Artículo de método
Este protocolo describe la metodología para extirpar genéticamente el epitelio pigmentario de la retina (EPR) utilizando un modelo de pez cebra transgénico. La adaptación del protocolo para incorporar la modulación de la vía de señalización utilizando compuestos farmacológicos es ampliamente detallada. Se desarrolló una plataforma de MATLAB para cuantificar la regeneración de RPE basada en la pigmentación, que se presenta y discute.
El epitelio pigmentario de la retina (EPR) reside en la parte posterior del ojo y realiza funciones esenciales para mantener la salud y la integridad de los tejidos retinianos y vasculares adyacentes. En la actualidad, la limitada capacidad reparadora de la EPR de mamíferos, que se limita a pequeñas lesiones, ha obstaculizado el progreso hacia la comprensión de los procesos regenerativos de EPR in vivo . Aquí, se proporciona una metodología detallada para facilitar el estudio de la reparación in vivo de RPE utilizando el pez cebra, un modelo de vertebrados capaz de regeneración de tejidos robustos. Este protocolo describe un paradigma de lesión mediada por nitrorreductasa/metronidazol transgénico (NTR/MTZ) (rpe65a:nfsB-eGFP), que da como resultado la ablación de los dos tercios centrales del EPR después de 24 h de tratamiento con MTZ, con posterior recuperación tisular. Se hace hincapié en las ablaciones de EPR en larvas de pez cebra y también se describen los métodos para probar los efectos de los compuestos farmacológicos en la regeneración de EPR. También se discute la generación y validación de RpEGEN, un script de MATLAB creado para automatizar la cuantificación de la regeneración de RPE basada en la pigmentación. Más allá de los mecanismos activos de reparación del EPR, este protocolo se puede ampliar a estudios de la degeneración del EPR y las respuestas a las lesiones, así como a los efectos del daño del EPR en los tejidos retinianos y vasculares adyacentes, entre otros procesos celulares y moleculares. Este sistema de pez cebra es muy prometedor en la identificación de genes, redes y procesos que impulsan la regeneración de RPE y los mecanismos relacionados con la enfermedad de RPE, con el objetivo a largo plazo de aplicar este conocimiento a los sistemas de mamíferos y, en última instancia, hacia el desarrollo terapéutico.
La metodología descrita aquí detalla un protocolo para extirpar genéticamente el epitelio pigmentario de la retina (EPR) utilizando larvas de pez cebra. El EPR se extiende sobre la parte posterior del ojo y reside entre las capas estratificadas de la retina neural y la capa de vasculatura que constituye la coroides. El soporte trófico, la absorción de luz fototóxica y el mantenimiento de las proteínas del ciclo visual son solo algunas de las funciones críticas que realiza el EPR que son esenciales para mantener la salud y la integridad de estos tejidos adyacentes1. El daño al EPR de mamíferos es reparable cuando las lesiones son pequeñas
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Todas las metodologías descritas en este documento cumplen con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Pittsburgh.
1. Preparación previa a la recogida de embriones de pez cebra
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Se sabe que la inhibición de la vía canónica de señalización Wnt perjudica significativamente la regeneración del RPE del pez cebra utilizando el paradigma de ablación genética (rpe65a: nfsB-eGFP) y la metodología de manipulación farmacológica (IWR-1) descrita en el protocolo3. Este experimento se repitió aquí para validar un método automatizado para cuantificar la regeneración de RPE del pez cebra basada en la pigmentación. Los resultados resumidos a continuación abarcaron todos los paso.......
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Este protocolo describe la metodología para extirpar genéticamente el EPR y estudiar los mecanismos de degeneración y regeneración en peces cebra de edad larvaria. Este protocolo también se ha realizado con éxito en peces cebraadultos 3 pero con una caracterización menos extensa, por lo que las larvas son el foco aquí. Los aspectos críticos de esta parte del protocolo (pasos 1-4) incluyen: 1) agregar 1.5x PTU a los embriones antes del inicio de la melanogénesis, 2) descoorizar embriones tratados c.......
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L.L.L. es el coinventor de la patente estadounidense # 9,458,428, que describe un método acelerado para derivar el epitelio pigmentario de la retina a partir de células madre pluripotentes humanas; esto no está relacionado con el contenido de este documento. J.M.G. y G.B.F. no tienen nada que revelar.
El trabajo descrito en este documento fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (RO1-EY29410 a J.M.G, y NIH CORE Grant P30-EY08098 al Departamento de Oftalmología); el UpMC Immune Transplant & Therapy Center (a L.L.L. y J.M.G.); y la Cátedra E. Ronald Salvitti en Investigación en Oftalmología (a J.M.G.). Se recibió apoyo adicional de la Beca Wiegand en Oftalmología (a L.L.L), la Fundación Eye & Ear de Pittsburgh, y una subvención sin restricciones de Research to Prevent Blindness, Nueva York, NY. Los autores también desean agradecer a Amanda Platt por la asistencia técnica y al Dr. Hugh Hammer y al personal acuático por su excelente apoyo para el cuidado de l....
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| laboratorio | |||
| 2-(4-amindiofenil)-6-indolcarbamidina diclorhidrato (DAPI) | Millipore Sigma | D9542 | |
| Placas de 6 pocillos | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Tubos cónicos de centrífuga de polipropileno | Fisher Scientific | 05-539-13 | El número de catálogo es para tubos de 50 ml |
| Bolígrafo de trazado con punta de diamante | Fisher Scientific | 50-254-51 | Fabricado por Electron Microscopy Sciences, los artículos similares a este número de pieza son adecuados |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) ≥ 99.7 % | Fisher Scientific | BP231 | Comprobar los requisitos institucionales de eliminación de residuos químicos |
| Incubadora de embriones (grande) | Fisher Scientific | 3720A | |
| Incubadora de embriones (mini/de sobremesa) | Labnet | I5110A | |
| Microscopio estereoscópico de fluorescencia | Zeiss | Axio Zoom.V16 | O similar, con láser/filtro de excitación de 488 nm |
| Pipeta Glass Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-4 | Fabricado por Corning, InSolution no estéril |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo | Millipore Sigma | 5.04462 | Fabricado por Calbiochem; 25 mM en DMSO; verifique los requisitos institucionales de eliminación de desechos químicos |
| Azul de metileno (polvo) | Fisher Scientific | BP117-100 | También disponible como solución |
| acuosa prefabricadaMetronidazol (MTZ) | Millipore Sigma | M3761 | Comprobar los requisitos de eliminación de residuos químicos institucionales |
| N-feniltiourea (PTU) | Millipore Sigma | P7629 | Comprobar los requisitos de eliminación de residuos químicos institucionales |
| Paraformaldehído (16 % p/v) sin metanol | Fisher Scientific | AA433689M Residuos químicos, se requiere una eliminación adecuada | |
| Placas de Petri | Fisher Scientific | FB0875712 | 10 cm de diámetro |
| Solución salina tamponada con fosfato (paquetes de polvo) | Millipore Sigma | P3813 | Se utiliza para fabricar 10 X PBS |
| Pronase | Millipore Sigma | PRON-RO | |
| Incubadora agitadora | Benchmark | H2010 | Se utiliza para incubar MTZ durante 1 hora a 37 grados centígrados |
| Microscopio estereoscópico | Leica | S9i | O similar, con luz transmitida iluminación |
| Pinza Student Dumont #5 | Fine Science Tools | 91150-20 | Pinzas de punta fina para la descorionación manual |
| Rotador/agitador de sobremesa | Scilogex | SK-D1807-E | |
| Pipeta de transferencia | Millipore Sigma | Z135003 | 3,2 mL de extracción de bulbo, no estéril |
| Metanosulfonato de tricaína (MS-222) | Pentair | TRS1, TRS2, TRS5 | También disponible en Fisher Scientific (NC0342409) |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Software Material | |||
| FIJI (Fiji is Just ImageJ | )FIJI (Fiji is Just ImageJ) | https://imagej.net/software/fiji/ | Versión: 2.0.0-rc-69/1.52p; Compilación: 269a0ad53f; Plugin necesario: Ejemplos de Bio-Formats |
| GRAMM y tutoriales de | MathWorks | https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like. | |
| MATLAB | MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Toolboxes necesarios para ejecutar RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox | |
| Compatibilidad con MATLAB | MathWorks https://www.mathworks.com/support.html |
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