Aquí, presentamos un método detallado de remojo de interferencia de ARN en Bursaphelenchus xylophilus para facilitar el estudio de las funciones de los genes.
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Artículo de método
Aplicación de la interferencia de ARN en el nematodo de la madera de pino, Bursaphelenchus xylophilus
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Resumen
Resumen
El nematodo de la madera del pino, Bursaphelenchus xylophilus, es una de las especies invasoras más destructivas del mundo, causando el marchitamiento y eventual muerte de los pinos. A pesar del reconocimiento de su importancia económica y ambiental, hasta ahora ha sido imposible estudiar las funciones genéticas detalladas de los nematodos parásitos de plantas (PPN) utilizando la genética directa convencional y los métodos transgénicos. Sin embargo, como tecnología de genética inversa, la interferencia de ARN (ARNi) facilita el estudio de los genes funcionales de los nematodos, incluido B. xylophilus.
Este documento describe un nuevo protocolo para el ARNi del gen ppm-1 en B. xylophilus, que se ha informado que desempeña un papel crucial en el desarrollo y la reproducción de otros nematodos patógenos. Para el ARNi, el promotor T7 se unió al terminal 5' del fragmento objetivo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y el ARN bicatenario (dsRNA) se sintetizó mediante transcripción in vitro . Posteriormente, la administración de dsRNA se logró empapando los nematodos en una solución de dsRNA mezclada con neuroestimulantes sintéticos. Los juveniles sincronizados de B. xylophilus (aproximadamente 20.000 individuos) se lavaron y remojaron en dsRNA (0,8 μg/mL) en el tampón de remojo durante 24 h en la oscuridad a 25 °C.
La misma cantidad de nematodos se colocó en un tampón de remojo sin dsRNA como control. Mientras tanto, otra cantidad idéntica de nematodos se colocó en un tampón de remojo con el gen dsRNA de la proteína fluorescente verde (gfp) como control. Después del remojo, el nivel de expresión de las transcripciones objetivo se determinó mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los efectos del ARNi se confirmaron mediante la observación microscópica de los fenotipos y una comparación del tamaño corporal de los adultos entre los grupos. El protocolo actual puede ayudar a avanzar en la investigación para comprender mejor las funciones de los genes de B. xylophilus y otros nematodos parásitos hacia el desarrollo de estrategias de control a través de la ingeniería genética.
Introducción
Los nematodos parásitos de plantas (PPN) son una amenaza continua para la seguridad alimentaria y los ecosistemas forestales. Causan un estimado de 100 mil millones de dólares en pérdidas económicas cada año1, los más problemáticos de los cuales son principalmente nematodos del nudo de la raíz, nematodos del quiste y nematodos de la madera del pino. El nematodo de la madera del pino, Bursaphelenchus xylophilus, es un nematodo endoparásito migratorio, que es el patógeno causal de la enfermedad del marchitamiento del pino2. Ha causado un gran daño a los bosques de pinos en todo el mundo3. U....
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Protocolo
El estudio fue aprobado por el consejo de experimentación animal de la Universidad Agrícola y Forestal de Zhejiang. El aislado de B. xylophilus NXY61 fue extraído originalmente de un Pinus massoniana enfermo en el área de Ningbo de la provincia de Zhejiang, China11.
1. Clonación de genes
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los cebadores utilizados en este protocolo.
- Recolectar nematodos.
- Cultivar la cepa de B. xylophilus en el micelio de Botrytis cinerea en placas de agar de....
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Resultados
Análisis de la expresión de ppm-1 de B. xylophilus después de RNAi
El nivel de expresión relativo del gen ppm-1 de B. xylophilus empapado con GFP dsRNA y el empapado con el gen diana dsRNA fue de 0,92 y 0,52, respectivamente (el nivel de expresión génica ppm-1 del grupo control tratado conddH2O se estableció en 1) (Figura 1). Por lo tanto, el dsRN.......
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Discusión
Aunque la historia de vida y el entorno parasitario de B. xylophilus son diferentes de los de otros nematodos, ha habido investigaciones limitadas sobre la patogénesis molecular de este patógeno vegetal. A pesar de los grandes avances realizados en la aplicación de la tecnología de edición del genoma CRISPR/Cas9 en C. elegans y otros nematodos, hasta la fecha sólo se ha publicado la tecnología RNAi aplicada a B. xylophilus 17. El ARNi es una de las herramientas más poder.......
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Divulgaciones
No se declararon conflictos de intereses.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31870637, 31200487) y financiada conjuntamente por el Plan de Investigación Clave de Zhejiang (2019C02024, LGN22C160004).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Embuela Baermann | N/D | N/D | aislar nematodos |
| Beacon Designer 7.9 | Shanghai Kangyusheng Information Technology Co. | N/D | para diseñar cebadores qPCR |
| Botrytis cinerea | N/D | N/D | como alimento para nematodos |
| Bursaphelenchus xylophilus | N/D | N/D | su número era NXY61 y originalmente fue extraído de Pinus massoniana enfermo en Ningbo, provincia de Zhejiang, China. |
| Incubadora de temperatura constante | Compañía de Instrumentos del Laboratorio Jing Hong de Shanghái. | H1703544 | A Cultur Nematodos |
| Aparato de electroforesis | Laboratorios Bio-Rad | 1704466 | para lograr el análisis electroforético |
| Etanol, 75% | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 80176961 | extraer ARN |
| Premezcla de polimerasa ex Taq | Takara Bio Inc. | RR030A | para PCR |
| Premezcla de polimerasa ex Taq | Takara Bio Inc. | RR390A | para PCR |
| Sensor de gel | LongGene Scientific Instruments Co. | LG2020 | para hacer visibles las bandas de ácidos nucleicos |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Prism | N/D | analizar los datos y elaborar cifras |
| Centrífuga de alta velocidad | Hangzhou Allsheng Instruments Co. | AS0813000 | Centrifugadora |
| Trituradora de tejidos de alto flujo | Bertin | extraer ARN | |
| Software ImageJ | Institutos Nacionales de Salud | N/D | para medir las longitudes del cuerpo |
| Alcohol isopropílico | Compañía de Tecnología Bioquímica Shanghai Aladdin | L1909022 | extraer ARN |
| Microscopio Leica DM4B | Leica Microsystems Inc. | para observar nematodos | |
| Cuentas magnéticas | Aoran Science Technology Co. | 150010C | extraer ARN |
| Kit de transcripción de alto rendimiento MEGAscript T7 | Thermo Fisher Scientific Inc. | AM1333 | para sintetizar ARNds in vitro |
| Espectrofotómetro NanoDrop ND-2000 | Thermo Fisher Scientific Inc. | NanoDrop 2000/2000C | analizar la calidad del dsRNA |
| Amplificador de PCR | Bio-Rad Life Medical Products Co. | 1851148 | para amplificar la secuencia de ácidos nucleicos |
| Placas de Petri | N/D | N/D | A Cultur Nematodos |
| Vector fácil pGEM-T | Promega Corporation | A1360 | para clonación |
| Agar de patata con dextrosa (Medio) | N/D | N/D | to cultur Botrytis cinerea |
| Kit de reactivos Prime Script RT con borrador gDNA | Takara Bio Inc. | RR047B | a ADNc sintético |
| Primer Premier 5.0 | PREMIER Biosoft | N/D | para diseñar cebadores de PCR |
| Cebadores: PPM-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | N/D | F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3 |
| q-ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | N/D | F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTUACIÓNCCTCAGCGTTAGC-3' |
| Ciclador térmico en tiempo real qTOWER 2.2 | Analytique Jena Instruments (Beijing) Co. | para qPCR | |
| Mesa de agitación | Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co. | para empaparar nematodos | |
| Microscopio estereoscópico | Chongqing Optec Instrument Co. | 1814120 | para observar nematodos |
| T7-GFP-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | N/D | F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3' |
| Promotor T7 | Tsingke Biotechnology Co. | N/D | TAATACGACTCACTATAGGG |
| Kit de extracción de ADN en gel de agarosa Takara MiniBEST | Takara Bio Inc. | 9762 | para recuperar ADN |
| TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara Bio Inc. | RR820A | para qPCR |
| tricloroetano | Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co. | extraer ARN | |
| Reactivo de Trizol | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15596026 | reactivo de extracción total de ARN para extraer ARN |
Referencias
- Nicol, J. M., et al. Current nematode threats to world agriculture. Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions. Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C. , Springer. Dordrecht. 21-43 (2011).
- Jones, J. T., et al. Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology. <....
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus
Posted by JoVE Editors on 4/16/2024. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/63645-v
