Method Article

Un ensayo optimizado de extracción de una sola molécula para la cuantificación de la fosforilación de proteínas

DOI:

10.3791/63665

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June 6th, 2022

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1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

In This Article

Summary

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El presente protocolo describe la preparación de muestras y el análisis de datos para cuantificar la fosforilación de proteínas utilizando un ensayo mejorado de extracción de una sola molécula (SiMPull).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fosforilación es una modificación posttraduccional necesaria que regula la función de la proteína y dirige los resultados de la señalización celular. Los métodos actuales para medir la fosforilación de proteínas no pueden preservar la heterogeneidad en la fosforilación a través de proteínas individuales. El ensayo pull-down de una sola molécula (SiMPull) se desarrolló para investigar la composición de complejos macromoleculares a través de la inmunoprecipitación de proteínas en una cubierta de vidrio seguida de imágenes de una sola molécula. La técnica actual es una adaptación de SiMPull que proporciona una cuantificación robusta del estado de fosforilación de los receptores de membrana de longitud completa a nivel de molécula única. La obtención de imágenes de miles de receptores individuales de esta manera permite cuantificar los patrones de fosforilación de proteínas. El presente protocolo detalla el procedimiento Optimizado de SiMPull, desde la preparación de la muestra hasta la obtención de imágenes. La optimización de la preparación de vidrio y los protocolos de fijación de anticuerpos mejora aún más la calidad de los datos. El protocolo actual proporciona código para el análisis de datos de una sola molécula que calcula la fracción de receptores fosforilados dentro de una muestra. Si bien este trabajo se centra en la fosforilación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), el protocolo puede generalizarse a otros receptores de membrana y moléculas de señalización citosólica.

Introduction

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La señalización asociada a la membrana se sintoniza mediante una combinación de activación del receptor de membrana inducida por ligandos y reclutamiento de proteínas accesorias aguas abajo que propagan la señal. La fosforilación de tirosinas clave en las colas citoplasmáticas receptoras es fundamental para iniciar la formación de complejos de señalización, o tirosomas 1,2. Por lo tanto, una pregunta importante en biología es cómo se crean y mantienen los patrones de fosforilación para reclutar socios de señalización y dictar los resultados celulares. Esto incluye la comprensión de la heterogeneidad de la fosf....

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Protocol

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1. Preparación de coverslip

NOTA: Para este paso, uno necesita usar equipo de protección personal (EPP), que incluye una doble capa de guantes de nitrilo, gafas de seguridad o protector facial, y una bata de laboratorio.

  1. Realice el grabado de pirañas para eliminar los desechos orgánicos del vidrio.
    PRECAUCIÓN: La solución de piraña es un agente oxidante fuerte que es corrosivo y altamente reactivo cuando está en contacto con materiales orgánicos. La reacción con los desechos orgánicos es exotérmica y potencialmente explosiva. Por lo tanto, el procedimiento debe realizarse en una campana de humos químicos con la....

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Results

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Una caricatura que representa el proceso SiMPull se muestra en la Figura 1A. Los trips se funcionalizan utilizando NeutrAvidin como ancla para anticuerpos anti-EGFR biotinilados para capturar EGFR-GFP de lisados de proteínas totales. Después de lavar la proteína no unida, los receptores fosforilados se etiquetan con un anticuerpo antifosfototirosina (anti-PY)15. La Figura 1B muestra una imagen de la matriz hidrofóbica, donde se pueden pre.......

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Discussion

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El protocolo descrito aquí se optimizó para permitir mediciones cuantitativas de la fosforilación del receptor a nivel de proteína única. Se desarrollaron varias modificaciones sencillas pero importantes al protocolo SiMPull que mejoraron la confiabilidad de la medición para la detección de fosfo-tirosina, incluida la reducción de la autofluorescencia con el tratamiento con NaBH4 y la colocación posterior de la muestra para prevenir la disociación de anticuerpos. El uso de la máscara de canal verde para identi.......

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud R35GM126934, R01AI153617 y R01CA248166 a DSL. EMB fue apoyado a través del programa ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) y JAR por el programa UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Agradecemos el uso del recurso compartido de microscopía de fluorescencia del Centro Integral del Cáncer de la Universidad de Nuevo México, respaldado por NIH P30CA118100. Queremos reconocer a los Dres. Ankur Jain y Taekijip Ha, cuyo desarrollo original de SiMPull inspiró este trabajo.
ES-C presente dirección: Immunodynamics Group, Laboratory of Integrative Cancer Immunology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethes....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mLMTC BioC2000
10 mM Tris-HCl pH 7,4
10 mM Tris-HCl pH 8,0/ 50 mM NaClT50 Tampón
100 mm Placa de cultivo de tejidosCELLTREAT229620Almacenamiento de vidrio grabado con pirañas/matrices
Tubo
16% Paraformaldehído Acuoso SoluciónMicroscopía Electrónica Ciencias15710
Peligroso TuboFuncionalizado Almacenamiento de vidrio/ Reutilización de KOH
50 mM Tris-HCl pH 7,2/150 mM NaClComponente tampón de lisis
60 mm Placa de cultivo de tejidosCorning430166
% de glutaraldehído Solución acuosade la Microscopía Electrónica16020Acetona peligrosa
(C3H6O)Millipore Sigma270725Peligrosa
Alexa Fluor 647 NHS EsterThermo Fisher ScientificA-20006
EGF humano recombinante sin animalesPeprotechAF-100-15
EGFR antihumano (dominio externo) – BiotinaLeinco Technologies, IncE101
Anticuerpo Anti-p-Tyr (PY99) Alexa Fluor 647Santa Cruz Biotechnologysc-7020 AF647
Sonicator de bañoBranson1200
BCA Kit de ensayo de proteínasPierce23227
Biotina-PEGLaysan BioBiotina-PEG-SVA, MW 5.000
Albúminasérica bovinaGold BiotechnologyA-420-1Componente tampón de Tyrode
Embudo
Quemador Bunsen Cloruro
de calcio (CaCl2)Millipore SigmaC4901Tyrode's Buffer Component
Cell ScraperBioworld30900017-1
Matraz filtrante cónicoFisher ScientificS15464
Tarro CoplinWHEATON900470
Countess II Contador de células automatizadoThermo Fisher ScientificAMQAX1000
cubreobjetos 24 x 60 #1.5Ciencias de la Microscopía Electrónica63793
DipImagehttps://diplib.org/
DMEMCaisson LabsDML19-500
Cámara emCCDAndor iXon
Suero fetal bovino, OptimaBio-TechneS12450Hsoftware Fusion 360 inactivado por calor
Autodesk
Geneticin G418 DisulfatoCaisson LabsG030-5GM
Ácido acético glacial (CH3COOH)JT BakerJTB-9526-01Peligroso
Pipetas serológicas de
Varilla de agitación de vidrio
Glucosa (D-(+)-glucosa)Millipore SigmaD9434Tyrode's Buffer
Component Halt Phosphotasa and Proteasa Inhibitor Cocktail (100X)Thermo Fisher Scientific78446Lysis Buffer Component
HEPESMillipore SigmaH3375TyrodeComponente tampón Ácido
clorhídrico (HCl)VWRBDH7204-1Peróxido
de hidrógeno peligroso (H2O2) (3%)HX0645
Peróxido de hidrógeno (H2O2) (30%)EMD MilliporeHX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 ( NP-40)Sigma AldrichI8896Componente de tampón de lisis
ImmEdge Barrera hidrofóbicaPluma Vector LaboratoriesH-4000
Immersol 518F aceite de inmersiónZeiss444960-0000-000
línea
L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030-164
Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2-6H2O)MPBio2191421Tyrode's Buffer Component
MatlabMathworksCurve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox y Statistics and Machine Learning toolbox
Metanol (CH3OH)IBIS ScientificMX0486-1Agua
peligrosa Milli-Q
Kits de etiquetado de anticuerpos Mix-n-Stain CF DyeBiotium92245Kit de conjugación
sugerido mPEGLaysan BioValerato de mPEG-succinimidilo, MW 5,000
N-(2-aminoetil)-3-aminopropiltrimetoxisilanoUCT United ChemicalA0700Nanogrid
Miraloma Tech
NeutrAvidin Biotina Proteína de uniónThermo Fisher Scientific31000
Nitrógeno (gas comprimido)
GPU NVIDIA con CUDABusque la compatibilidad en https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Microscopio Olympus iX71Olympus
Parafilm MThe Lab DepotHS234526C
PBS pH 7.4Caisson LabsPBL06
PC-200 Placa calefactora analógicaCorning6795-200
Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-163
Receptor de fosfo-EGF (Tyr1068) (1H12)Tecnología de señalización de célulasde ratón 2236BF
Cloruro de potasio (KCl)Millipore Sigma529552Tyrode's Buffer Component
Hidróxido de potasio (KOH)Millipore Sigma1050330500
Filamento PLA premium peligroso, 1,75 mm de diámetroRaise 3DPMS:2035U/RAL:3028Rango de temperatura de impresión: 205-235 °
Impresora 3D C Pro2Raise 3D
Pyrex 1 L vaso de precipitados
PYREX 100 mLCorning1395-100CH3OH/C3H6O reutilización
Pyrex 250 mL
Vaso
Vista cuádruple Fotometría divisoramodelo QV2
Centrífuga refrigeradaEppendorfEP-5415R
RevCount Contadores de celdas, EVE Portaobjetos de recuento de celdasVWR10027-446
Filtros de emisión Semrock: azul (445/45 nm), verde (525/45 nm), rojo (600/37 nm), rojo lejano (685/40 nm)serológicas SemrockLF405/488/561/635-4X4M-B-000
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)Sigma AldrichS6014
Borohidruro de sodio peligroso (NaBH4)Millipore Sigma452874Tyrode' s Componente tampón
Cloruro de sodio (NaCl)Millipore SigmaS9625Activar por ciclos sucesivos de calor y pH
Hidróxido de sodioVWRBDH3247-1
Ortovanadato de sodio (Na3VO4)Millipore SigmaS6508
Ácido sulfúrico peligroso (H2SO4)Millipore Sigma258105Microesferas TetraSpeck peligrosas
Thermo Fisher ScientificT7279perlas multifluorescentes
Base Tris (Trizma)Millipore SigmaT1503
Tinte azul de tripano, 0,4 %Thermo Fisher Scientific15250061
tripsina-EDTA 0,05 %Thermo Fisher Scientific25300120
cónico de 15 mL cónico de 50 mL 8 Ciencias Buchnervidriode vacío interna peligroso Película de sellado mAb botellas de almacenamiento Pyrex 4 LControlador de pipetas Paquete de análisis de molécula única de pipetassmite smite https://github.com/LidkeLab/smite.git

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006....

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Single Molecule Pull DownProtein PhosphorylationPhosphorylation QuantificationEGFR PhosphorylationImmunoprecipitation AssayAntibody LabelingGlass PreparationSingle Molecule ImagingColocalization AnalysisGaussian Localization

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