Generación de patrones para microscopía de tracción de micropatrones

La mayoría de los fenotipos celulares ejercen fuerzas de tracción sobre su entorno. Estas fuerzas de tracción son generadas por el citoesqueleto contráctil de una célula, que es una red de actina y miosina, y otros biopolímeros filamentosos y proteínas^{de reticulación} 1,2,3,4. Las fuerzas generadas dentro de la célula pueden transmitirse al entorno extracelular o a las células adyacentes, principalmente a través de proteínas transmembrana como las integrinas y las cadherinas, respectivamente ^5,6. La forma en que una célula se propaga o contrae,y las magnitudes de las fuerzas de tracción asociadas a esos movimientos-- es el resultado de una conversación íntima con su entorno, que depende en gran medida del tipo y cantidad de proteína presente en la matriz extracelular (ECM)^7,8 y de la rigidez de la ECM. De hecho, la microscopía de fuerza de tracción se ha convertido en una herramienta invaluable para comprender la capacidad de respuesta de las células a estímulos locales como la rigidez del sustrato, las tensiones y tensiones mecánicas impuestas o el contacto con otras células. Esta información es directamente relevante para la comprensión de enfermedades como el cáncer y^{el asma} 9,10,11,12.

Se requiere un sistema que se pueda utilizar para medir la deformación inducida por la fuerza de un sustrato de propiedades de material conocidas para calcular las fuerzas de tracción. Estos cambios deben rastrearse a lo largo del tiempo, lo que requiere técnicas de procesamiento de imágenes e imágenes. Uno de los primeros métodos utilizados para determinar las fuerzas de tracción celular fue la observación y análisis de la contracción de hidrogeles de colágeno sembrados con células, aunque este método fue solo semicuantitativo¹³. Otro método más refinado fue medir las fuerzas de tracción ejercidas por células individuales determinando las fuerzas resultantes de la deformación de una lámina delgada de silicona¹⁴. Posteriormente, se desarrollaron técnicas de medición más cuantitativas, y estos métodos también permitieron el uso de hidrogeles blandos como la poliacrilamida (PAA)12,15,16. Cuando se utilizan estos materiales blandos, las fuerzas de tracción podrían determinarse a partir del desplazamiento inducido por la fuerza de perlas desplazadas aleatoriamente incrustadas en el hidrogel y las propiedades mecánicas del gel^16,17. Otro avance vino con el desarrollo de matrices de micropostes hechas de polidimetilsiloxano blando (PDMS) para que su deflexión pudiera medirse y convertirse en fuerza utilizando la teoría del haz¹⁸.

Finalmente, se desarrollaron métodos para micromodelar hidrogeles blandos, ya que estos enfoques permiten el control de las áreas de contacto para la adhesión celular. Al medir la deformación del micromodelo dentro del área de contacto de una célula, las fuerzas de tracción podrían calcularse fácilmente porque no se requiere una imagen de referencia libre de fuerza¹⁹. Este método ha sido ampliamente adoptado, ya que permite el modelado indirecto de una matriz regular de puntos de adhesión de proteínas fluorescentes discretas del tamaño de micras en geles PAA para la medición de fuerzas de tracción celular²⁰. Para calcular estas fuerzas, se ha desarrollado un algoritmo de procesamiento de imágenes, que puede rastrear los movimientos de cada punto micropatronado sin requerir la entrada del usuario²¹.

Si bien este método es simple para crear cuadrículas completas de patrones de puntos, es más complicado cuando se desean patrones de parches aislados (o islas) de puntos. Las islas micropatronadas son útiles cuando se necesita el control de la forma, y en cierta medida del tamaño, de los grupos de células. Para crear estas islas, el método mencionado de impresión de microcontactos requiere dos pasos distintos: i) usar un sello PDMS para crear un patrón de puntos de alta fidelidad en un coverslip, y luego ii) usar un segundo sello PDMS diferente para eliminar la mayoría de esos puntos, dejando atrás islas aisladas de puntos²¹. La dificultad de crear islas con este método original se ve agravada por el hecho de que hacer patrones de cuadrícula consistentes en el primer paso del proceso es un desafío por sí solo. Los sellos de microimpresión se componen de una matriz de micropostos circulares, cuyo diámetro corresponde al tamaño de punto deseado. Estos sellos se recubren con una capa uniforme de proteína y luego se estampan con una cantidad precisa de presión sobre las cubiertas tratadas para crear el patrón deseado. Por un lado, aplicar demasiada presión al sello puede resultar en una transferencia desigual de proteínas y una fidelidad de patrón deficiente debido al pandeo o flacidez del pilar entre los pilares, lo que lleva al contacto con el vidrio. Por otro lado, aplicar muy poca presión resulta en poca o ninguna transferencia de proteínas y una fidelidad de patrón deficiente. Por estas razones, se desea un proceso de transferencia que se pueda utilizar para crear constantemente micropatrones de alta calidad de islas aisladas de puntos en un solo paso.

Aquí, se describe un método para el micropatronaje indirecto de islas de puntos de adhesión de proteínas fluorescentes del tamaño de micras en un gel PAA que es más consistente y versátil que los métodos desarrollados anteriormente. Mientras que los métodos de micropatronaje indirecto más antiguos se basan en la transferencia de patrones de proteínas de un sello PDMS a un sustrato intermedio, el método introducido aquí utiliza sellos PDMS en su lugar como un recipiente para la eliminación de proteínas, no para la adición. Esto se hace cambiando primero fundamentalmente la estructura de los sellos PDMS utilizados. En lugar de hacer sellos que se componen de un patrón de pilares circulares espaciados uniformemente, los sellos se componen de un patrón de agujeros circulares espaciados uniformemente en este método.

Con esta nueva estructura, la superficie de estos sellos PDMS se puede tratar con glutaraldehído como se describió anteriormente^20,29,30, haciendo que el sello pueda unirse covalentemente con la proteína. Cuando se usan en una funda de vidrio recubierta uniformemente con proteína fluorescente, estos sellos PDMS tratados con glutaraldehído se utilizan para eliminar la mayor parte de la proteína en la superficie de la hoja de cubierta, dejando atrás solo el patrón deseado de puntos predeterminado por la ubicación de agujeros del tamaño de micras en el sello. Este cambio aumenta la tasa de éxito para generar patrones formados por una cuadrícula casi continua de puntos y para crear islas aisladas de puntos a través de un solo paso.

1. Creación de maestros de silicona

NOTA: La mayor parte del proceso de diseño, creación y solución de problemas de maestros de silicio para el moldeo repetido de sellos PDMS se ha cubierto anteriormente²¹, por lo que solo se describirán aquí las diferencias clave en este nuevo enfoque.

1. Cree el diseño de la fotomáscara utilizando AutoCAD o un software de diseño similar. Cubra un lado de la fotomáscara, una pieza delgada de vidrio, con una fina capa de cromo para controlar la dispersión de la luz UV. Diseñe la fotomáscara de modo que la luz UV brillante a través de ella en la fotorresistente elegida cree un maestro de silicona con la inversa de las características deseadas en los sellos PDMS finales. Consulte la Figura 1 para ver el diseño de esta máscara.
   NOTA: Si las características deseadas o el área fuera de ellas deben hacerse transparentes en la fotomáscara depende de la fotorresistente elegida. La fotorresistente utilizada aquí es SU-8 2005 (PRECAUCIÓN: inflamable, irritante para la piel y los ojos; manténgase alejado del calor / llamas / chispas y use guantes protectores y gafas cuando manipule), una fotorresistente negativa que es capaz de hacer características de 5 μm de altura con paredes laterales casi verticales.
   1. Curar la fotorresistente negativa exponiéndola a la luz UV y eliminando el SU-8 sin curar con un disolvente químico. Por lo tanto, diseñe las características principales de la máscara para que sean transparentes mientras que el área circundante de la máscara es opaca.
   2. Para este nuevo método de eliminación, diseñe la fotomáscara de modo que esté compuesta por dos cuadrados de 1,5 x 1,5 cm (Figura 1A), uno lleno de una cuadrícula uniforme de círculos de 2 μm espaciados de 6 μm de centro a centro, y otro formado por muchas islas cuadradas que son versiones más pequeñas y aisladas de ese mismo patrón de cuadrícula (Figura 1B). Haga islas de los siguientes tamaños: 6 x 6 puntos, 12 x 12 puntos, 25 x 25 puntos y 42 x 42 puntos.
      NOTA: El diámetro de los puntos de adhesión (2 μm) se eligió en base a estudios previos que midieron las fuerzas de tracción celular^22,23. La máscara utilizada aquí es de 101.6 x 101.6 mm y está recubierta en un lado con una capa de cromo de 0.06 μm de espesor, que se recomienda debido a las pequeñas características del maestro. La fotomáscara utilizada aquí fue encargada a una empresa externa de impresión de fotomáscaras.
2. Dentro de una sala blanca, cubra la oblea de silicio elegida uniformemente con fotorresistente. Como paso opcional, trate la oblea en una superficie antes de cubrirla con resistencia.
   NOTA: Aquí se utilizan obleas de 100 mm de diámetro. El tratamiento en un asher de plasma hace que la oblea sea más susceptible de unirse a SU-8 y ayuda a prevenir la delaminación de SU-8 de la oblea.
3. Realice los siguientes pasos de acuerdo con las instrucciones del fabricante de la fotorresistencia:
   1. Gire la oblea recubierta para crear el grosor de característica deseado, variando el tiempo de centrifugado en función del grosor deseado y el tipo de resistencia. Para un SU-8 2005 de 5 μm de espesor, divida el programa de centrifugado recomendado en los siguientes tres pasos:
      1. Cubra la oblea con fotorresistencia girando a 500 RPM durante 10 s con una rampa de 100 RPM/s.
      2. Reduzca el espesor de resistencia a aproximadamente 5 μm haciendo girar la oblea a 3.000 RPM con una rampa de 300 RPM/s durante 30 s.
      3. Desacelere lentamente la oblea después de girar reduciendo la velocidad a 0 RMP con una rampa de 500 RPM / s durante 1 s.
   2. Prepare la resistencia para la exposición a los rayos UV horneándola brevemente en una placa caliente de 95 ° C. Modifique el tiempo pasado en la placa caliente de acuerdo con el grosor deseado de la resistencia; El tiempo de cocción es de 2 min para un SU-8 2005 de 5 μm de espesor.
   3. Exponga la resistencia a la luz UV para curar completamente las características deseadas. Tenga cuidado con la sobreexposición, ya que esto puede hacer que su-8 sea frágil y afectar la calidad general del maestro resultante.
      1. Utilice una energía de exposición de 105 mJ/cm² para un SU-8 2005 de 5 μm de espesor. En función de la potencia de la lámpara UV disponible, calcule el tiempo de exposición dividiendo la energía de exposición por la potencia de la lámpara en mW.
         NOTA: Como la lámpara utilizada aquí tiene una potencia de 8 mW, el tiempo de exposición debe ser de 13,1 s.
   4. Para configurar las características del SU-8 después del desarrollo, hornee nuevamente en una placa caliente de 95 ° C, esta vez durante 3 minutos. Espere a que aparezcan las características deseadas del maestro dentro de 1 minuto durante este paso de horneado si la resistencia se expuso correctamente.
   5. Retire el SU-8 sin curar de la oblea de silicio con el revelador SU-8. Sea minucioso al retirar el SU-8 sin curar, ya que puede atascarse entre las características del tamaño de micras y espaciadas en la oblea.
      PRECAUCIÓN: El revelador SU-8 es un irritante inflamable para la piel y los ojos; manténgalo alejado del calor / llamas / chispas y use guantes protectores y gafas cuando lo manipule.
   6. Después del desarrollo, enjuague con acetona para eliminar el exceso de revelador en la oblea y séquelo completamente con una pistola de pulverización de nitrógeno.
      PRECAUCIÓN: La acetona es un irritante inflamable para la piel y los ojos; manténgalo alejado de llamas / chispas y use guantes protectores y gafas cuando lo manipule.
   7. Opcionalmente, para SU-8 2005, hornee en una placa caliente de 200 °C durante 10 min.
      NOTA: Este horno duro agrega resistencia mecánica a la fotorresistente.
4. Después de que se deje enfriar, coloque la oblea en una bandeja portadora de obleas y luego colóquela en PDMS. Primero, complete un tratamiento de silanización en la oblea para que las características SU-8 del maestro de silicio tengan menos probabilidades de unirse a PDMS y, por lo tanto, menos probabilidades de ser eliminadas de la superficie de la oblea.
   1. Para completar el tratamiento de la superficie de silanización, coloque el maestro y una pequeña cubierta de vidrio dentro de un desecador designado para su uso solo con silanos. Coloque 1-2 pequeñas gotas de tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano sobre el lape de cubierta, cierre el desecador y ejecútelo al vacío durante 30 min a una presión de 4,500 Pa²⁴.
      PRECAUCIÓN: El tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano es un irritante inflamable para la piel y los ojos; manténgalo alejado del calor / llamas / chispas, use guantes protectores y gafas cuando lo manipule, y trabaje bajo una campana de humos.
   2. Apague la aspiradora y deje el maestro y el cubre el desecador en el desecador durante otros 30 minutos.
      NOTA: El maestro ya está listo para la conversión en PDMS.

2. Impresión sustractiva de microcontactos

1. Mezcle PDMS en la proporción correcta de agente de curado a base según las instrucciones del fabricante. Déjelo reposar a temperatura ambiente y presión durante 15 min; luego, desgasificar al vacío durante 15 min.
2. Vierta el PDMS en el maestro y colóquelo en una incubadora a 37 ° C durante la noche para curar.
3. Retire el maestro de la incubadora y deje que se enfríe a temperatura ambiente.
4. Mientras el maestro se está enfriando, sonice los recubiertos de 25 mm en etanol durante 10 minutos. Utilice tantas fundas como el número de sellos que se estén preparando.
5. Enjuague bien las hojas de cubierta de 25 mm con agua desionizada (DI) y séquelas con una pistola de aire filtrado.
6. El plasma trata las cubiertas durante 1 min utilizando un limpiador de plasma bajo vacío en alta (potencia de radiofrecuencia de 30 W). Asegúrese de liberar el vacío lentamente después del tratamiento para evitar que las cubiertas se muevan dentro de la cámara.
   NOTA: El tratamiento con plasma de la superficie del vidrio tiene dos propósitos: limpia la superficie del vidrio para eliminar contaminantes y genera grupos polares a base de oxígeno en la superficie del vidrio para que sea hidrófobo²⁵. Esta hidrofobicidad hace que la superficie del vidrio sea más susceptible a la unión a proteínas.
7. En una habitación desprovista de luz solar directa / iluminación cenital, cubra cada funda con 100 μL de solución de proteína marcada con fluorescente a una concentración de al menos 100 μg / ml, cubra para una protección adicional contra la luz y déjela reposar durante 20 minutos.
   NOTA: Aquí, se utiliza fibronectina aislada del plasma humano y teñida con AlexaFluor 488.
   1. Para teñir fibronectina, combine fibronectina no etiquetada de concentración y volumen conocidos con la cantidad adecuada de tinte fluorescente en un tubo de 1,5 ml. Cubra el tubo con papel de aluminio para proteger el tinte de la luz e incube a temperatura ambiente durante 1 h, mezclando suavemente cada 10 minutos girando el tubo boca abajo 5-10 veces.
      NOTA: La cantidad de colorante requerida varía según el tinte utilizado y la masa de proteína que se utilice. Consulte el Archivo suplementario 1 para obtener la calculadora utilizada para determinar la cantidad adecuada de tinte para fibronectina etiquetada con Alexa 488. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, el exceso de tinte se puede filtrar con el uso de columnas de desalinización (consulte la Tabla de materiales).
8. Enjuague bien cada funda con agua DI y elimine el exceso de agua de la superficie golpeando suavemente los lados de cada funda sobre una toalla de papel o material absorbente similar. Deje los cubrehojas descubiertos en la oscuridad durante al menos 30 minutos para que se sequen por completo.
9. Mientras las fundas recubiertas de proteína se secan, retire el sello PDMS del maestro cortándolo con un bisturí u otra cuchilla afilada.
   NOTA: Es mejor no intentar cortar el PDMS en el primer intento, ya que aplicar tanta presión agrietará la oblea de silicio y dañará el maestro.
10. El plasma trata los sellos PDMS durante 2 min bajo vacío en alta frecuencia (potencia de radiofrecuencia de 30 W).
11. Dentro de una campana extractora, coloque los sellos en un recipiente con tapa y cubra cada sello con una capa muy delgada (<100 μL) de 10% (3-aminopropil)trimetoxisilano (3-APTMS) diluido en etanol al 100%.
    PRECAUCIÓN: 3-APTMS es un irritante inflamable para la piel y los ojos; manténgalo alejado de llamas / chispas, use guantes protectores y gafas cuando lo manipule, y trabaje bajo una campana de humos. El recubrimiento excesivo de la solución 3-APTMS hará que se forme una película naranja más adelante en este proceso. Este tratamiento superficial 3-APTMS incorpora la funcionalidad de amina en la superficie del sello PDMS, lo que permitirá una mayor derivatización de la superficie del sello más adelante el²⁶.
12. Cubra el recipiente con los sellos y déjelos reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
13. Usando agua DI, enjuague bien cada sello en ambos lados.
14. Coloque los sellos en un recipiente limpio y cúbralos generosamente con glutaraldehído al 2,5% en agua DI.
    PRECAUCIÓN: El glutaraldehído es tóxico; use guantes protectores y gafas cuando manipule y trabaje bajo una capucha de humos). Este tratamiento con glutaraldehído junto con el tratamiento anterior con 3-APTMS proporciona funcionalidades de aldehído en la superficie de los sellos PDMS, que pueden reaccionar con los grupos amina en las proteínas para crear un enlace secundario de amina, que es crítico para el proceso de eliminación de proteínas²⁷.
15. Cubra los sellos, déjelos reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego enjuague bien con agua DI nuevamente. Retire el exceso de agua de la superficie de los sellos de la misma manera que las cubiertas y deje que los sellos se sequen al descubierto durante ~ 30 minutos.
16. Después de 30 min, verifique si tanto las cubiertas recubiertas de proteínas como los sellos están secos. Si alguno de los dos no está completamente seco, use una pistola de aire filtrado para secarlos por completo, asegurándose de que las cubiertas no estén expuestas a la luz durante un período prolongado.
17. Una vez que tanto las cubiertas como los sellos estén secos, empuje el patrón de los sellos hacia abajo sobre las cubiertas con suficiente presión para que los sellos entren en contacto completo con la superficie de la cubierta. Deje los sellos en contacto con las fundas durante 15 min.
    NOTA: Debido al enlace covalente de amida entre el sello de glutaraldehído con la capa de proteína en el lata de vidrio, que es mucho más fuerte que las interacciones hidrofóbicas débiles entre la capa de proteína y la cubierta de vidrio, las proteínas deben despegar el vidrio de acuerdo con el patrón en el sello PDMS una vez que se retira.
18. Después de 15 minutos, despegue cuidadosamente los sellos PDMS de las fundas.
    NOTA: Si el proceso de extracción funcionó correctamente, los sellos no deben desprenderse de las fundas sin resistencia, sino que tampoco deben estar tan firmemente pegados a las fundas que no se puedan quitar sin fuerza excesiva.
19. Compruebe la fidelidad de los cubrebocas estampados utilizando el filtro apropiado en un microscopio fluorescente (dependiendo del colorante fluorescente con el que estén marcadas las proteínas).
20. Use los cubrebocas estampados inmediatamente o guárdelos y guárdelos lejos de la luz directa.

3. Fundas activadas

NOTA: Las cubiertas inferiores para su uso en la cámara experimental para geles PAA se fabrican en este paso. Este cubrehojas inferiores está especialmente tratado para permitir que el gel PAA permanezca adherido de forma segura a medida que se retira el cobertor con patrón superior durante el proceso de modelado. Técnicas similares también se describen en otra parte 10,12,15,28.

1. Sonicar las hojas de cubierta de 30 mm en etanol al 100% durante 10 minutos, enjuagar con agua DI y luego secar completamente con una pistola de aire filtrado. Prepare hasta 6 fundas a la vez por lote en una placa de 6 pocillos.
2. El plasma trata los coverslips durante 1 min en alta (potencia de radiofrecuencia de 30 W) y luego coloca cada coverslip en un pozo de una placa de 6 pocillos.
3. Cubra cada funda con una capa muy delgada de 5% de APTMS en etanol en una campana de humos.
   NOTA: Se formará un residuo de naranja en caso de recubrimiento excesivo en este proceso.
4. Cubra la placa de 6 pocillos y deje que las fundas reposen durante 5 minutos.
5. Enjuague bien las cubiertas (ambos lados) y el interior de cada pozo con agua DI y elimine el exceso de agua dentro de los pozos.
6. Coloque las cubiertas de nuevo en la placa de 6 pocillos y agregue aproximadamente 2 ml de glutaraldehído al 0.5% en agua DI.
7. Cubra la placa de 6 pocillos y deje que las hojas de recubrimiento se asienten en la solución de glutaraldehído durante 30 minutos; luego, enjuague bien tanto las cubiertas como los pocillos de cada placa con agua DI.
8. Guarde las cubiertas tratadas en agua DI dentro de las placas de 6 pocillos durante un máximo de dos semanas o úselas inmediatamente. Asegúrese de que las fundas estén completamente secas antes de su uso.

4. Fabricación de gel PAA y transferencia de patrones

NOTA: Una vez que se hacen los cubrehojas con patrones, deben usarse para transferir esos patrones de proteínas al hidrogel PAA poco después (<24 h)^1,29,30. La siguiente receta es para un gel PAA con un módulo de Young de 3,6 kPa. Las cantidades de bis-acrilamida, acrilamida y agua DI se pueden variar para ajustar la rigidez de los geles PAA¹².

1. Justo antes de comenzar a fabricar el precursor de hidrogel PAA, retire el éster de ácido acrílico N-hidroxisuccinimida (NHS) del refrigerador para que pueda alcanzar la temperatura ambiente antes de abrirse. Prepare un juego de placas intercambiables esterilizando con etanol al 70% y dejándolo reposar bajo luz UV en un gabinete de bioseguridad durante al menos 30 minutos antes de su uso.
   PRECAUCIÓN: NHS es un irritante tóxico para la piel y los ojos; use guantes protectores y gafas cuando lo manipule, y trabaje bajo una capucha de humos.
   1. Agregue 1.25 ml de acrilamida al 40% en agua DI a un tubo cónico de 15 ml.
      PRECAUCIÓN: La acrilamida es un irritante tóxico para la piel y los ojos; use guantes protectores y gafas cuando lo manipule, y trabaje bajo una capucha de humos.
   2. Añadir 175 μL de solución de bis-acrilamida en agua DI al mismo tubo (paso 4.1.1).
      PRECAUCIÓN: La bisacrilamida es un irritante tóxico para la piel y los ojos; use guantes protectores y gafas cuando lo manipule, y trabaje bajo una capucha de humos.
   3. Añadir 500 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10x.
      PRECAUCIÓN: PBS es un irritante ocular; use guantes protectores y gafas cuando manipule.
   4. Añadir 2.915 mL de agua DI.
2. Pipetear 969 μL de este precursor en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y almacenar el resto a 4 °C durante un máximo de dos semanas.
3. Mida ~ 50-100 mg de persulfato de amonio (APS) en otro tubo de microcentrífuga y diluya en agua DI hasta 100 mg / ml; déjelo a un lado para usarlo más tarde. Abra el éster NHS (ahora a temperatura ambiente) en la campana y mida cuidadosamente hasta 3 mg de NHS en un tubo de microcentrífuga. Diluya el éster NHS a 1 mg/ml en 1x PBS.
   PRECAUCIÓN: APS es un irritante de la piel y los ojos; use guantes protectores y gafas cuando lo manipule, y trabaje bajo una capucha de humos. Tanto APS como NHS-ester se hidrolizarán con el tiempo, haciendo que la actividad de los productos químicos en la solución madre varíe. Por lo tanto, ambas soluciones deben prepararse frescas cada vez (a diferencia del resto del precursor).
4. Realice los siguientes tres pasos en una campana extractora de humos:
   1. Añadir 2 μL de tetrametilendiamina (TEMED) al tubo de la microcentrífuga que contiene la alícuota de 969 μL del precursor de PAA.
      PRECAUCIÓN: TEMED es un irritante inflamable para la piel y los ojos; manténgalo alejado del calor / llama / chispas, use guantes protectores y gafas cuando lo manipule, y trabaje bajo una campana de humos. TEMED es uno de los dos agentes de reticulación críticos para la polimerización del hidrogel PAA, el otro es APS.
   2. Agregue 15 μL de ácido clorhídrico 1 M para disminuir el pH de la solución de hidrogel y evitar la hidrólisis del éster NHS.
      PRECAUCIÓN: El ácido clorhídrico es un irritante corrosivo para la piel y los ojos; use guantes protectores y gafas cuando lo manipule, y trabaje bajo una capucha de humos.
   3. Añadir 10 μL de la solución de éster NHS al tubo.
      NOTA: El NHS es fundamental para el proceso de modelado. Reaccionará con los grupos amina en las proteínas en el cobertor estampado para formar un enlace amida estable, lo que permitirá que el patrón se transfiera desde la cubierta de vidrio a la superficie del gel PAA a medida que polimeriza³¹.
5. Realice estos pasos finales en un gabinete de bioseguridad:
   1. Coloque cuidadosamente la cubierta de 30 mm dentro de la parte metálica del juego de platos de la cubierta (3-APTMS y glutaraldehído tratado con el lado hacia arriba) y atornille el anillo de plástico en la parte superior. Configure el estuche estampado para que se pueda alcanzar fácilmente en el siguiente paso, protegiéndolo de la luz tanto como sea posible.
   2. Pipetear 5 μL de solución de APS en el resto del precursor de PAA en el tubo de la microcentrífuga, invertirlo para mezclar y luego pipetear inmediatamente 35 μL de esa solución en el recubierto de 30 mm.
   3. Deje caer el lado de la proteína de la cubierta patrón hacia abajo sobre la solución, teniendo cuidado de no crear burbujas de aire en el hidrogel. Proteja el hidrogel de la luz y deje que polimerice durante 90 min.
   4. Una vez que el hidrogel se haya polimerizado, use una cuchilla de afeitar o un bisturí para eliminar el cobertor superior, asegurándose de que el coverlip no se deslice del gel ni vuelva a caer sobre el gel una vez que se haya eliminado, ya que esto arruinará el patrón en la superficie del gel.
      NOTA: No deje el gel descubierto en un área con flujo de aire significativo (como un gabinete de bioseguridad).
   5. Para pasivar cualquier éster NHS restante en el hidrogel, agregue 2 ml de PBS estéril al gel e incube a 37 ° C durante 45 min. Prepare inmediatamente los geles para experimentos o guárdelos durante la noche en PBS estéril a 4 °C hasta su uso.

5. Imágenes

1. Para prepararse para los experimentos con células, encienda el calor (37 ° C) y la humedad (70%) en el microscopio la tarde antes de un experimento planificado para permitir que el equipo dentro de la cámara del microscopio se equilibre a la temperatura más alta.
   NOTA: Este paso minimiza la deriva z causada por las fluctuaciones de temperatura.
2. Justo antes del inicio del experimento, encienda la fuente de CO₂ de la cámara.
3. Para evitar la deriva x-y causada por el movimiento repetido de la etapa del microscopio durante el experimento, fije el conjunto de placas de cubierta intercambiables que sostiene el hidrogel con semillas celulares en el escenario con cinta adhesiva de doble cara.
4. Revise el gel para encontrar marcos de interés para la imagen, guardando cada posición de etapa de las secciones a fotografiar.
5. Tanto en la vista de campo brillante como en la vista fluorescente correspondiente a la proteína marcada, configure el software del microscopio para obtener imágenes de cada fotograma una vez cada 5 minutos durante 2 h.

6. Análisis de imágenes

NOTA: Se ha desarrollado un sistema que puede medir la deformación de los geles PAA modelados determinando la ubicación de los puntos de tracción, interpolando las ubicaciones iniciales de los puntos deformados y luego calculando las fuerzas de tracción celular en cada ubicación. Se puede utilizar cualquier sistema de software capaz de realizar procesamiento de imágenes y cálculos numéricos. El programa tiene como objetivo determinar las fuerzas de tracción rápidamente, eliminando los procedimientos de entrada y preprocesamiento del usuario que contribuirían a los errores relacionados con el usuario. El código utilizado aquí está disponible aquí como Archivos suplementarios 2-10, y se puede acceder a estos archivos, junto con un par de imágenes de práctica, en www.bu.edu/mml/downloads.

1. En un software de procesamiento de imágenes, abra todas las imágenes individuales tomadas durante un experimento de lapso de tiempo desde cada vista de microscopio utilizada en orden, desde la primera hasta la última imagen capturada, y conviértalas en una sola pila de imágenes (haciendo clic en Imagen | Pilas | Imágenes para apilar). Asegúrese de que hay dos pilas de imágenes separadas: una de la vista de campo brillante de las celdas y otra de la vista fluorescente del patrón al que están unidas.
   1. Si hay deriva en las imágenes fluorescentes (es decir, la isla de interés se mueve en la dirección x y / o y entre cada fotograma en > 1-2 μm), primero procese la pila de imágenes con el complemento StackReg (P. Thévenaz, Instituto Federal Suizo de Tecnología de Lausana) para volver a centrar cada imagen en la pila en función de la posición de la primera (haciendo clic en Complementos | | StackReg Traducción | De acuerdo).
      NOTA: Esto es crítico porque incluso la deriva sub-μm puede afectar significativamente el cálculo final de las fuerzas de tracción, especialmente en geles más rígidos donde esta deriva x-y está fuera del rango de ruido esperado. Este código guardará las imágenes después de que se haya eliminado la deriva, que luego se puede convertir en una nueva pila de imágenes para analizar.
2. Introduzca las pilas de imágenes de campo brillante y fluorescentes en CTFTimelapse.m (Archivo suplementario 2).
   1. Especifique el directorio de archivos donde se encuentran las pilas de imágenes en la línea 7.
   2. En las líneas 8 y 9, especifique los nombres de la pila de imágenes fluorescentes y la pila fluorescente de campo brillante correspondiente, respectivamente.
   3. Especifique la rigidez del gel PAA (Pa):
      1. En las líneas 11-14, que incluyen algunos módulos elásticos diferentes de hidrogeles PAA utilizados con mayor frecuencia, comente (tipo % al comienzo de la línea) todos menos el módulo elástico del gel en las imágenes que se analizan. Alternativamente, agregue el módulo elástico si aún no está presente y comente el resto (3658.19 Pa para imágenes de prueba).
   4. Especifique el radio de punto (m) en la línea 15 (1 × ^10-6 m para las imágenes de prueba).
   5. Especifique el diámetro máximo de puntos posible (μm) en la línea 16 (2,5 μm para las imágenes de prueba).
   6. Especifique la relación de píxeles (μm/píxel):
      1. En las líneas 17-20, que incluyen algunas proporciones de píxeles de imagen diferentes basadas en las configuraciones de imagen utilizadas anteriormente, comente (escriba % al comienzo de la línea) todos menos la relación de píxeles de las imágenes que se están analizando. Alternativamente, agregue la relación de píxeles utilizada si aún no está presente y comente el resto (0.1613 μm / píxel para las imágenes de prueba).
   7. En las líneas 35 y 87, especifique el directorio de archivos donde se encuentran los archivos de procesamiento de imágenes necesarios.
      NOTA: A partir de la pila de imágenes fluorescentes, el código determina la ubicación de cada punto fluorescente y realiza un seguimiento del movimiento de cada punto entre cada imagen de la pila²⁰. La posición inicial de los puntos impresos de microcontacto es conocida porque no se deforman cuando se transfieren correctamente al hidrogel³².
3. Espere a que aparezcan dos figuras y un cuadro de diálogo una vez que el programa encuentre los puntos. Utilice la Figura 1 para asegurarse de que el programa ha encontrado los puntos correctos y no ha encontrado muchos puntos donde no los había. Utilice la Figura 2 para elegir la cuadrícula rectangular que ayuda al programa a localizar y calcular las fuerzas de tracción celular.
   NOTA: La Figura 1 es la imagen de campo brillante de la celda con los puntos encontrados por el programa (que serán rojos) superpuestos sobre ella (ver Figura 3A). La Figura 2 es una imagen que muestra los mismos puntos que se muestran en la Figura 1 pero sin la imagen de campo brillante en el fondo.
   1. Espere a que el cuadro de diálogo le pida que presione Entrar después de seleccionar punto, en el que cada punto es uno de los puntos rojos encontrados por el programa, y tiene un botón grande dentro de él etiquetado Entrar.
   2. Elija cuatro puntos diferentes en la Figura 2 para crear una cuadrícula rectangular alrededor e incluyendo la celda/clúster en ese patrón. Seleccione cada punto uno por uno con un clic izquierdo del mouse y confírmelo presionando Enter en el botón en el cuadro de diálogo antes mencionado. Mantenga la cuenta de cuántos puntos hay entre el primer y segundo punto, así como el primer y tercer punto, ya que el programa solicitará estos valores una vez que se hayan seleccionado los puntos de las cuatro esquinas. Introduzca estos valores en la ventana de comandos (escriba el número de puntos y haga clic en el botón Intro del teclado cuando se le solicite).
4. Una vez elegida la cuadrícula rectangular, espere a que el script calcule las fuerzas de tracción que encuentra dentro de la cuadrícula en función de las ubicaciones de los puntos fluorescentes. Tenga en cuenta que el script primero encuentra el vector de desplazamiento (u) del centro geométrico de cada punto y luego calcula el vector de fuerza de tracción (F) correspondiente usando Eq (1):
   (1)
   Donde E es el módulo de Young del sustrato PAA, a es el radio de los marcadores de puntos fluorescentes, y ν es la relación de Poisson del sustrato PAA³². Eq (1) asume que el sustrato es un semiespacio elástico infinito, que las fuerzas de tracción se aplican en el centro de cada marcador de puntos circulares y que el espaciado entre los marcadores de puntos es lo suficientemente grande como para que sus respectivos desplazamientos no interactúen entre sí²³.
   NOTA: En los experimentos descritos aquí, se utilizan marcadores de puntos de radio a = 1 μm y 6 μm de espaciado de centro a centro. Las flechas de fuerza de tracción dentro de la celda / grupo que apuntan hacia adentro hacia el centro de la celda deben estar presentes, mientras que el área fuera de la celda / grupo no debe tener flechas de tracción presentes (ver Figura 3C-E). Las flechas de tracción que apuntan hacia afuera desde el interior de la celda / grupo o muchas flechas de tracción grandes presentes fuera de la celda son indicativas de una cuadrícula rectangular mal elegida.
5. Una vez que se encuentre el campo de tracción correcto, seleccione una región de interés (ROI) apropiada que rodee la celda / clúster, que incluye todas las flechas de tracción dentro de la celda usando el cursor.
   1. Para dibujar el ROI, haga clic con el botón izquierdo tantas veces como sea necesario para dibujar una forma de polígono con tantos lados como desee, ajuste la forma o mueva el ROI después de dibujarlo haciendo clic con el botón izquierdo en las esquinas o bordes, respectivamente. Una vez que se dibuja el ROI, haga doble clic izquierdo para pasar a la siguiente imagen de la pila. Repita esto para todas las imágenes de la pila de campos brillantes.
      NOTA: El código guardará datos de fuerza de tracción y desplazamiento para cada punto de tiempo en la misma carpeta que las pilas de imágenes originales, que luego se pueden analizar más a fondo.

Los hidrogeles PAA con el módulo de Young de E = 3,6 kPa y la relación de Poisson de ν = 0,445 se hicieron para su uso mediante este método de micropatronaje sustractivo. Los hidrogeles se hicieron para tener ~ 100 μm de espesor, lo que les permite ser fotografiados con la configuración de imágenes utilizada aquí, al tiempo que evita que las células detecten el capa rígida debajo del gel, lo que causaría problemas en los estudios centrados en la detección de rigidez celular23,33. Los geles de muchos otros niveles de rigidez (hasta 30 kPa) se han fabricado con éxito y se han fotografiado utilizando el método de micropatronaje indirecto34, por lo que el método no se limita al uso de solo hidrogeles de 3,6 kPa. Las fundas se tratan con anticipación con glutaraldehído para permitir que el gel permanezca fijo a la funda inferior cuando se retira la funda con patrón superior (Figura 2C, D).

Para visualizar y medir las fuerzas de tracción celular dentro de los grupos, los hidrogeles de 3,6 kPa se modelaron indirectamente con fibronectina fluorescente (Figura 2A-D) para crear patrones de isla de tamaño y forma predeterminados (Figura 2E). Otros tipos de proteínas también se pueden modelar en estos hidrogeles blandos 21,35,36,37,38. La calidad del patrón transferido está directamente relacionada con la fidelidad del molde maestro a partir del cual se funde el sello PDMS. Los moldes que han tenido delaminación SU-8 verán un deterioro en la calidad de los patrones hechos de sellos fundidos a partir de estos moldes deslaminados. Por ejemplo, los moldes con SU-8 delaminado a menudo crearán micropatrones que contienen secciones de fibronectina sin patrón entre las islas predeterminadas. Si se funden en un gel, estos patrones permiten la unión celular al gel en áreas fuera del micromodelo de la isla. Debido a esto, la prioridad fue la prioridad de los grupos de células de imágenes unidos a patrones de islas totalmente o en su mayoría intactos.

Las células del músculo liso vascular bovino (BVSMC) se sembraron en estos hidrogeles a una densidad de aproximadamente 60-80 × 103 células / gel para promover la formación de grupos y se les permitió adherirse durante 18-24 h antes de la toma de imágenes. Justo antes de los experimentos, las células se tiñeron con una tinción de núcleo de células vivas para permitir que las células vivas se identificaran y determinaran el número de células en cada grupo. Se tomaron imágenes y analizaron islas de micropatrones con y sin células. Las imágenes de islas sin celdas permitieron calcular el ruido presente en los cálculos de la fuerza de tracción para geles de 3,6 kPa. Estas mediciones de desplazamiento de falsos positivos se pueden utilizar para determinar un valor umbral apropiado por debajo del cual se deben excluir los desplazamientos.

Se ha encontrado que 0,3 μm suele ser suficiente para eliminar la infidelidad del patrón que conduce a mediciones de desplazamiento falso positivo. Hacerlo puede causar la pérdida de tracciones de baja fuerza, pero es esencial para eliminar las tracciones falsas positivas. Al tomar imágenes, se priorizaron los grupos de células en patrones de islas en su mayoría intactos (es decir, aquellos a los que no les faltan muchos o ningún punto) y en su mayoría patrones intactos sin células. Cada ROI se tomó una imagen una vez cada 5 minutos durante 2 h. El microscopio utilizado para capturar imágenes de ambas células y los geles PAA modelados durante los experimentos de lapso de tiempo prolongado fue un microscopio de fluorescencia con una etapa automática, una fuente de luz de fluorescencia, una cámara y un software de microscopio estándar. Este microscopio tiene un conjunto personalizado de filtros para observar muchos colores diferentes de fluorescencia. El objetivo utilizado para ver las células y el hidrogel modelado es un objetivo de inmersión en agua de 40x, NA = 1.15. Este microscopio también está equipado con un sistema personalizado regulado por temperatura (37 °C), humedad (70%) y CO2 (5%) para mantener las células viables durante largos experimentos.

Para calcular las fuerzas de tracción de las imágenes de las islas de micropatrones, se utilizó un software de análisis de imágenes para rastrear los desplazamientos de los puntos fluorescentes de fibronectina a lo largo del tiempo. Conociendo los desplazamientos de los puntos fluorescentes y la rigidez del gel PAA en el que se modelan los puntos, el programa puede determinar los valores de las fuerzas de tracción impartidas tanto por células individuales como por grupos en el sustrato PAA. Sin embargo, hay dos formas en que el programa se vuelve incapaz de determinar los valores de tracción. Si se deforman demasiados puntos dentro de un marco de interés dado, el programa tiene dificultades para calcular las fuerzas, ya que el programa se basa en que la mayoría de los puntos de una imagen analizada no están deformados. Además, si dos puntos están demasiado cerca el uno del otro (distancia de centro a centro de ≤2 μm20), los desplazamientos de los puntos individuales podrían interferir entre sí, lo que impide la determinación precisa de sus valores de desplazamiento reales y, por lo tanto, sus valores de tracción. Mientras los micropatrones estén diseñados con puntos que estén bien separados, las células no deberían poder desplazar los puntos tanto que se vuelvan tan cercanos, incluso en sustratos más blandos.

La figura 3 muestra las capacidades del método de patrones de eliminación. Aquí, la capacidad de este método para fabricar patrones de isla aislados y bien definidos de forma predeterminada se muestra en la Figura 3B-E, donde los puntos de adhesión de fibronectina están presentes solo dentro del área deseada de la isla. Estas islas aisladas de puntos de adhesión permiten además un mejor control de la forma del cúmulo, como se muestra en la Figura 3A. Debido a que la forma y el tamaño de las islas son consistentes, los grupos celulares que se unen y crecen sobre ellas también tenderán a tener una forma consistente, ya que los patrones de las islas limitan el área de crecimiento del grupo. Finalmente, la Figura 3B-E también muestra la capacidad de estas islas para ser utilizadas para calcular las fuerzas de tracción celular y la tendencia de estas fuerzas de tracción a cambiar con el tiempo. Aquí, las fuerzas de tracción del grupo son las más grandes alrededor de los bordes de la isla. Esto se espera porque las células en los bordes de un clúster tienen menos interacciones con otras células del clúster que las del interior del clúster. Por lo tanto, estas células en los bordes ejercen mayores fuerzas sobre el sustrato en respuesta a la contracción citoesquelética que las células en el interior.

Figura 1: Diseño de la fotomáscara. (A) Una representación de la primera mitad del diseño de la fotomáscara utilizado aquí, una cuadrícula discreta de puntos de 2 μm de diámetro espaciados a 6 μm de centro a centro. Si bien la imagen que se muestra aquí es solo una pequeña parte del diseño, esta cuadrícula llena un espacio de 1.5 x 1.5 cm en total en la fotomáscara. (B) Una representación de la segunda mitad del diseño de la fotomáscara; aquí se muestran seis pequeñas islas de 6 x 6 puntos. En la fotomáscara, hay múltiples tamaños de isla diferentes: 6 x 6 (se muestra aquí), 12 x 12, 25 x 25 y 42 x 42 puntos. Una matriz igualmente espaciada (50 μm entre islas) de cada tamaño de isla ocupa un espacio de 1,5 x 0,375 cm, y las matrices de diferentes islas están separadas por 50 μm. Los puntos en cada isla son de 2 μm de diámetro y espaciados de 6 μm de centro a centro. Las dos secciones de la máscara descritas en A y B están separadas por 0,75 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Impresión sustractiva de microcontactos. (A) Un sello PDMS se trata con glutaraldehído y se pone en contacto con una funda de vidrio recubierta uniformemente con solución fluorescente de fibronectina. (B) Tras la eliminación del cubrehojas, el sello PDMS elimina la mayor parte de la fibronectina fluorescente en la superficie del coverslip, dejando puntos de proteína del tamaño de micras solo en lugares predeterminados por el diseño del sello PDMS. (C) El cubrehojas estampado se pone en contacto con un prepolímero PAA y una solución NHS. (D) Una vez que se ha permitido que el gel PAA se polimerice por completo, se retira la cubierta superior y se imprime un patrón de fibronectina en la superficie del gel PAA. (E) Un ejemplo de un patrón de isla discreto formado por puntos espaciados uniformemente en un hidrogel PAA con un módulo de Young de 3,6 kPa. Barra de escala = 20 μm. Abreviaturas: PDMS = polidimetilsiloxano; PAA = poliacrilamida; NHS = N-hidroxisuccinimida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Análisis de células en micropatrones de isla. (A) Se muestra una imagen de campo brillante de un grupo de 3 BVSMC superpuestos en un micropatrón fluorescente de isla de fibronectina en un hidrogel PAA con un módulo de Young de 3,6 kPa. Los puntos tienen 2 μm de diámetro y están separados por 6 μm de centro a centro. (B) El patrón fluorescente muestra que varios de los puntos de fibronectina en la isla han sido desplazados debido a la aplicación de fuerzas por parte de los BVSMC. (C) Las fuerzas de tracción aplicadas en los puntos de adhesión en el punto de tiempo 1 (inicio de un experimento de 2 h). La dirección de estos vectores de fuerza se indica por la dirección de las flechas de colores. Su magnitud se indica por el color de la flecha y su valor correspondiente en la barra de color (todos los valores de fuerza están en nN). La longitud del vector es relativa en función de las fuerzas mínimas y máximas calculadas por el programa para cada punto de tiempo. (D) Fuerzas de tracción del mismo cúmulo en el punto temporal 13 (a mitad de un experimento de 2 h) (E) Fuerzas de tracción del mismo cúmulo en el punto de tiempo 25 (final de un experimento de 2 h). Abreviaturas = BVSMCs = células del músculo liso vascular bovino; PAA = poliacrilamida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo suplementario 1: Calculadora para etiquetar fibronectina Esta es una herramienta para calcular la cantidad correcta de tinte fluorescente Alexa488 para usar al etiquetar la fibronectina. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: CTFTimelapse.m Este es el archivo de procesamiento de imágenes, que permite el cálculo de las fuerzas de tracción celular como se describe en la Sección 5 (Análisis de imágenes). Esto incluye seleccionar una cuadrícula de puntos deseada (Pasos 6.3-6.3.2) y elegir la región de interés para los cálculos de CTF (Pasos 6.5 y 6.5.1). Todos los siguientes archivos suplementarios son llamados directamente por este script o una de las otras funciones utilizadas en él. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 3: analyze_initial_image_4.m. Esta función es llamada por CTFTimelapse.m, y su propósito es localizar y alinear los puntos fluorescentes en una cuadrícula desde el primer fotograma de la pila de imágenes del patrón de cuadrícula deformada para que coincida con el patrón de cuadrícula no deformado original. Esto permite calcular la fuerza de tracción para el primer fotograma de la pila de imágenes. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente suplementario 4: analyze_subsequent_images.m. Esta función es llamada por CTFTimelapse.m, y su propósito es localizar y alinear los puntos fluorescentes en una cuadrícula de todos los fotogramas de la pila de imágenes del patrón de cuadrícula deformada después del primero. Esto permite cálculos de fuerza de tracción para todos los fotogramas de la pila de imágenes después del primero. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 5: bpass.m Esta función es llamada tanto por analyze_initial_image_4.m como por analizar subsequent_images.m., y su propósito es implementar un filtro de paso de banda de espacio real que procese la pila de imágenes del patrón de cuadrícula deformado. Este filtro suprime el ruido de píxeles y las variaciones de imagen de longitud de onda larga, al tiempo que retiene información de un tamaño característico. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 6: CellBoundary.m Esta función es llamada por CTFTimelapse.m, y su propósito es que permite al usuario del programa dibujar una región de interés alrededor de la celda / clúster para la cual se deben calcular las fuerzas de tracción. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 7: pkfnd.m Esta función es llamada tanto por analyze_initial_image_4.m como por analyze_subsequent_images.m., y su propósito es encontrar máximos locales en una imagen con precisión a nivel de píxel. Estos picos son utilizados por cntrd.m para localizar el patrón de cuadrícula fluorescente para CTFTimelapse.m. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 8: cntrd.m Esta función es llamada tanto por analyze_initial_image_4.m como por analyze_subsequent_images.m., y su propósito es localizar el centroide de los puntos brillantes en una imagen con una precisión de subpíxeles. Esto permite la ubicación del patrón de cuadrícula fluorescente por CTFTimelaspe.m, como se describe en el paso 6.3. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente suplementario 9: FourCorners.m Esta función es llamada tanto por analyze_initial_image_4.m como por analyze_subsequent_images.m. y su propósito es tomar la cuadrícula elegida por el usuario (Pasos 6.3-6.3.2) y calcular la distancia entre cada punto de esquina en dos ejes ortogonales. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 10: track.m Esta función es llamada tanto por analyze_initial_image_4.m como por analyze_subsequent_images.m. y su propósito es rastrear el movimiento de los puntos en el patrón de cuadrícula fluorescente entre cuadros, que es esencial para calcular las fuerzas de tracción correspondientes. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.