desafío por sí solo. Los sellos de microimpresión se componen de una matriz de micropostos circulares, cuyo diámetro corresponde al tamaño de punto deseado. Estos sellos se recubren con una capa uniforme de proteína y luego se estampan con una cantidad precisa de presión sobre las cubiertas tratadas para crear el patrón deseado. Por un lado, aplicar demasiada presión al sello puede resultar en una transferencia desigual de proteínas y una fidelidad de patrón deficiente debido al pandeo o flacidez del pilar entre los pilares, lo que lleva al contacto con el vidrio. Por otro lado, aplicar muy poca presión resulta en poca o ninguna transferencia de proteínas y una fidelidad de patrón deficiente. Por estas razones, se desea un proceso de transferencia que se pueda utilizar para crear constantemente micropatrones de alta calidad de islas aisladas de puntos en un solo paso.

Aquí, se describe un método para el micropatronaje indirecto de islas de puntos de adhesión de proteínas fluorescentes del tamaño de micras en un gel PAA que es más consistente y versátil que los métodos desarrollados anteriormente. Mientras que los métodos de micropatronaje indirecto más antiguos se basan en la transferencia de patrones de proteínas de un sello PDMS a un sustrato intermedio, el método introducido aquí utiliza sellos PDMS en su lugar como un recipiente para la eliminación de proteínas, no para la adición. Esto se hace cambiando primero fundamentalmente la estructura de los sellos PDMS utilizados. En lugar de hacer sellos que se componen de un patrón de pilares circulares espaciados uniformemente, los sellos se componen de un patrón de agujeros circulares espaciados uniformemente en este método.

Con esta nueva estructura, la superficie de estos sellos PDMS se puede tratar con glutaraldehído como se describió anteriormente20,29,30, haciendo que el sello pueda unirse covalentemente con la proteína. Cuando se usan en una funda de vidrio recubierta uniformemente con proteína fluorescente, estos sellos PDMS tratados con glutaraldehído se utilizan para eliminar la mayor parte de la proteína en la superficie de la hoja de cubierta, dejando atrás solo el patrón deseado de puntos predeterminado por la ubicación de agujeros del tamaño de micras en el sello. Este cambio aumenta la tasa de éxito para generar patrones formados por una cuadrícula casi continua de puntos y para crear islas aisladas de puntos a través de un solo paso.

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Protocolo

1. Creación de maestros de silicona

NOTA: La mayor parte del proceso de diseño, creación y solución de problemas de maestros de silicio para el moldeo repetido de sellos PDMS se ha cubierto anteriormente21, por lo que solo se describirán aquí las diferencias clave en este nuevo enfoque.

  1. Cree el diseño de la fotomáscara utilizando AutoCAD o un software de diseño similar. Cubra un lado de la fotomáscara, una pieza delgada de vidrio, con una fina capa de cromo para controlar la dispersión de la luz UV. Diseñe la fotomáscara de modo que la luz UV brillante a través de ella en la fotorresistente elegida cree un maestro de silicona con la inversa de las características deseadas en los sellos PDMS finales. Consulte la Figura 1 para ver el diseño de esta máscara.
    NOTA: Si las características deseadas o el área fuera de ellas deben hacerse transparentes en la fotomáscara depende de la fotorresistente elegida. La fotorresistente utilizada aquí es SU-8 2005 (PRECAUCIÓN: inflamable, irritante para la piel y los ojos; manténgase alejado del calor / llamas / chispas y use guantes protectores y gafas cuando manipule), una fotorresistente negativa que es capaz de hacer características de 5 μm de altura con paredes laterales casi verticales.
    1. Curar la fotorresistente negativa exponiéndola a la luz UV y eliminando el SU-8 sin curar con un disolvente químico. Por lo tanto, diseñe las características principales de la máscara para que sean transparentes mientras que el área circundante de la máscara es opaca.
    2. Para este nuevo método de eliminación, diseñe la fotomáscara de modo que esté compuesta por dos cuadrados de 1,5 x 1,5 cm (Figura 1A), uno lleno de una cuadrícula uniforme de círculos de 2 μm espaciados de 6 μm de centro a centro, y otro formado por muchas islas cuadradas que son versiones más pequeñas y aisladas de ese mismo patrón de cuadrícula (Figura 1B). Haga islas de los siguientes tamaños: 6 x 6 puntos, 12 x 12 puntos, 25 x 25 puntos y 42 x 42 puntos.
      NOTA: El diámetro de los puntos de adhesión (2 μm) se eligió en base a estudios previos que midieron las fuerzas de tracción celular22,23. La máscara utilizada aquí es de 101.6 x 101.6 mm y está recubierta en un lado con una capa de cromo de 0.06 μm de espesor, que se recomienda debido a las pequeñas características del maestro. La fotomáscara utilizada aquí fue encargada a una empresa externa de impresión de fotomáscaras.
  2. Dentro de una sala blanca, cubra la oblea de silicio elegida uniformemente con fotorresistente. Como paso opcional, trate la oblea en una superficie antes de cubrirla con resistencia.
    NOTA: Aquí se utilizan obleas de 100 mm de diámetro. El tratamiento en un asher de plasma hace que la oblea sea más susceptible de unirse a SU-8 y ayuda a prevenir la delaminación de SU-8 de la oblea.
  3. Realice los siguientes pasos de acuerdo con las instrucciones del fabricante de la fotorresistencia:
    1. Gire la oblea recubierta para crear el grosor de característica deseado, variando el tiempo de centrifugado en función del grosor deseado y el tipo de resistencia. Para un SU-8 2005 de 5 μm de espesor, divida el programa de centrifugado recomendado en los siguientes tres pasos:
      1. Cubra la oblea con fotorresistencia girando a 500 RPM durante 10 s con una rampa de 100 RPM/s.
      2. Reduzca el espesor de resistencia a aproximadamente 5 μm haciendo girar la oblea a 3.000 RPM con una rampa de 300 RPM/s durante 30 s.
      3. Desacelere lentamente la oblea después de girar reduciendo la velocidad a 0 RMP con una rampa de 500 RPM / s durante 1 s.
    2. Prepare la resistencia para la exposición a los rayos UV horneándola brevemente en una placa caliente de 95 ° C. Modifique el tiempo pasado en la placa caliente de acuerdo con el grosor deseado de la resistencia; El tiempo de cocción es de 2 min para un SU-8 2005 de 5 μm de espesor.
    3. Exponga la resistencia a la luz UV para curar completamente las características deseadas. Tenga cuidado con la sobreexposición, ya que esto puede hacer que su-8 sea frágil y afectar la calidad general del maestro resultante.
      1. Utilice una energía de exposición de 105 mJ/cm2 para un SU-8 2005 de 5 μm de espesor. En función de la potencia de la lámpara UV disponible, calcule el tiempo de exposición dividiendo la energía de exposición por la potencia de la lámpara en mW.
        NOTA: Como la lámpara utilizada aquí tiene una potencia de 8 mW, el tiempo de exposición debe ser de 13,1 s.
    4. Para configurar las características del SU-8 después del desarrollo, hornee nuevamente en una placa caliente de 95 ° C, esta vez durante 3 minutos. Espere a que aparezcan las características deseadas del maestro dentro de 1 minuto durante este paso de horneado si la resistencia se expuso correctamente.
    5. Retire el SU-8 sin curar de la oblea de silicio con el revelador SU-8. Sea minucioso al retirar el SU-8 sin curar, ya que puede atascarse entre las características del tamaño de micras y espaciadas en la oblea.
      PRECAUCIÓN: El revelador SU-8 es un irritante inflamable para la piel y los ojos; manténgalo alejado del calor / llamas / chispas y use guantes protectores y gafas cuando lo manipule.
    6. Después del desarrollo, enjuague con acetona para eliminar el exceso de revelador en la oblea y séquelo completamente con una pistola de pulverización de nitrógeno.
      PRECAUCIÓN: La acetona es un irritante inflamable para la piel y los ojos; manténgalo alejado de llamas / chispas y use guantes protectores y gafas cuando lo manipule.
    7. Opcionalmente, para SU-8 2005, hornee en una placa caliente de 200 °C durante 10 min.
      NOTA: Este horno duro agrega resistencia mecánica a la fotorresistente.
  4. Después de que se deje enfriar, coloque la oblea en una bandeja portadora de obleas y luego colóquela en PDMS. Primero, complete un tratamiento de silanización en la oblea para que las características SU-8 del maestro de silicio tengan menos probabilidades de unirse a PDMS y, por lo tanto, menos probabilidades de ser eliminadas de la superficie de la oblea.
    1. Para completar el tratamiento de la superficie de silanización, coloque el maestro y una pequeña cubierta de vidrio dentro de un desecador designado para su uso solo con silanos. Coloque 1-2 pequeñas gotas de tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano sobre el lape de cubierta, cierre el desecador y ejecútelo al vacío durante 30 min a una presión de 4,500 Pa24.
      PRECAUCIÓN: El tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano es un irritante inflamable para la piel y los ojos; manténgalo alejado del calor / llamas / chispas, use guantes protectores y gafas cuando lo manipule, y trabaje bajo una campana de humos.
    2. Apague la aspiradora y deje el maestro y el cubre el desecador en el desecador durante otros 30 minutos.
      NOTA: El maestro ya está listo para la conversión en PDMS.

2. Impresión sustractiva de microcontactos

  1. Mezcle PDMS en la proporción correcta de agente de curado a base según las instrucciones del fabricante. Déjelo reposar a temperatura ambiente y presión durante 15 min; luego, desgasificar al vacío durante 15 min.
  2. Vierta el PDMS en el maestro y colóquelo en una incubadora a 37 ° C durante la noche para curar.
  3. Retire el maestro de la incubadora y deje que se enfríe a temperatura ambiente.
  4. Mientras el maestro se está enfriando, sonice los recubiertos de 25 mm en etanol durante 10 minutos. Utilice tantas fundas como el número de sellos que se estén preparando.
  5. Enjuague bien las hojas de cubierta de 25 mm con agua desionizada (DI) y séquelas con una pistola de aire filtrado.
  6. El plasma trata las cubiertas durante 1 min utilizando un limpiador de plasma bajo vacío en alta (potencia de radiofrecuencia de 30 W). Asegúrese de liberar el vacío lentamente después del tratamiento para evitar que las cubiertas se muevan dentro de la cámara.
    NOTA: El tratamiento con plasma de la superficie del vidrio tiene dos propósitos: limpia la superficie del vidrio para eliminar contaminantes y genera grupos polares a base de oxígeno en la superficie del vidrio para que sea hidrófobo25. Esta hidrofobicidad hace que la superficie del vidrio sea más susceptible a la unión a proteínas.
  7. En una habitación desprovista de luz solar directa / iluminación cenital, cubra cada funda con 100 μL de solución de proteína marcada con fluorescente a una concentración de al menos 100 μg / ml, cubra para una protección adicional contra la luz y déjela reposar durante 20 minutos.
    NOTA: Aquí, se utiliza fibronectina aislada del plasma humano y teñida con AlexaFluor 488.
    1. Para teñir fibronectina, combine fibronectina no etiquetada de concentración y volumen conocidos con la cantidad adecuada de tinte fluorescente en un tubo de 1,5 ml. Cubra el tubo con papel de aluminio para proteger el tinte de la luz e incube a temperatura ambiente durante 1 h, mezclando suavemente cada 10 minutos girando el tubo boca abajo 5-10 veces.
      NOTA: La cantidad de colorante requerida varía según el tinte utilizado y la masa de proteína que se utilice. Consulte el Archivo suplementario 1 para obtener la calculadora utilizada para determinar la cantidad adecuada de tinte para fibronectina etiquetada con Alexa 488. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, el exceso de tinte se puede filtrar con el uso de columnas de desalinización (consulte la Tabla de materiales).
  8. Enjuague bien cada funda con agua DI y elimine el exceso de agua de la superficie golpeando suavemente los lados de cada funda sobre una toalla de papel o material absorbente similar. Deje los cubrehojas descubiertos en la oscuridad durante al menos 30 minutos para que se sequen por completo.
  9. Mientras las fundas recubiertas de proteína se secan, retire el sello PDMS del maestro cortándolo con un bisturí u otra cuchilla afilada.
    NOTA: Es mejor no intentar cortar el PDMS en el primer intento, ya que aplicar tanta presión agrietará la oblea de silicio y dañará el maestro.
  10. El plasma trata los sellos PDMS durante 2 min bajo vacío en alta frecuencia (potencia de radiofrecuencia de 30 W).
  11. Dentro de una campana extractora, coloque los sellos en un recipiente con tapa y cubra cada sello con una capa muy delgada (<100 μL) de 10% (3-aminopropil)trimetoxisilano (3-APTMS) diluido en etanol al 100%.
    PRECAUCIÓN: 3-APTMS es un irritante inflamable para la piel y los ojos; manténgalo alejado de llamas / chispas, use guantes protectores y gafas cuando lo manipule, y trabaje bajo una campana de humos. El recubrimiento excesivo de la solución 3-APTMS hará que se forme una película naranja más adelante en este proceso. Este tratamiento superficial 3-APTMS incorpora la funcionalidad de amina en la superficie del sello PDMS, lo que permitirá una mayor derivatización de la superficie del sello más adelante el26.
  12. Cubra el recipiente con los sellos y déjelos reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
  13. Usando agua DI, enjuague bien cada sello en ambos lados.
  14. Coloque los sellos en un recipiente limpio y cúbralos generosamente con glutaraldehído al 2,5% en agua DI.
    PRECAUCIÓN: El glutaraldehído es tóxico; use guantes protectores y gafas cuando manipule y trabaje bajo una capucha de humos). Este tratamiento con glutaraldehído junto con el tratamiento anterior con 3-APTMS proporciona funcionalidades de aldehído en la superficie de los sellos PDMS, que pueden reaccionar con los grupos amina en las proteínas para crear un enlace secundario de amina, que es crítico para el proceso de eliminación de proteínas27.
  15. Cubra los sellos, déjelos reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego enjuague bien con agua DI nuevamente. Retire el exceso de agua de la superficie de los sellos de la misma manera que las cubiertas y deje que los sellos se sequen al descubierto durante ~ 30 minutos.
  16. Después de 30 min, verifique si tanto las cubiertas recubiertas de proteínas como los sellos están secos. Si alguno de los dos no está completamente seco, use una pistola de aire filtrado para secarlos por completo, asegurándose de que las cubiertas no estén expuestas a la luz durante un período prolongado.
  17. Una vez que tanto las cubiertas como los sellos estén secos, empuje el patrón de los sellos hacia abajo sobre las cubiertas con suficiente presión para que los sellos entren en contacto completo con la superficie de la cubierta. Deje los sellos en contacto con las fundas durante 15 min.
    NOTA: Debido al enlace covalente de amida entre el sello de glutaraldehído con la capa de proteína en el lata de vidrio, que es mucho más fuerte que las interacciones hidrofóbicas débiles entre la capa de proteína y la cubierta de vidrio, las proteínas deben despegar el vidrio de acuerdo con el patrón en el sello PDMS una vez que se retira.
  18. Después de 15 minutos, despegue cuidadosamente los sellos PDMS de las fundas.
    NOTA: Si el proceso de extracción funcionó correctamente, los sellos no deben desprenderse de las fundas sin resistencia, sino que tampoco deben estar tan firmemente pegados a las fundas que no se puedan quitar sin fuerza excesiva.
  19. Compruebe la fidelidad de los cubrebocas estampados utilizando el filtro apropiado en un microscopio fluorescente (dependiendo del colorante fluorescente con el que estén marcadas las proteínas).
  20. Use los cubrebocas estampados inmediatamente o guárdelos y guárdelos lejos de la luz directa.

3. Fundas activadas

NOTA: Las cubiertas inferiores para su uso en la cámara experimental para geles PAA se fabrican en este paso. Este cubrehojas inferiores está especialmente tratado para permitir que el gel PAA permanezca adherido de forma segura a medida que se retira el cobertor con patrón superior durante el proceso de modelado. Técnicas similares también se describen en otra parte 10,12,15,28.

  1. Sonicar las hojas de cubierta de 30 mm en etanol al 100% durante 10 minutos, enjuagar con agua DI y luego secar completamente con una pistola de aire filtrado. Prepare hasta 6 fundas a la vez por lote en una placa de 6 pocillos.
  2. El plasma trata los coverslips durante 1 min en alta (potencia de radiofrecuencia de 30 W) y luego coloca cada coverslip en un pozo de una placa de 6 pocillos.
  3. Cubra cada funda con una capa muy delgada de 5% de APTMS en etanol en una campana de humos.
    NOTA: Se formará un residuo de naranja en caso de recubrimiento excesivo en este proceso.
  4. Cubra la placa de 6 pocillos y deje que las fundas reposen durante 5 minutos.
  5. Enjuague bien las cubiertas (ambos lados) y el interior de cada pozo con agua DI y elimine el exceso de agua dentro de los pozos.
  6. Coloque las cubiertas de nuevo en la placa de 6 pocillos y agregue aproximadamente 2 ml de glutaraldehído al 0.5% en agua DI.
  7. Cubra la placa de 6 pocillos y deje que las hojas de recubrimiento se asienten en la solución de glutaraldehído durante 30 minutos; luego, enjuague bien tanto las cubiertas como los pocillos de cada placa con agua DI.
  8. Guarde las cubiertas tratadas en agua DI dentro de las placas de 6 pocillos durante un máximo de dos semanas o úselas inmediatamente. Asegúrese de que las fundas estén completamente secas antes de su uso.

4. Fabricación de gel PAA y transferencia de patrones

NOTA: Una vez que se hacen los cubrehojas con patrones, deben usarse para transferir esos patrones de proteínas al hidrogel PAA poco después (<24 h)1,29,30. La siguiente receta es para un gel PAA con un módulo de Young de 3,6 kPa. Las cantidades de bis-acrilamida, acrilamida y agua DI se pueden variar para ajustar la rigidez de los geles PAA12.

  1. Justo antes de comenzar a fabricar el precursor de hidrogel PAA, retire el éster de ácido acrílico N-hidroxisuccinimida (NHS) del refrigerador para que pueda alcanzar la temperatura ambiente antes de abrirse. Prepare un juego de placas intercambiables esterilizando con etanol al 70% y dejándolo reposar bajo luz UV en un gabinete de bioseguridad durante al menos 30 minutos antes de su uso.
    PRECAUCIÓN: NHS es un irritante tóxico para la piel y los ojos; use guantes protectores y gafas cuando lo manipule, y trabaje bajo una capucha de humos.
    1. Agregue 1.25 ml de acrilamida al 40% en agua DI a un tubo cónico de 15 ml.
      PRECAUCIÓN: La acrilamida es un irritante tóxico para la piel y los ojos; use guantes protectores y gafas cuando lo manipule, y trabaje bajo una capucha de humos.
    2. Añadir 175 μL de solución de bis-acrilamida en agua DI al mismo tubo (paso 4.1.1).
      PRECAUCIÓN: La bisacrilamida es un irritante tóxico para la piel y los ojos; use guantes protectores y gafas cuando lo manipule, y trabaje bajo una capucha de humos.
    3. Añadir 500 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10x.
      PRECAUCIÓN: PBS es un irritante ocular; use guantes protectores y gafas cuando manipule.
    4. Añadir 2.915 mL de agua DI.
  2. Pipetear 969 μL de este precursor en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y almacenar el resto a 4 °C durante un máximo de dos semanas.
  3. Mida ~ 50-100 mg de persulfato de amonio (APS) en otro tubo de microcentrífuga y diluya en agua DI hasta 100 mg / ml; déjelo a un lado para usarlo más tarde. Abra el éster NHS (ahora a temperatura ambiente) en la campana y mida cuidadosamente hasta 3 mg de NHS en un tubo de microcentrífuga. Diluya el éster NHS a 1 mg/ml en 1x PBS.
    PRECAUCIÓN: APS es un irritante de la piel y los ojos; use guantes protectores y gafas cuando lo manipule, y trabaje bajo una capucha de humos. Tanto APS como NHS-ester se hidrolizarán con el tiempo, haciendo que la actividad de los productos químicos en la solución madre varíe. Por lo tanto, ambas soluciones deben prepararse frescas cada vez (a diferencia del resto del precursor).
  4. Realice los siguientes tres pasos en una campana extractora de humos:
    1. Añadir 2 μL de tetrametilendiamina (TEMED) al tubo de la microcentrífuga que contiene la alícuota de 969 μL del precursor de PAA.
      PRECAUCIÓN: TEMED es un irritante inflamable para la piel y los ojos; manténgalo alejado del calor / llama / chispas, use guantes protectores y gafas cuando lo manipule, y trabaje bajo una campana de humos. TEMED es uno de los dos agentes de reticulación críticos para la polimerización del hidrogel PAA, el otro es APS.
    2. Agregue 15 μL de ácido clorhídrico 1 M para disminuir el pH de la solución de hidrogel y evitar la hidrólisis del éster NHS.
      PRECAUCIÓN: El ácido clorhídrico es un irritante corrosivo para la piel y los ojos; use guantes protectores y gafas cuando lo manipule, y trabaje bajo una capucha de humos.
    3. Añadir 10 μL de la solución de éster NHS al tubo.
      NOTA: El NHS es fundamental para el proceso de modelado. Reaccionará con los grupos amina en las proteínas en el cobertor estampado para formar un enlace amida estable, lo que permitirá que el patrón se transfiera desde la cubierta de vidrio a la superficie del gel PAA a medida que polimeriza31.
  5. Realice estos pasos finales en un gabinete de bioseguridad:
    1. Coloque cuidadosamente la cubierta de 30 mm dentro de la parte metálica del juego de platos de la cubierta (3-APTMS y glutaraldehído tratado con el lado hacia arriba) y atornille el anillo de plástico en la parte superior. Configure el estuche estampado para que se pueda alcanzar fácilmente en el siguiente paso, protegiéndolo de la luz tanto como sea posible.
    2. Pipetear 5 μL de solución de APS en el resto del precursor de PAA en el tubo de la microcentrífuga, invertirlo para mezclar y luego pipetear inmediatamente 35 μL de esa solución en el recubierto de 30 mm.
    3. Deje caer el lado de la proteína de la cubierta patrón hacia abajo sobre la solución, teniendo cuidado de no crear burbujas de aire en el hidrogel. Proteja el hidrogel de la luz y deje que polimerice durante 90 min.
    4. Una vez que el hidrogel se haya polimerizado, use una cuchilla de afeitar o un bisturí para eliminar el cobertor superior, asegurándose de que el coverlip no se deslice del gel ni vuelva a caer sobre el gel una vez que se haya eliminado, ya que esto arruinará el patrón en la superficie del gel.
      NOTA: No deje el gel descubierto en un área con flujo de aire significativo (como un gabinete de bioseguridad).
    5. Para pasivar cualquier éster NHS restante en el hidrogel, agregue 2 ml de PBS estéril al gel e incube a 37 ° C durante 45 min. Prepare inmediatamente los geles para experimentos o guárdelos durante la noche en PBS estéril a 4 °C hasta su uso.

5. Imágenes

  1. Para prepararse para los experimentos con células, encienda el calor (37 ° C) y la humedad (70%) en el microscopio la tarde antes de un experimento planificado para permitir que el equipo dentro de la cámara del microscopio se equilibre a la temperatura más alta.
    NOTA: Este paso minimiza la deriva z causada por las fluctuaciones de temperatura.
  2. Justo antes del inicio del experimento, encienda la fuente de CO2 de la cámara.
  3. Para evitar la deriva x-y causada por el movimiento repetido de la etapa del microscopio durante el experimento, fije el conjunto de placas de cubierta intercambiables que sostiene el hidrogel con semillas celulares en el escenario con cinta adhesiva de doble cara.
  4. Revise el gel para encontrar marcos de interés para la imagen, guardando cada posición de etapa de las secciones a fotografiar.
  5. Tanto en la vista de campo brillante como en la vista fluorescente correspondiente a la proteína marcada, configure el software del microscopio para obtener imágenes de cada fotograma una vez cada 5 minutos durante 2 h.

6. Análisis de imágenes

NOTA: Se ha desarrollado un sistema que puede medir la deformación de los geles PAA modelados determinando la ubicación de los puntos de tracción, interpolando las ubicaciones iniciales de los puntos deformados y luego calculando las fuerzas de tracción celular en cada ubicación. Se puede utilizar cualquier sistema de software capaz de realizar procesamiento de imágenes y cálculos numéricos. El programa tiene como objetivo determinar las fuerzas de tracción rápidamente, eliminando los procedimientos de entrada y preprocesamiento del usuario que contribuirían a los errores relacionados con el usuario. El código utilizado aquí está disponible aquí como Archivos suplementarios 2-10, y se puede acceder a estos archivos, junto con un par de imágenes de práctica, en www.bu.edu/mml/downloads.

  1. En un software de procesamiento de imágenes, abra todas las imágenes individuales tomadas durante un experimento de lapso de tiempo desde cada vista de microscopio utilizada en orden, desde la primera hasta la última imagen capturada, y conviértalas en una sola pila de imágenes (haciendo clic en Imagen | Pilas | Imágenes para apilar). Asegúrese de que hay dos pilas de imágenes separadas: una de la vista de campo brillante de las celdas y otra de la vista fluorescente del patrón al que están unidas.
    1. Si hay deriva en las imágenes fluorescentes (es decir, la isla de interés se mueve en la dirección x y / o y entre cada fotograma en > 1-2 μm), primero procese la pila de imágenes con el complemento StackReg (P. Thévenaz, Instituto Federal Suizo de Tecnología de Lausana) para volver a centrar cada imagen en la pila en función de la posición de la primera (haciendo clic en Complementos | | StackReg Traducción | De acuerdo).
      NOTA: Esto es crítico porque incluso la deriva sub-μm puede afectar significativamente el cálculo final de las fuerzas de tracción, especialmente en geles más rígidos donde esta deriva x-y está fuera del rango de ruido esperado. Este código guardará las imágenes después de que se haya eliminado la deriva, que luego se puede convertir en una nueva pila de imágenes para analizar.
  2. Introduzca las pilas de imágenes de campo brillante y fluorescentes en CTFTimelapse.m (Archivo suplementario 2).
    1. Especifique el directorio de archivos donde se encuentran las pilas de imágenes en la línea 7.
    2. En las líneas 8 y 9, especifique los nombres de la pila de imágenes fluorescentes y la pila fluorescente de campo brillante correspondiente, respectivamente.
    3. Especifique la rigidez del gel PAA (Pa):
      1. En las líneas 11-14, que incluyen algunos módulos elásticos diferentes de hidrogeles PAA utilizados con mayor frecuencia, comente (tipo % al comienzo de la línea) todos menos el módulo elástico del gel en las imágenes que se analizan. Alternativamente, agregue el módulo elástico si aún no está presente y comente el resto (3658.19 Pa para imágenes de prueba).
    4. Especifique el radio de punto (m) en la línea 15 (1 × 10-6 m para las imágenes de prueba).
    5. Especifique el diámetro máximo de puntos posible (μm) en la línea 16 (2,5 μm para las imágenes de prueba).
    6. Especifique la relación de píxeles (μm/píxel):
      1. En las líneas 17-20, que incluyen algunas proporciones de píxeles de imagen diferentes basadas en las configuraciones de imagen utilizadas anteriormente, comente (escriba % al comienzo de la línea) todos menos la relación de píxeles de las imágenes que se están analizando. Alternativamente, agregue la relación de píxeles utilizada si aún no está presente y comente el resto (0.1613 μm / píxel para las imágenes de prueba).
    7. En las líneas 35 y 87, especifique el directorio de archivos donde se encuentran los archivos de procesamiento de imágenes necesarios.
      NOTA: A partir de la pila de imágenes fluorescentes, el código determina la ubicación de cada punto fluorescente y realiza un seguimiento del movimiento de cada punto entre cada imagen de la pila20. La posición inicial de los puntos impresos de microcontacto es conocida porque no se deforman cuando se transfieren correctamente al hidrogel32.
  3. Espere a que aparezcan dos figuras y un cuadro de diálogo una vez que el programa encuentre los puntos. Utilice la Figura 1 para asegurarse de que el programa ha encontrado los puntos correctos y no ha encontrado muchos puntos donde no los había. Utilice la Figura 2 para elegir la cuadrícula rectangular que ayuda al programa a localizar y calcular las fuerzas de tracción celular.
    NOTA: La Figura 1 es la imagen de campo brillante de la celda con los puntos encontrados por el programa (que serán rojos) superpuestos sobre ella (ver Figura 3A). La Figura 2 es una imagen que muestra los mismos puntos que se muestran en la Figura 1 pero sin la imagen de campo brillante en el fondo.
    1. Espere a que el cuadro de diálogo le pida que presione Entrar después de seleccionar punto, en el que cada punto es uno de los puntos rojos encontrados por el programa, y tiene un botón grande dentro de él etiquetado Entrar.
    2. Elija cuatro puntos diferentes en la Figura 2 para crear una cuadrícula rectangular alrededor e incluyendo la celda/clúster en ese patrón. Seleccione cada punto uno por uno con un clic izquierdo del mouse y confírmelo presionando Enter en el botón en el cuadro de diálogo antes mencionado. Mantenga la cuenta de cuántos puntos hay entre el primer y segundo punto, así como el primer y tercer punto, ya que el programa solicitará estos valores una vez que se hayan seleccionado los puntos de las cuatro esquinas. Introduzca estos valores en la ventana de comandos (escriba el número de puntos y haga clic en el botón Intro del teclado cuando se le solicite).
  4. Una vez elegida la cuadrícula rectangular, espere a que el script calcule las fuerzas de tracción que encuentra dentro de la cuadrícula en función de las ubicaciones de los puntos fluorescentes. Tenga en cuenta que el script primero encuentra el vector de desplazamiento (u) del centro geométrico de cada punto y luego calcula el vector de fuerza de tracción (F) correspondiente usando Eq (1):
    figure-protocol-1(1)
    Donde E es el módulo de Young del sustrato PAA, a es el radio de los marcadores de puntos fluorescentes, y ν es la relación de Poisson del sustrato PAA32. Eq (1) asume que el sustrato es un semiespacio elástico infinito, que las fuerzas de tracción se aplican en el centro de cada marcador de puntos circulares y que el espaciado entre los marcadores de puntos es lo suficientemente grande como para que sus respectivos desplazamientos no interactúen entre sí23.
    NOTA: En los experimentos descritos aquí, se utilizan marcadores de puntos de radio a = 1 μm y 6 μm de espaciado de centro a centro. Las flechas de fuerza de tracción dentro de la celda / grupo que apuntan hacia adentro hacia el centro de la celda deben estar presentes, mientras que el área fuera de la celda / grupo no debe tener flechas de tracción presentes (ver Figura 3C-E). Las flechas de tracción que apuntan hacia afuera desde el interior de la celda / grupo o muchas flechas de tracción grandes presentes fuera de la celda son indicativas de una cuadrícula rectangular mal elegida.
  5. Una vez que se encuentre el campo de tracción correcto, seleccione una región de interés (ROI) apropiada que rodee la celda / clúster, que incluye todas las flechas de tracción dentro de la celda usando el cursor.
    1. Para dibujar el ROI, haga clic con el botón izquierdo tantas veces como sea necesario para dibujar una forma de polígono con tantos lados como desee, ajuste la forma o mueva el ROI después de dibujarlo haciendo clic con el botón izquierdo en las esquinas o bordes, respectivamente. Una vez que se dibuja el ROI, haga doble clic izquierdo para pasar a la siguiente imagen de la pila. Repita esto para todas las imágenes de la pila de campos brillantes.
      NOTA: El código guardará datos de fuerza de tracción y desplazamiento para cada punto de tiempo en la misma carpeta que las pilas de imágenes originales, que luego se pueden analizar más a fondo.

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Resultados

Los hidrogeles PAA con el módulo de Young de E = 3,6 kPa y la relación de Poisson de ν = 0,445 se hicieron para su uso mediante este método de micropatronaje sustractivo. Los hidrogeles se hicieron para tener ~ 100 μm de espesor, lo que les permite ser fotografiados con la configuración de imágenes utilizada aquí, al tiempo que evita que las células detecten el capa rígida debajo del gel, lo que causaría problemas en los estudios centrados en la detección de rigidez celular23,33<...

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Discusión

En este documento se describe un método mejorado de modelado indirecto de hidrogeles PAA. Este enfoque se basa en métodos que se han utilizado anteriormente 20,35,36,37,38,39,40,41,42. El cambio principal es que los sellos...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Dr. Paul Barbone del Departamento de Ingeniería Mecánica de la Universidad de Boston por las útiles discusiones y la asistencia con el análisis de datos. Este estudio fue apoyado por la subvención CMMI-1910401 de la NSF.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
(3-aminopropil)trimetoxisilanoSigma Aldrich#281778
1.5 mL Tubo de microcentrífugaFisher Scientific#05-408-129
Tubo cónico de 15 mLFisher Scientific#05-539-12
4 x 4 en 0.060 Cuarzo LR Cromo FotomáscaraAdvance Reproductions CorporationN/AMascarilla diseñada a medida
6 placas de pocillosFisher Scientific#07-200-83
AcetonaFisher Scientific#A18P-4
Solución de acrilamida, 40%Sigma Aldrich#A4058
AlexaFluor 488Thermo Fisher#A20000
Persulfato de aminonioFisher Scientific#BP179-25
BisacrilamidaFisher Scientific#PR-V3141
EtanolGreenfield Global#111000200C1GL
Cubreobjetos de vidrio, redondos de 25 mmFisher Scientifc#12-545-102
Cubreobjetos de vidrio, redondos de 30 mmWarner#64-1499
Cámara Hamamatsu ORCA-R2 Hamamatsu#C10600-10B
Human Plasma ValleyBiomedical#HP1051PUtilizado para aislar fibronectina
Ácido clorhídrico, 1.0 NMillipore Sigma#1.09057
ImageJWayne Rasband#1.53N
Juego de platos intercambiablesBioptechs#190310-35
Toallitas Kim FisherScientific#06-666-11C
Mascarilla AlingerKarl Suss#MA6
Matlab 2021Mathworks#R2021a
MetaMorph BasicMolecular Devices#v7.7.1.0
N-hidroxisuccinimida ésterSigma Aldrich#130672-5G
NucBlue Tinción de celda vivaThermo Fisher#R37605
Olympus IX2-ZDC Microscopio invertidoOlympus#IX81
PD-10 Columnas de desalinización GEHealthcare#52-1308-00
Campana giratoria fotorresistenteHeadway Research#PWM32
Limpiador de plasmaHarrick#PDC-001
Grabador de plasmaTePla#M4L
Fuente de luz Prior Lumen 200ProPrior Scientific
Obleas de silicona, oblea universitaria de 100 mm#809
SU-8 2005Kayaku Materiales Avanzados Inc.
Desarrollador de SU-8Kayaku Advanced Materials Inc.
Sylgard 184 Elastómero de siliconaEssex Brownell#DC-184-1.1
TetrametiletilendiaminaFisher Scientific#BP150-20
Tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silanoSigma Aldrich#448931
UAPON-40XW340 ObjetivoOlympus#N2709300
Exposicióna inundaciones UVNewport#69910
Bandeja portadora de obleas, 110 x 11 mmTed Pella, Inc.#19395-40
#L200 #NC9463827#NC9901158

Referencias

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