Artículo de método

Un ensayo optimizado de extracción de una sola molécula para la cuantificación de la fosforilación de proteínas

DOI:

10.3791/63665

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6 de junio de 2022

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1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

En este artículo

Resumen

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El presente protocolo describe la preparación de muestras y el análisis de datos para cuantificar la fosforilación de proteínas utilizando un ensayo mejorado de extracción de una sola molécula (SiMPull).

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fosforilación es una modificación posttraduccional necesaria que regula la función de la proteína y dirige los resultados de la señalización celular. Los métodos actuales para medir la fosforilación de proteínas no pueden preservar la heterogeneidad en la fosforilación a través de proteínas individuales. El ensayo pull-down de una sola molécula (SiMPull) se desarrolló para investigar la composición de complejos macromoleculares a través de la inmunoprecipitación de proteínas en una cubierta de vidrio seguida de imágenes de una sola molécula. La técnica actual es una adaptación de SiMPull que proporciona una cuantificación robusta del estado de fosforilación de los receptores de membrana de longitud completa a nivel de molécula única. La obtención de imágenes de miles de receptores individuales de esta manera permite cuantificar los patrones de fosforilación de proteínas. El presente protocolo detalla el procedimiento Optimizado de SiMPull, desde la preparación de la muestra hasta la obtención de imágenes. La optimización de la preparación de vidrio y los protocolos de fijación de anticuerpos mejora aún más la calidad de los datos. El protocolo actual proporciona código para el análisis de datos de una sola molécula que calcula la fracción de receptores fosforilados dentro de una muestra. Si bien este trabajo se centra en la fosforilación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), el protocolo puede generalizarse a otros receptores de membrana y moléculas de señalización citosólica.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La señalización asociada a la membrana se sintoniza mediante una combinación de activación del receptor de membrana inducida por ligandos y reclutamiento de proteínas accesorias aguas abajo que propagan la señal. La fosforilación de tirosinas clave en las colas citoplasmáticas receptoras es fundamental para iniciar la formación de complejos de señalización, o tirosomas 1,2. Por lo tanto, una pregunta importante en biología es cómo se crean y mantienen los patrones de fosforilación para reclutar socios de señalización y dictar los resultados celulares. Esto incluye la comprensión de la heterogeneidad de la fosforilación del receptor, tanto en abundancia como en los patrones específicos de fosfotirosina que pueden proporcionar un medio para manipular las salidas de señalización al dictar la composición del signalosoma 3,4,5,6,7. Sin embargo, existen limitaciones en los métodos actuales para interrogar la fosforilación de proteínas. El análisis de Western blot es excelente para describir las tendencias de la fosforilación de proteínas, pero essemicuantitativo 8 y no proporciona información sobre la heterogeneidad del sistema porque se promedian entre miles y millones de receptores. Si bien los western blots permiten sondear una muestra utilizando anticuerpos fosfoespecíficos contra tirosinas específicas, no pueden proporcionar información sobre los patrones de fosforilación multisitio dentro de la misma proteína. La fosfoproteómica cuantitativa informa sobre la abundancia de fosfotirosina, pero existen limitaciones para detectar la fosforilación multisitio, ya que los residuos de interés deben ubicarse dentro del mismo péptido (típicamente 7-35 aminoácidos) que se genera por la digestión enzimática 9,10,11.

Para superar las limitaciones mencionadas anteriormente, el ensayo de extracción de una sola molécula (SiMPull) se ha adaptado para cuantificar los estados de fosforilación de los receptores intactos a nivel de molécula única. SiMPull fue demostrado por primera vez como una poderosa herramienta para interrogar complejos macromoleculares por Jain et al.12,13. En SiMPull, los complejos macromoleculares fueron inmunoprecipitados (IP) en cubiertas de vidrio funcionalizadas por anticuerpos y luego analizados a través de microscopía de molécula única para el número de subunidades de proteínas y co-IP con componentes complejos12. Una modificación de Kim et al.14, denominada SiMBlot, fue la primera en utilizar una variación de SiMPull para analizar la fosforilación de proteínas desnaturalizadas. El protocolo SiMBlot se basa en la captura de proteínas biotiniladas de la superficie celular utilizando cápsulas recubiertas de NeutrAvidin, que luego se sondean para la fosforilación con el etiquetado de anticuerpos fosfoespecíficos14. A pesar de estos avances, se necesitaron mejoras para hacer que la cuantificación de la modificación posttraduccional fuera más robusta y aplicable a una gama más amplia de proteínas.

El presente protocolo describe un enfoque optimizado de SiMPull que se utilizó para cuantificar los patrones de fosforilación del receptor intacto del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en respuesta a una variedad de condiciones de ligando y mutaciones oncogénicas15. Si bien este trabajo se centra en EGFR, este enfoque se puede aplicar a cualquier receptor de membrana y proteínas citosólicas de interés (POI), para las cuales se dispone de anticuerpos de calidad. El protocolo incluye pasos para reducir la autofluorescencia de la muestra, un diseño de matriz de muestras que requiere un volumen mínimo de muestras con la preparación simultánea de hasta 20 muestras, y la optimización del etiquetado de anticuerpos y las condiciones de fijación. Se han desarrollado algoritmos de análisis de datos para la detección de moléculas individuales y la cuantificación de proteínas fosforiladas.

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Protocolo

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1. Preparación de coverslip

NOTA: Para este paso, uno necesita usar equipo de protección personal (EPP), que incluye una doble capa de guantes de nitrilo, gafas de seguridad o protector facial, y una bata de laboratorio.

  1. Realice el grabado de pirañas para eliminar los desechos orgánicos del vidrio.
    PRECAUCIÓN: La solución de piraña es un agente oxidante fuerte que es corrosivo y altamente reactivo cuando está en contacto con materiales orgánicos. La reacción con los desechos orgánicos es exotérmica y potencialmente explosiva. Por lo tanto, el procedimiento debe realizarse en una campana de humos químicos con la hoja bajada. Se requiere cristalería Pyrex para manejar la solución de piraña.
    1. Prepare el espacio de trabajo dentro de una campana de humos químicos. Coloque los cubrebocas sin superposición en la parte inferior de un vaso de precipitados de vidrio de 4 L, el vaso de precipitados de "reacción", y coloque el vaso de precipitados de reacción en una placa caliente con calor suave. Deje que la cristalería se caliente durante 10 min. Coloque un vaso de precipitados de vidrio "residuo" de 1 L con 500 mL de ddH2O proximal al vaso de precipitados de reacción.
    2. Añadir 49 ml de ácido sulfúrico 12 N (H2SO4) lentamente al vaso de precipitados de reacción con una pipeta serológica de vidrio. Enjuague la pipeta en el vaso de precipitados de desecho antes de desecharla.
    3. Añadir 21 ml de peróxido de hidrógeno al 30% (H2O2) gota a gota con una pipeta serológica de vidrio al vaso de reacción. Distribuya lentamente las gotas de H2O2 uniformemente a través de la parte inferior del matraz de reacción para evitar el enfriamiento localizado de la reacción de grabado de pirañas. Enjuague la pipeta en el vaso de precipitados de desecho antes de desecharla.
      PRECAUCIÓN: Agregue siempre H2O2 en el H2SO4, y nunca al revés.
    4. Piranha graba las cubiertas durante 30 min. Agita suavemente el contenido del vaso de precipitados de reacción cada 5 min.
    5. Apague la solución de piraña vertiendo el contenido del vaso de precipitados de desecho en el vaso de precipitados de reacción. Transfiera el líquido lentamente por la pared del vaso de precipitados de reacción para minimizar las salpicaduras. Retire el vaso de precipitados de reacción de la placa caliente.
    6. Cuando la reacción se apague y se enfríe, vierta la solución de piraña de nuevo en el vaso de precipitados de desecho para su neutralización sin eliminar las cubiertas grabadas del vaso de precipitados de reacción.
    7. Neutralice la solución de piraña con la adición gradual de una base débil. Por ejemplo, use una masa excesiva de 20 g de bicarbonato de sodio (NaHCO3) / 100 ml de solución de piraña.
      PRECAUCIÓN: No almacene soluciones de piraña en contenedores de residuos sellados. La solución siempre debe neutralizarse antes de su eliminación. La reacción de neutralización produce burbujas vigorosas y puede ser explosiva si no se controla mediante la adición gradual de la base débil.
    8. Revuelva la solución neutralizada con una varilla de agitación de vidrio y deje que reaccione durante 2 h. Eleve el pH a >4 y deseche la solución.
    9. Entre las adiciones de base débil a la solución de piraña, transfiera las cubiertas grabadas del vaso de precipitados de reacción a un embudo Buchner con una varilla de agitación de vidrio y enjuague durante 5 minutos en funcionamiento ddH2O.
      NOTA: Continúe inmediatamente al siguiente paso o guarde los cubrehojas grabados con piraña durante un máximo de 2 semanas en ddH2O en un frasco de vidrio sellado o placa de Petri (envuelva con película de sellado, consulte la Tabla de materiales).
  2. Bastone los recubiertos en disolventes orgánicos siguiendo los pasos a continuación.
    1. Coloque las fundas en un frasco de vidrio Coplin (ver Tabla de Materiales) y cúbralas con metanol (CH3OH). Selle la tapa al frasco con película de sellado y sonicado de baño durante 10 minutos. Vierta cuidadosamente el metanol del frasco de Coplin en una botella de almacenamiento de vidrio.
    2. Llene el frasco de Coplin con acetona (C3H6O), selle la tapa y suene el baño durante 10 minutos. Vierta cuidadosamente la acetona del frasco de Coplin en una botella de almacenamiento de vidrio.
      PRECAUCIÓN: El metanol es inflamable y agudamente tóxico. Úselo en una campana de humos químicos. La acetona es inflamable e irritante. Por lo tanto, manipularlo y almacenarlo en vidrio, y usarlo en una campana de humos químicos. Deseche como residuo peligroso de acuerdo con las regulaciones y pautas locales.
      NOTA: El metanol y la acetona se pueden reutilizar hasta cinco veces cada uno.
  3. Active la superficie de la cubierta para la funcionalización del silano.
    1. Baño-sonicato con 1 M de hidróxido de potasio (KOH) durante 20 min. Vierta cuidadosamente el KOH fuera del frasco Coplin en un tubo cónico de 50 ml para su reutilización.
      PRECAUCIÓN: KOH es corrosivo e irritante. Úselo en una campana de humos químicos y no lo guarde en vidrio. Guárdelo en tubos de polipropileno. Deseche como residuo peligroso de acuerdo con las regulaciones y pautas locales.
      NOTA: KOH se puede reutilizar hasta cinco veces.
    2. Enjuague dos veces con ddH2O. Drene ddH2O de las fundas y luego caliente cada funda agitando la llama de un quemador Bunsen para eliminar toda la humedad de la superficie. Coloque las fundas en un frasco seco de Coplin.
  4. Realizar aminosilanización de coverslip.
    1. Preparar la solución de aminosilano mezclando 69,4 mL de metanol con 3,6 mL de ácido acético (CH3COOH) en un matraz cónico. Añadir 720 μL de N-(2-aminoetilo)-3-aminopropiltrimetoxisilano (aminosilano) y mezclar bien (ver Tabla de Materiales).
      PRECAUCIÓN: El ácido acético es inflamable y corrosivo. Manipular con pipetas de vidrio y almacenar en vidrio. Trabajar con ácido acético en una campana de humos químicos. El aminosilano es un peligro de inhalación agudamente tóxico, un sensibilizante y un irritante. Es perjudicial para la vida acuática. Úselo en una campana de humos químicos. Deseche los productos químicos como residuos peligrosos de acuerdo con las regulaciones y pautas locales.
      NOTA: El aminosilano es fotosensible e hidroliza rápidamente en el agua. Todos los pasos con este reactivo deben realizarse en condiciones de luz mínimas para retener la actividad. Purgue la botella con gas nitrógeno y aplique una película de sellado antes de almacenarla en un desecador oscuro. Reemplace cada 6-9 meses.
    2. Agregue inmediatamente la solución de aminosilano al frasco de Coplin. Cubra y aplique la película de sellado, continuando protegiendo de la luz.
    3. Incubar los recubiertos en la solución de aminosilano durante 10 min en la oscuridad a temperatura ambiente (RT). Baño-sonicado durante 1 min y luego incubar durante otros 10 min. Vierta cuidadosamente la solución de aminosilano en un contenedor de residuos designado para CH3OH con trazas de aminosilano y CH3COOH.
    4. Enjuague las cubiertas con metanol y vierta la solución en un contenedor de residuos designado para metanol.
    5. Enjuague los cubrehojas tres veces durante 2 minutos cada uno con ddH2O. Escurra las fundas, elimine el exceso de humedad y seque al aire por completo durante 10 minutos.
  5. Realizar la preparación de la matriz/funcionalización biotina-PEG de las cubiertas.
    1. Preparar 1 M de NaHCO3 (pH 8,5) de material de trabajo disolviendo 84,5 mg de NaHCO3 en 1 mL de ddH2O. Para la concentración final de 10 mM NaHCO3, diluya 1 M NaHCO3 en ddH2O (1:100).
    2. Dibuje una matriz de cuadrícula en los recubiertos aminosilanizados secos con una pluma de barrera hidrofóbica (consulte la Tabla de materiales) y espere a que la tinta se seque. Escriba un identificador en el cubrehojas para marcar la orientación adecuada. Coloque las fundas en una cámara humidificada.
      NOTA: La matriz debe consistir en 16-20 cuadrados, de aproximadamente 4 mm x 4 mm de tamaño.
    3. Para hacer la solución de valerato de biotina-PEG succinimidil (biotina-PEG)/mPEG succinimidilato (mPEG), primero, retire mPEG y biotina-PEG (ver Tabla de Materiales) del congelador y equilibre a RT. Agregue 153 mg de mPEG y 3.9 mg de biotina-PEG (~1:39 biotina-PEG:mPEG) a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL, y resuspenda en 609 μL de 10 mM NaHCO3 mediante pipeteo suave. Centrifugar a 10.000 x g durante 1 min a RT para eliminar burbujas.
      NOTA: La vida media de hidrólisis del valerato de succinimidil en el tampón de pH 8.5 es de ~ 30 min. Después de agregar el búfer a mPEG, continúe con los siguientes pasos lo más rápido posible. Este paso es crítico.
    4. Aplique la solución de biotina-PEG/mPEG para cubrir completamente cada cuadrado en las matrices de coverslip, típicamente 10-15 μL por cuadrado. No permita que el líquido desborde el espacio definido. Guarde los cubrehojas en una cámara de humedad en la oscuridad durante 3-4 h en RT.
    5. Lave los cubrehojas con grandes cantidades de agua sumergiéndolos secuencialmente en 3 vasos de precipitados de vidrio de 250 ml llenos de ddH2O durante 10 s cada uno.
    6. Expulse toda la humedad de las cubiertas con gas nitrógeno. Guarde las cubiertas consecutivas en un tubo cónico de 50 ml lleno de nitrógeno envuelto con película de sellado a -20 °C.
      NOTA: Proceda inmediatamente al paso 2 o guarde los cubrehojas a -20 °C durante un máximo de 1 semana antes de su uso.

2. Preparación de Lisado de SiMPull

PRECAUCIÓN: El EPP requerido para los pasos restantes del protocolo son guantes de nitrilo, gafas de seguridad y batas de laboratorio.

NOTA: Los lisados se prepararon a partir de las células CHO adherentes que expresan EGFR-GFP. Las células fueron chapadas en un plato de cultivo de tejidos de 60 mm (TC60) durante la noche12,13. Las células CHO se cultivaron en DMEM suplementadas con 10% de suero fetal bovino, 1% de L-glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina y 500 ng/ml de genética (ver Tabla de Materiales). También se pueden utilizar otras líneas celulares adherentes o células de suspensión.

  1. Coloque las celdas siguiendo los pasos a continuación.
    1. Lave la placa de cultivo (que contiene las células) con 1 ml de 1x PBS. Añadir 1 ml de 1x tripsina e incubar durante 5 min a 37 °C para separar las células. Usando una pipeta, transfiera las células separadas del plato a un tubo centrífugo de 1.5 ml.
    2. Tome 10 μL de azul de tripano y mezcle con 10 μL de suspensión celular en un tubo de centrífuga separado. Cuente las celdas utilizando 10 μL de la mezcla de células en un contador de celdas automático, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
    3. Placa 8 x 105 celdas durante la noche en una placa de Petri TC60. Plato de un plato por condición.
      NOTA: Para el presente estudio, las células no fueron tratadas o tratadas con pervanadato y EGF como se describe en el paso 2.4.1.
  2. Prepare las siguientes soluciones para la preparación del lisado celular.
    1. Preparar 1x PBS helado (pH 7.4).
    2. Preparar tampón de lisis, una solución de detergente no iónico no degenerante al 1% (ver Tabla de Materiales) en 50 mM Tris-HCl (pH 7.2) y 150 mM NaCl suplementado con Inhibidor de Proteasa/Fosfatasa (IBP) (1:100 de stock). Coloque el tubo en un nutator y deje que el tampón se mezcle durante 15 minutos. Mantenga la solución preparada sobre hielo.
    3. Prepare el tampón del Tyrode para una concentración final de 135 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7.2), 20 mM de glucosa y 0.1% de albúmina sérica bovina (BSA) (ver Tabla de Materiales). Calentar la solución a 37 °C.
  3. Prepare el control positivo para la fosforilación - 1 mM de tratamiento con pervanadato.
    NOTA: Este paso es opcional. El pervandato es la forma peroxidada de vanadato, un inhibidor de la proteína tirosina fosfatasas16. La prevención de la desfosforilación de proteínas mediante la inhibición de la actividad de la fosfatasa da como resultado una muestra altamente fosforilada.
    1. Preparar un stock de 200 mM de ortovanadato de sodio activado (Na3VO4).
      1. Para preparar una solución de 100 ml, agregue 3,89 g de Na3VO4 (consulte la Tabla de materiales) a 90 ml de ddH2O y disuelva mientras se agita. Ajuste el pH a 10 agregando HCl o NaOH gota a gota. Agregar HCl volverá la solución amarilla.
      2. Lleve el volumen a 100 ml con ddH2O. Hervir la solución calentándola en el microondas. Después de hervir, la solución será incolora.
      3. Enfríe la solución a RT y reajuste el pH a 10. Repita el ajuste de ebullición, enfriamiento y pH de dos a cuatro veces más, hasta que el pH se estabilice en 10. Alícuota y conservar a -20 °C.
    2. Preparar un stock de pervanadato (PV) de 30 mM mezclando 20,4 μL de H2O2 al 3 % con 100 μL de 200 mM Na3VO4 y 546,8 μL de ddH2O (concentraciones equimolares de H2O2 y Naactivado 3VO4). Incubar en la oscuridad en RT durante 15 min.
    3. Prepare 1 mM PV en el búfer de Tyrode. Para una solución de 10 ml, agregue 0,33 ml de material fotovoltaico de 30 ml a 9,67 ml del búfer de Tyrode de 37 °C. Trate las células inmediatamente.
    4. Lave las células una vez con 3 ml del tampón de Tyrode. Añadir 3 mL de 1 mM PV en el tampón de Tyrode a las células e incubar durante 15 min a 37 °C.
  4. Realizar la estimulación del ligando.
    1. Estimular las células con el ligando de interés utilizando la concentración, el tiempo y la temperatura adecuados. Para la estimulación máxima del EGFR, incubar con 1 ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF) de 50 nM, ver Tabla de materiales) + 1 mM de PV en el tampón de Tyrode durante 5 min a 37 °C.
  5. Realizar lisis celular.
    1. Después del tratamiento celular deseado, coloque el plato sobre hielo y lávelo con 1x PBS helado. Retire completamente el volumen completo de PBS usando una pipeta.
    2. Añadir 180 μL de tampón de lisis (paso 2.2.2) a la placa. Use un raspador de celdas para tirar del búfer alrededor de la placa para cubrir las celdas por completo. Aplique una presión firme y constante con el raspador celular a través de toda la superficie cultivada para lisar las células por completo.
      NOTA: El volumen del tampón de lisis debe mantenerse al mínimo para garantizar una alta concentración de proteínas.
    3. Pipetear las células lisadas y transferirlas a un tubo de 1,5 ml. Mantenga el tubo en hielo durante 30 min. Vórtice los lisados cada 5 min.
      NOTA: Si el POI consta de múltiples subunidades o es sensible a la disociación, no vórtice los lisados.
    4. Centrifugar las células lisadas a 16.000 x g durante 20 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml con una pipeta. Este contiene el lisado total de proteínas.
    5. Reservar 10 μL del lisado y diluirlo en 90 μL del tampón de lisis para el análisis colorimétrico bicinchonínico (BCA)17. Conservar el lisado total de proteínas restante a -80 °C.
    6. Determinar la concentración total de proteínas lisadas mediante análisis de BCA (ver Tabla de Materiales).
      NOTA: Los lisados de proteínas totales se pueden preparar el día del experimento y usarse frescos o almacenados como alícuotas de un solo uso a -80 ° C durante un máximo de 12 semanas. No congele/descongele.

3. Funcionalización de la matriz con el anticuerpo biotinilado

  1. Prepare las siguientes soluciones.
    1. T50 Buffer, una solución de 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) y 50 mM NaCl. La solución es estable durante 1 mes en RT.
    2. T50-BSA complementando el tampón T50 con 0,1 mg/ml de BSA. Mantenga la solución preparada sobre hielo.
    3. 10 mg/ml de borohidruro de sodio (NaBH4) en 1x PBS. Prepárelo inmediatamente antes de usarlo.
    4. 0,2 mg/ml de NeutrAvidin (ver Tabla de Materiales) en tampón T50.
      PRECAUCIÓN: NaBH4 es un agente reductor y es inflamable. Siempre purgue el recipiente con gas nitrógeno después de su uso y guárdelo en un desecador.
  2. Funcionalizar la matriz con el anticuerpo biotinilado.
    1. Retire las matrices funcionalizadas de PEG-biotina del congelador y equilibre el tubo cónico a RT antes de abrirlo. Coloque el cubrehojas con la matriz orientada hacia arriba en un plato de cultivo de tejidos de 100 mm (TC100) forrado con película de sellado.
      NOTA: Minimice la iluminación cenital. Todas las soluciones deben "amontonarse" en los cuadrados definidos por la matriz hidrofóbica. Agregue un volumen apropiado de solución para cubrir completamente cada cuadrado (típicamente 10-15 μL) y no permita que el líquido desborde el espacio definido. Para eliminar rápidamente los líquidos, utilice una línea de vacío interna conectada a un matraz de vacío para capturar los residuos. Deje que NaBH4 se desgasifique durante 1 h antes de desecharlo dejando el tubo abierto en la campana de humos químicos. El tratamiento con NaBH4 es necesario para reducir la autofluorescencia de fondo, reduciendo así las detecciones falsas positivas de una sola molécula.
    2. Trate cada cuadrado de la matriz con 10 mg/ml de NaBH4 en 1x PBS durante 4 min en RT. Lavar tres veces con PBS.
    3. Incubar cada cuadrado durante 5 min con 0,2 mg/ml de NeutrAvidin en T50. Lavar tres veces con T50-BSA.
      NOTA: NeutrAvidin se une a PEG-biotina y proporciona un sitio de unión para anticuerpos biotinilados 12,13,15.
    4. Incubar cada cuadrado durante 10 min con 2 μg/ml de anticuerpo biotinilado específico de POI en T50-BSA; lavar tres veces con T50-BSA.
      NOTA: El presente protocolo utiliza IgG anti-EGFR biotinilada (ver Tabla de Materiales) para capturar EGFR-GFP.

4. SiMPull de POI de lisados de células enteras

NOTA: Coloque el plato TC100 de matrices siMPull funcionalizadas sobre hielo durante el resto de la preparación de SiMPull. Este paso es la extracción de un POI a partir del lisado total de proteínas. El lisado no debe reutilizarse después de la descongelación.

  1. Prepare las siguientes soluciones.
    1. Prepare 4% de paraformaldehído (PFA)/0.1% de glutaraldehído (GA) en 1x PBS.
      PRECAUCIÓN: PFA y GA son fijadores químicos tóxicos y carcinógenos potenciales. Use EPP. Deseche los productos químicos como residuos peligrosos de acuerdo con las regulaciones y pautas locales.
    2. Preparar 10 mM Tris-HCl, pH 7.4.
  2. Descongele y mezcle el lisado canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Manténgase en hielo.
  3. Diluir 1 μL del lisado en 100 μL de T50-BSA/PPI helado.
    NOTA: Si es necesario, determine el factor de dilución apropiado del lisado total de proteínas aplicando un rango de diluciones a la matriz. La densidad óptima de los receptores SiMPull por área de matriz es de 0.04-0.08/μm2. Las diluciones de lisado se pueden evaluar en el paso 6 (Análisis de datos).
  4. Incubar el lisado en la matriz durante 10 minutos; luego lavar cuatro veces con T50-BSA/PPI helado.
  5. Diluir el anticuerpo antifosfototirosina conjugado con AF647 (ver Tabla de materiales) en T50-BSA/PPI helado e incubar en la matriz durante 1 h.
    NOTA: En el presente protocolo, se utiliza una igG pan anti-pTyr (PY99)-AF647 para identificar la población fosforilada de EGFR-GFP. El uso de anticuerpos marcados directamente elimina la necesidad de anticuerpos secundarios, aumentando las opciones de etiquetado y mejorando la consistencia de los resultados. Los anticuerpos marcados fluorescentemente se pueden obtener de fuentes comerciales. Si no están disponibles comercialmente, los anticuerpos se pueden etiquetar de forma personalizada utilizando técnicas de bioconjugación estándar, y los kits de bioconjugación comerciales están disponibles. Cada lote de anticuerpos marcados fluorescentemente debe probarse para determinar las condiciones óptimas de etiquetado mediante la realización de SiMPull para medir una curva de dosis y encontrar el punto de saturación.
  6. Lavar seis veces con T50-BSA helado durante un total de 6-8 min.
  7. Lavar dos veces con 1x PBS helado.
  8. Incubar la matriz con una solución de PFA al 4%/0,1% de GA durante 10 min para evitar la disociación de anticuerpos.
  9. Lavar dos veces durante 5 min cada una con 10 mM Tris-HCl, pH 7.4/PBS para inactivar los fijadores.
    NOTA: Para experimentos que utilicen más de un anticuerpo (por ejemplo, detectar múltiples sitios de fosfotirosina), repita los pasos 4.5-4.9. Consulte el paso 6.2.9 para obtener información sobre la determinación del obstáculo estérico entre dos anticuerpos.

5. Adquisición de imágenes

NOTA: La adquisición de imágenes de una sola molécula se realiza utilizando un objetivo TIRF de 150x y un divisor de imágenes que captura cada canal espectral en un cuadrante específico de la cámara emCCD (consulte la Tabla de materiales). Las imágenes de calibración se adquieren por primera vez para permitir el registro de canales y la calibración de ganancia de la cámara con una rejilla de alineación de canales con nanopatrón (nanorred) que contiene 20 x 20 matrices de agujeros de 200 ± 50 nm a una distancia intraacusia de 3 ± 1 μm (tamaño total ~ 60 μm × 60 μm).

  1. Realice el registro del canal siguiendo los pasos a continuación.
    NOTA: Se necesita un registro preciso del canal para calcular correctamente la colocalización de los emisores. Este paso es crítico.
    1. Limpie el objetivo de aceite y deposite una gota de aceite en el objetivo. Coloque la nanorred en el escenario para obtener imágenes. Usando la luz blanca transmitida, concéntrese en el patrón de cuadrícula.
      NOTA: Las imágenes con la nanorred se adquieren utilizando luz transmitida, que pasa a través de la nanorred y se detecta en todos los canales espectrales. Alternativamente, se pueden usar cuentas multifluorescentes que emiten fluorescencia detectada en cada canal. La adquisición de imágenes deberá optimizarse de acuerdo con la configuración de cada microscopio.
    2. Adquiere una serie de 20 imágenes de la cuadrícula. Asegúrese de que los píxeles no estén saturados. Guarde la serie de imágenes como "Fiducial".
    3. Desenfoque la nanorred para crear un patrón Airy18. Adquiera una serie de 20 imágenes para calibraciones de ganancia. Guarde la imagen como "Ganancia".
    4. Adquiera una serie de 20 imágenes para el desplazamiento de la cámara bloqueando toda la luz para que no vaya a la cámara. Guarde la imagen como "Fondo".
  2. Adquirir imágenes SiMPull.
    NOTA: Antes de crear imágenes de la matriz de coverslip, cambie la solución Tris por T50-BSA y equilibre la matriz a RT.
    1. Limpie el objetivo de aceite y deposite aceite adicional en el objetivo. Asegure la matriz de laca en el escenario del microscopio.
    2. Optimice la potencia de excitación de cada fluoróforo, el ángulo TIRF y el tiempo de integración de la cámara. El objetivo es lograr la mayor cantidad de señal a ruido al tiempo que se minimiza el fotoblanqueo de la muestra. Registre la potencia del láser para obtener consistencia en futuras mediciones.
      NOTA: El presente estudio utilizó un tiempo de exposición de 300 ms para el canal rojo lejano y 1 s para el canal verde. El láser de 642 nm se utilizó a una potencia láser de aproximadamente 500 μW, mientras que el láser de 488 nm se utilizó a 860 μW, medido antes de la lente del tubo.
    3. Adquirir imágenes para cada muestra. Imagine primero el canal rojo lejano, seguido de cada fluoróforo de longitud de onda inferior para reducir el fotoblanqueo. Debido al bajo volumen utilizado para cada muestra, verifique el nivel del búfer cada 30-45 minutos y reponga según sea necesario.

6. Análisis de datos

  1. Descargue los códigos de demostración.
    NOTA: El código de demostración proporcionado y los conjuntos de datos de ejemplo muestran el flujo de trabajo completo de análisis de datos (Archivos de codificación suplementarios 1-4). Los requisitos del sistema enumerados en SiMPullMain.m se encuentran en el archivo de codificación suplementaria 1.
    1. Descomprima y guarde en un directorio personal Documents/MATLAB (MacOS/Linux) o Documents\MATLAB (Windows).
      NOTA: Esto genera cuatro carpetas nuevas: SiMPull_class, smite, Sample Data, Sample Analysis Outputs.
    2. Abra el archivo "ReadMe_Setup.txt" que se encuentra en la carpeta SiMPull_class.
    3. Instale MATLAB y MATLAB Toolboxes: Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox y Statistics and Machine Learning toolbox.
    4. Instale DipImage19 de acuerdo con las instrucciones de descarga.
    5. Instale el paquete de análisis de molécula única "smite" como se describe en ReadMe_setup.txt.
      NOTA: "smite" está disponible en el repositorio de GitHub (consulte la Tabla de materiales).
    6. Abra SiMPullMain.m, que se encuentra en SiMPull_class carpeta, arrastrando el archivo a la ventana de MATLAB.
    7. Cambie el directorio a ...\MATLAB\Sample Data\ haciendo clic en el icono Buscar carpeta y seleccionando la carpeta.
  2. Descripción general de los pasos del procesamiento de datos
    1. Ejecute SiMPullMain.m - siguiendo las instrucciones para cada sección. Ejecute cada sección individualmente colocando el cursor en esa sección y haciendo clic en el icono Ejecutar sección.
      NOTA: Los pasos generales para el análisis de datos se describen en esta sección. Las instrucciones detalladas se encuentran en el código SiMPullMain.m que lo acompaña.
    2. Ejecute la sección "Inicialización" para establecer la ruta para definir los canales espectrales y el tamaño de la imagen.
    3. Ejecute la sección "Buscar ganancia y desplazamiento de cámara" para convertir la ganancia de la cámara en fotones utilizando los conjuntos de datos de ganancia y fondo.
    4. Ejecute la sección "Registro de canal" para calcular la transformación media ponderada local utilizada para el registro de imágenes.
    5. Formatee y cure los datos. Ejecute la sección "Unir canales secuenciales en una imagen cuádruple". Ejecute "Eliminar marcos defectuosos".
    6. Ejecute la sección "Ajustar moléculas individuales y encontrar moléculas superpuestas".
      NOTA: Esta sección ejecuta múltiples funciones para localizar moléculas individuales en cada canal y determinar eventos de colocalización entre canales espectrales.
    7. Para determinar el recuento mínimo de fotones por ajuste verdadero de GFP, ejecute el "Optimizar umbral mínimo de fotones". Este es un proceso iterativo.
      1. Primero, establezca smf. Thresholding_MinPhotons = [0, 0, 0] y ejecute la sección. Seleccione los archivos "Datos en blanco" cuando se le solicite. Repita con los archivos "CHO-EGFR-GFP".
      2. Seleccione un valor umbral mínimo apropiado comparando los dos histogramas. Establecer smf. Thresholding_MinPhotons = [475, 0, 0] y vuelva a ejecutar la sección.
    8. Ejecute la sección "Calcular porcentaje de GFP se ajusta a positivo para la señal FR" para corregir las localizaciones en segundo plano y calcular los valores finales.
    9. Realice la opción 1 (paso 6.2.10) o la opción 2 (paso 6.2.11) según la necesidad experimental.
    10. Opción 1: Corregir el número de receptores disponibles en la membrana plasmática para la unión al ligando, como se describe en la Referencia15.
      1. Primero, etiquete los receptores de superficie con niveles saturantes de colorante fluorescente NHS Ester (NHS-AF647, consulte la Tabla de materiales). A continuación, realice un experimento SiMPull para determinar el porcentaje de localización de GFP que se colocaliza con AF647.
        NOTA: Esto proporciona una estimación de la fracción de receptores disponibles para el etiquetado NHS y la proporción de receptores en la superficie (SR).
      2. Aplique la corrección SR en el cálculo final: NGFP = (NLOC - NBG)*SR, donde NGFP es el número corregido de localizaciones GFP, NBG es el número de localización de fondo y NLOC es localizaciones totales.
        NOTA: En el presente ejemplo, esta corrección no se aplica porque el pervanadato es permeable a la membrana16 y, por lo tanto, la acción de la inhibición de la fosfatasa no se limita a los receptores de superficie.
    11. Opción 2: Para mediciones de fosforilación multisitio, considere el potencial de obstáculo estérico cuando se usan dos anticuerpos.
      NOTA: El obstáculo estérico puede causar una reducción en el porcentaje observado de receptores fosforilados para el anticuerpo 1 cuando está en presencia del anticuerpo 2 (P12), en comparación con el anticuerpo 1 solo (P1).
      1. Utilice SiMPull para determinar P1 y P12 y calcular el factor de corrección para el obstáculo estérico, siguiendo la Referencia15 publicada anteriormente.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una caricatura que representa el proceso SiMPull se muestra en la Figura 1A. Los trips se funcionalizan utilizando NeutrAvidin como ancla para anticuerpos anti-EGFR biotinilados para capturar EGFR-GFP de lisados de proteínas totales. Después de lavar la proteína no unida, los receptores fosforilados se etiquetan con un anticuerpo antifosfototirosina (anti-PY)15. La Figura 1B muestra una imagen de la matriz hidrofóbica, donde se pueden pre...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo descrito aquí se optimizó para permitir mediciones cuantitativas de la fosforilación del receptor a nivel de proteína única. Se desarrollaron varias modificaciones sencillas pero importantes al protocolo SiMPull que mejoraron la confiabilidad de la medición para la detección de fosfo-tirosina, incluida la reducción de la autofluorescencia con el tratamiento con NaBH4 y la colocación posterior de la muestra para prevenir la disociación de anticuerpos. El uso de la máscara de canal verde para identi...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud R35GM126934, R01AI153617 y R01CA248166 a DSL. EMB fue apoyado a través del programa ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) y JAR por el programa UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Agradecemos el uso del recurso compartido de microscopía de fluorescencia del Centro Integral del Cáncer de la Universidad de Nuevo México, respaldado por NIH P30CA118100. Queremos reconocer a los Dres. Ankur Jain y Taekijip Ha, cuyo desarrollo original de SiMPull inspiró este trabajo.
ES-C presente dirección: Immunodynamics Group, Laboratory of Integrative Cancer Immunology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mLMTC BioC2000
10 mM Tris-HCl pH 7,4
10 mM Tris-HCl pH 8,0/ 50 mM NaClT50 Tampón
100 mm Placa de cultivo de tejidosCELLTREAT229620Almacenamiento de vidrio grabado con pirañas/matrices
Tubo
16% Paraformaldehído Acuoso SoluciónMicroscopía Electrónica Ciencias15710
Peligroso TuboFuncionalizado Almacenamiento de vidrio/ Reutilización de KOH
50 mM Tris-HCl pH 7,2/150 mM NaClComponente tampón de lisis
60 mm Placa de cultivo de tejidosCorning430166
% de glutaraldehído Solución acuosade la Microscopía Electrónica16020Acetona peligrosa
(C3H6O)Millipore Sigma270725Peligrosa
Alexa Fluor 647 NHS EsterThermo Fisher ScientificA-20006
EGF humano recombinante sin animalesPeprotechAF-100-15
EGFR antihumano (dominio externo) – BiotinaLeinco Technologies, IncE101
Anticuerpo Anti-p-Tyr (PY99) Alexa Fluor 647Santa Cruz Biotechnologysc-7020 AF647
Sonicator de bañoBranson1200
BCA Kit de ensayo de proteínasPierce23227
Biotina-PEGLaysan BioBiotina-PEG-SVA, MW 5.000
Albúminasérica bovinaGold BiotechnologyA-420-1Componente tampón de Tyrode
Embudo
Quemador Bunsen Cloruro
de calcio (CaCl2)Millipore SigmaC4901Tyrode's Buffer Component
Cell ScraperBioworld30900017-1
Matraz filtrante cónicoFisher ScientificS15464
Tarro CoplinWHEATON900470
Countess II Contador de células automatizadoThermo Fisher ScientificAMQAX1000
cubreobjetos 24 x 60 #1.5Ciencias de la Microscopía Electrónica63793
DipImagehttps://diplib.org/
DMEMCaisson LabsDML19-500
Cámara emCCDAndor iXon
Suero fetal bovino, OptimaBio-TechneS12450Hsoftware Fusion 360 inactivado por calor
Autodesk
Geneticin G418 DisulfatoCaisson LabsG030-5GM
Ácido acético glacial (CH3COOH)JT BakerJTB-9526-01Peligroso
Pipetas serológicas de
Varilla de agitación de vidrio
Glucosa (D-(+)-glucosa)Millipore SigmaD9434Tyrode's Buffer
Component Halt Phosphotasa and Proteasa Inhibitor Cocktail (100X)Thermo Fisher Scientific78446Lysis Buffer Component
HEPESMillipore SigmaH3375TyrodeComponente tampón Ácido
clorhídrico (HCl)VWRBDH7204-1Peróxido
de hidrógeno peligroso (H2O2) (3%)HX0645
Peróxido de hidrógeno (H2O2) (30%)EMD MilliporeHX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 ( NP-40)Sigma AldrichI8896Componente de tampón de lisis
ImmEdge Barrera hidrofóbicaPluma Vector LaboratoriesH-4000
Immersol 518F aceite de inmersiónZeiss444960-0000-000
línea
L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030-164
Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2-6H2O)MPBio2191421Tyrode's Buffer Component
MatlabMathworksCurve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox y Statistics and Machine Learning toolbox
Metanol (CH3OH)IBIS ScientificMX0486-1Agua
peligrosa Milli-Q
Kits de etiquetado de anticuerpos Mix-n-Stain CF DyeBiotium92245Kit de conjugación
sugerido mPEGLaysan BioValerato de mPEG-succinimidilo, MW 5,000
N-(2-aminoetil)-3-aminopropiltrimetoxisilanoUCT United ChemicalA0700Nanogrid
Miraloma Tech
NeutrAvidin Biotina Proteína de uniónThermo Fisher Scientific31000
Nitrógeno (gas comprimido)
GPU NVIDIA con CUDABusque la compatibilidad en https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Microscopio Olympus iX71Olympus
Parafilm MThe Lab DepotHS234526C
PBS pH 7.4Caisson LabsPBL06
PC-200 Placa calefactora analógicaCorning6795-200
Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-163
Receptor de fosfo-EGF (Tyr1068) (1H12)Tecnología de señalización de célulasde ratón 2236BF
Cloruro de potasio (KCl)Millipore Sigma529552Tyrode's Buffer Component
Hidróxido de potasio (KOH)Millipore Sigma1050330500
Filamento PLA premium peligroso, 1,75 mm de diámetroRaise 3DPMS:2035U/RAL:3028Rango de temperatura de impresión: 205-235 °
Impresora 3D C Pro2Raise 3D
Pyrex 1 L vaso de precipitados
PYREX 100 mLCorning1395-100CH3OH/C3H6O reutilización
Pyrex 250 mL
Vaso
Vista cuádruple Fotometría divisoramodelo QV2
Centrífuga refrigeradaEppendorfEP-5415R
RevCount Contadores de celdas, EVE Portaobjetos de recuento de celdasVWR10027-446
Filtros de emisión Semrock: azul (445/45 nm), verde (525/45 nm), rojo (600/37 nm), rojo lejano (685/40 nm)serológicas SemrockLF405/488/561/635-4X4M-B-000
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)Sigma AldrichS6014
Borohidruro de sodio peligroso (NaBH4)Millipore Sigma452874Tyrode' s Componente tampón
Cloruro de sodio (NaCl)Millipore SigmaS9625Activar por ciclos sucesivos de calor y pH
Hidróxido de sodioVWRBDH3247-1
Ortovanadato de sodio (Na3VO4)Millipore SigmaS6508
Ácido sulfúrico peligroso (H2SO4)Millipore Sigma258105Microesferas TetraSpeck peligrosas
Thermo Fisher ScientificT7279perlas multifluorescentes
Base Tris (Trizma)Millipore SigmaT1503
Tinte azul de tripano, 0,4 %Thermo Fisher Scientific15250061
tripsina-EDTA 0,05 %Thermo Fisher Scientific25300120
cónico de 15 mL cónico de 50 mL 8 Ciencias Buchnervidriode vacío interna peligroso Película de sellado mAb botellas de almacenamiento Pyrex 4 LControlador de pipetas Paquete de análisis de molécula única de pipetassmite smite https://github.com/LidkeLab/smite.git

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).
  3. Coba, M. P., et al. Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks. Science Signaling. 2 (68), (2009).
  4. Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin. Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).
  5. Stites, E. C., et al. Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets. Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).
  6. Hause, R. J., et al. Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors. PLOS ONE. 7 (9), 44471(2012).
  7. Lau, E. K., et al. Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection. Science Signaling. 4 (185), (2011).
  8. Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  9. Brunner, A. M., et al. Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization. Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).
  10. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
  11. Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications. Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).
  12. Jain, A., et al. Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).
  13. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  14. Kim, K. L., et al. Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
  15. Salazar-Cavazos, E., et al. Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes. Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695(2020).
  16. Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
  17. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  18. Keller, H. E. Objective lenses for confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).
  19. Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB. , (1999).
  20. fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc. , Available from: https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html (2013).
  21. Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride. Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).
  22. Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. Toward single-cell single-molecule pull-down. Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).
  23. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).

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