Microdisección láser para aplicaciones de un solo tejido independientes de la especie

Resumen

Se describe un protocolo que utiliza la microdisección láser para aislar tejidos de nematodos individuales para la secuenciación de ARN. El protocolo no requiere kits de herramientas genéticas específicas de la especie, lo que permite comparar los perfiles de expresión génica entre diferentes especies a nivel de muestras de un solo tejido.

Resumen

Las metodologías unicelulares han revolucionado el análisis de los transcriptomas de tipos celulares específicos. Sin embargo, a menudo requieren "kits de herramientas" genéticos específicos de la especie, como promotores que impulsan la expresión específica de proteínas fluorescentes en los tejidos. Además, los protocolos que interrumpen los tejidos para aislar células individuales eliminan las células de su entorno nativo (por ejemplo, la señalización de los vecinos) y pueden provocar respuestas al estrés u otras diferencias con los estados de expresión génica nativa. En el presente protocolo, la microdisección láser (LMD) está optimizada para aislar las puntas individuales de la cola de los nematodos para el estudio de la expresión génica durante la morfogénesis de la punta de la cola masculina.

LMD permite el aislamiento de una porción del animal sin la necesidad de interrupción celular o kits de herramientas específicos de la especie y, por lo tanto, es aplicable a cualquier especie. Posteriormente, los protocolos de preparación de la biblioteca de ARN-seq de una sola célula, como CEL-Seq2, se pueden aplicar a tejidos individuales aislados de LMD y analizarse utilizando tuberías estándar, dado que se dispone de un genoma o transcriptoma bien anotado para la especie. Dichos datos se pueden utilizar para establecer qué tan conservados o diferentes son los transcriptomas que subyacen al desarrollo de ese tejido en diferentes especies.

Las limitaciones incluyen la capacidad de cortar el tejido de interés y el tamaño de la muestra. Un análisis de potencia muestra que se requieren tan solo 70 puntas de cola por condición para obtener un 80% de potencia. Se necesita una estrecha sincronización del desarrollo para obtener este número de animales en la misma etapa de desarrollo. Por lo tanto, también se describe un método para sincronizar animales a intervalos de 1 h.

Introducción

Los nematodos, particularmente los nematodos rabdíidos relacionados con el sistema modelo Caenorhabditis elegans, son un maravilloso grupo de animales para la biología evolutiva del desarrollo (EDB) por muchas razones ^1,2. Las ventajas incluyen su pequeño número de células, linajes celulares definidos y consistentes, transparencia y facilidad de cultivo y cría. También hay muchos recursos disponibles, incluidos genomas de alta calidad para múltiples especies, y para C. elegans, amplias herramientas genéticas moleculares y conocimientos sobre desarrollo, genética, anatomía y fisiología

Protocolo

1. Sincronización de gusanos

NOTA: A continuación se describen dos métodos para sincronizar el desarrollo de C. elegans y otras especies rabdítidas.

1. Sincronizar por primera parada en estadio larvario (L1) después del tratamiento con hipoclorito alcalino (lejía).
   NOTA: Este método fue descrito anteriormente en detalle¹⁹. Este método se basa en dos características de C. elegans que también son ciertas para varias otras especies de rabditides: (1) La cáscara del huevo es resistente a la lejía, mientras que la cutícula que rodea a los gusanos adultos y larvales no lo es. (2....

Resultados

Después de la microdisección de captura láser, puntas de cola individuales de machos y hermafroditas en 4 puntos de tiempo (L3 22 h después de la eclosión; L4 24, 26 y 28 h después de la eclosión) se prepararon para la secuenciación de ARN utilizando el protocolo CEL-Seq2. Los cebadores CEL-Seq2 contienen códigos de barras únicos que permiten identificar bioinformáticamente las lecturas de secuenciación de una muestra en particular (en este caso, una punta de cola individual). Los datos de secuenciación se generaron con .......

Discusión

Pasos críticos del método
Si se realiza correctamente, el método descrito aquí obtendrá perfiles de ARN robustos con un número relativamente pequeño de muestras diseccionadas con láser (70 puntas de cola en este ejemplo). Sin embargo, para las muestras de animales en desarrollo, la sincronización estrecha es fundamental para reducir la variabilidad entre las muestras. Por esta razón, el protocolo recomienda el método de sombreado para la sincronización de gusanos. Aquí, el investigador puede determina.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,5 y micro; Correderas de vidrio de membrana M PEN sin 11600288	Leica		para LMD
500 y micro; L Tubos de PCR (sin nucleasas)	Axygen	732-0675	para cortar las puntas de la cola en
Microscopio compuesto con objetivo 40x y DIC	cualquiera		para comprobar la edad de los gusanos
Humidificador de sobremesa	cualquiera
Microscopio de disección con base de luz transmitida	cualquiera		para todo el trabajo con gusanos
pipetas de vidrio pasteur	cualquier		mango de pico de gusano
portaobjetos y cubreobjetos de vidrio	para		comprobar la edad de los gusanos
Sistema de microdisección LMD6	Leica	múltiple	para cortar las puntas de la cola
Tubos LoBind 0,5 mL	Eppendorf	22431005
M9 Receta de tampón			en WormBook
Metanol 99.8%	Sigma	322415	para arreglar gusanos
Medio de crecimiento NGM	US Biológico	N1000	Es necesario añadir tampones y sales: Receta en WormBook
P10 pipeta de volumen variable	, p. ej., pipeta Gilson
P1000 de volumen variable	, p. ej., pipeta Gilson
P2 de volumen variable	p. ej., puntas
1.000 y micro; L	cualquier
punta de pipeta 1-10 y micro; L filtró	cualquier
alambre de platino e iridio	Tritech	PT-9010	para hacer que la selección de gusanos
estéril y sin nucleasas 1 mL tubos de centrfuge	cualquiera
Tween 20	Sigma	P9416	Agregue una cantidad muy pequeña al tampón M9 para evitar que los gusanos se peguen a las puntas de pipeta
ventiladas Placas de Petri de plástico de 6 mm	cualquiera
Para CEL-Seq2
4200 Sistema TapeStation con reactivos para la detección de ARN y ADN de alta sensibilidad	Sistema de electroforesis automatizado	Aligent
Perlas AMPure XP Perlas	Beckman Coulter	A63880	de limpieza de ADN
Tampón de unión de perlas   20% PEG8000, 2,5 M de NaCl
CEL-Seq2 cebadores (ver Tabla S1)	Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf	6335000020	Termociclador con tapa y bloque programables para 200 µ Tubos de L.
ADN polimerasa I (E. coli)	Invitrogen	18052-025
dNTP mix 10 mM	any
E. coli ADN ligasa	Invitrogen	18052-019
etanol
ExoSAP-IT para PCR Limpieza de productos	Affymetrix	78200	solución de exonucleasa
MEGAscript T7 Kit de transcripción	Ambion	AM1334	Para el paso 4.6.1
Agua libre de nucleasas	cualquier
Phusion Mezcla maestra de PCR de alta fidelidad con tampón HF	NEB	M0531	Mezcla de PCR paso 4.9.7
hexámero aleatorio RT cebador GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN	IDT		un cebador con 6 nucleótidos que son
ARN aleatorio Tampón de fragmentación	NEB	E6150S
parada de fragmentación de ARN	NEB	E6150S
de PCR de ARN (RPI1 – RPI48)	Illumina, NEB o IDT		RPIX en el paso del protocolo 4.9.7, secuencias disponibles de Illumina
RNAClean XP beads	Beckman Coulter	A63987
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Scientific	7000TS1	o cualquier otro producto similar
RNaseH (E. coli)	Invitrogen	18021-071
RNaseOUT Recombinante Inhibidor de la ribonucleasa	Invitrogen	10777-019
Tampón de segunda cadena	Invitrogen	10812-014
Superscripit II	Invitrogen	18064-014	transcriptasa inversa

sin ARNasa , de pipeta Gilson sea , Tampón de Imprimadores de índice