Cuantificación completa versus subregional de la carga beta amiloide en secciones cerebrales de ratón

La enfermedad de Alzheimer (EA), la sexta causa principal de muerte en los Estados Unidos, sigue siendo una amenaza para la salud pública, con un estimado de 6.2 millones de estadounidenses que viven con EA. Se espera que esto alcance los 13,8 millones para 2060¹. Hasta la fecha, el manejo sintomático a través de medicamentos como los inhibidores de la colinesterasa y la memantina es el curso primario del tratamiento². La EA se caracteriza por manifestaciones neuropatológicas como la deposición extracelular de placas de beta-amiloide (Aβ) y la acumulación intracelular de tau hiperfosforilada en forma de ovillos neurofibrilares ^3,4. Formado por una escisión endoproteolítica de la proteína precursora de amiloide (APP) a través de beta- y gamma-secretasa, Aβ se agrega para formar oligómeros y fibrillas, lo que lleva a efectos neurotóxicos⁵. Se ha planteado la hipótesis de que Aβ cumple un papel patológico primario desde la década de 1980, y es el objetivo terapéutico de la única terapia modificadora de la enfermedad aprobada por la FDA para la EA⁶. Como resultado, los modelos de ratones transgénicos con EA que albergan mutaciones en genes que resultan en una acumulación cerebral robusta de Aβ se han utilizado ampliamente para la investigación preclínica de la EA desde principios de la década de 1990⁷.

La detección de especies de Aβ en estos cerebros de ratones transgénicos con EA generalmente se realiza mediante dos inmunoensayos: ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) e inmunotinción. El primer ensayo permite la determinación cuantitativa de diferentes especies de Aβ y consume menos tiempo en comparación con la inmunotinción, que requiere varios pasos secuenciales de procesamiento de tejidos e imágenes, que incluyen seccionamiento de tejidos, inmunotinción, imágenes y cuantificación⁸. Además, los resultados obtenidos tras la inmunotinción son^{semicuantitativos 8}. Sin embargo, la capacidad de localizar espacialmente Aβ hace que la inmunotinción sea un enfoque atractivo para la detección de Aβ en tejidos cerebrales⁸.

Durante el uso de la inmunotinción Aβ, diferentes grupos de investigación han empleado varios paradigmas de cuantificación diferentes. Por ejemplo, algunos grupos de investigación cuantifican la carga de Aβ en toda la región de interés (corteza o hipocampo), mientras que otros cuantifican la carga de Aβ en una subregión de interés específica (una parte de la corteza o el hipocampo)^9,10,11. Aunque los métodos para la detección y cuantificación de Aβ han sido bien establecidos y documentados, no se ha informado del impacto del tamaño de la región de interés en las mediciones de carga de Aβ después de la inmunotinción. Por lo tanto, el protocolo actual tenía como objetivo comparar las mediciones de carga de Aβ en todas las regiones y subregiones de interés utilizando un software de análisis de imágenes, ImageJ.

El estudio actual utilizó ratones machos transgénicos dobles APP / PS1 de 13 meses de edad, que expresan un APP quimérico de ratón / humano y una presenilina mutante 1, para modelar el inicio temprano de AD¹². Los depósitos de Aβ comienzan a desarrollarse a los 6-7 meses de edad, y se observa una abundante acumulación de Aβ tanto en la corteza como en el hipocampo de estos ratones a los 9-10 meses de edad¹². Los péptidos amiloides transgénicos y la holoproteína pueden ser detectados por 6E10-inmunotinción¹³, lo que lo convierte en un modelo animal deseable para el presente protocolo. El procedimiento cubierto en este documento incluye la preparación del tejido cerebral, la inmunotinción de secciones que flotan libremente, la obtención de imágenes y la cuantificación de la carga de Aβ en subregiones completas versus subregiones de interés. El análisis muestra una fuerte correlación entre la cuantificación completa y subregional, lo que indica un acuerdo sólido entre estos dos métodos en las secciones de tejido cerebral derivadas de ratones machos APP / PS1 de 13 meses de edad que muestran abundantes depósitos de Aβ.

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de conformidad con los Recursos Animales de Laboratorio de la Universidad bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Irvine. Los experimentos se realizaron con ratones machos B6C3-Tg(APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax (APP/PS1) (13 meses de edad, n = 35). Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales).

1. Preparación del tejido cerebral

1. Anestesiar a los ratones utilizando una dosis letal de un anestésico a base de fenitoína/pentobarbital (150 mg/kg) inyectado por vía intraperitoneal (ver Tabla de Materiales) siguiendo los protocolos animales aprobados. Realizar perfusión cardíaca con solución salina tamponada con fosfato helado (1x PBS) durante 5 min a una velocidad de 5 mL/min para limpiar la vasculatura cerebral¹⁴.
2. Recolecte tejido cerebral después del informe publicado previamente¹⁵, separe en el hemisferio cerebral izquierdo y derecho y coloque el hemiceebro derecho de cada ratón en un tubo cónico de 15 ml que contenga 5 ml de solución de paraformaldehído al 4% (PFA) recién preparada en 1x PBS durante 72 h a 4 ° C.
   NOTA: Los cerebros pueden ser fijados por inmersión de 24-72 h dependiendo del antígeno que se esté estudiando. El hemicelio izquierdo, sin el cerebelo, puede congelarse en nitrógeno líquido y luego almacenarse a -80 ° C, seguido del procesamiento para ensayos bioquímicos como ELISA y la detección bioquímica de Aβ¹⁶.
   PRECAUCIÓN: El PFA es un probable carcinógeno, y el contacto de la piel con el PFA puede provocar síntomas alérgicos en la piel. Use guantes de nitrilo o butilo, máscaras y protección ocular para manipularlo, y prepárese bajo una campana de humo químico.
3. Después de la incubación en PFA al 4%, incube los hemi-cerebros secuencialmente en 5 ml de soluciones de sacarosa al 10%, 20% y 30% preparadas en 1x PBS durante 24 h, cada una a 4 ° C hasta que el tejido cerebral se hunda en el fondo del tubo cónico.
4. Después de la incubación en la solución de sacarosa al 30%, retire el semicerebro, aplique suavemente el cerebro en un papel de filtro para eliminar el exceso de solución de sacarosa y congele el semiceférico fijo en hielo seco en polvo durante 30 minutos. Guarde el semicerebro congelado en láminas de aluminio bien etiquetadas a -80 °C hasta la crioseccionación.
   NOTA: En el protocolo actual, los hemi-cerebros se almacenaron a -80 ° C durante 6-8 meses.
5. Seccione el hemicebro congelado en secciones de 20 μm de espesor utilizando un criostato (ver Tabla de Materiales).
   NOTA: Para el protocolo actual, los hemi-cerebros se seccionaron en secciones sagitales, y si es necesario, también se pueden preparar secciones coronales¹⁷. El paso 2 es para la tinción inmunofluorescente de Aβ en muestras de tejido cerebral fijo y crioprotegido.

2. Inmunofluorescencia

1. Coloque las secciones de tejido cerebral sagital (paso 1.5) en una placa de 24 pocillos (hasta seis secciones cerebrales de ratón por 300 μL por pozo). Lavar durante 5 min con 1x PBS tres veces a temperatura ambiente (23 °C) colocando la placa en un agitador con suave remolino.
2. Incubar las secciones de tejido cerebral con 70% de ácido fórmico en dH₂0 a temperatura ambiente durante 10 min.
   PRECAUCIÓN: El ácido fórmico es corrosivo, así que evite el contacto con la piel y los ojos.
3. Lave las secciones de tejido cerebral durante 5 min con dH₂0 tres veces a temperatura ambiente.
4. Bloquear la unión inespecífica con albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5% y TritonX 100 al 0,3% (ver Tabla de Materiales) en 1x PBS a temperatura ambiente durante 1 h.
5. Incubar las secciones de tejido cerebral con un anticuerpo primario marcado con fluoróforo (6E10, ver Tabla de Materiales) diluido (1:1000) en 1x PBS que contenga 0.3% TritonX 100 a 4 °C durante 24 h.
   NOTA: Dado que el anticuerpo primario está conjugado con fluoróforo, la placa debe cubrirse a partir de este paso, o todo el trabajo debe realizarse en una habitación oscura para mantener la efectividad del fluoróforo.
6. Lave las secciones de tejido cerebral durante 10 minutos con 1x PBS tres veces a temperatura ambiente.
7. Monte las secciones de tejido cerebral en portaobjetos de vidrio cargados positivamente (consulte la Tabla de materiales) que estén bien etiquetados (la información de la etiqueta en el portaobjetos se basa en la preferencia), después de un breve lavado con dH₂0 para eliminar las sales restantes. Deje que las diapositivas se sequen al aire en la oscuridad.
   NOTA: Las secciones del cerebro deben montarse con cuidado para evitar pliegues y rasgaduras, lo que afecta la cuantificación de los datos. En caso de rasgaduras y/o pliegues que se encuentren en la región de interés y puedan interferir con la cuantificación de los datos, se recomienda volver a teñir y volver a montar.
8. Monte las secciones de tejido cerebral con un medio de montaje acuoso (consulte la Tabla de materiales) y coloque la cubierta de vidrio sobre el tejido. Selle los extremos de la funda con esmalte de uñas transparente y guarde las diapositivas en una caja de diapositivas a 4 °C hasta la obtención de imágenes.
   NOTA: En el protocolo actual, las diapositivas se tomaron imágenes dentro de 1 mes después de la tinción.

3. Imágenes

1. Imagine las secciones cerebrales teñidas con 6E10 utilizando un microscopio de fluorescencia (epifluorescencia o confocal) (consulte la Tabla de materiales), que tiene un objetivo 2x para capturar toda la sección de tejido cerebral en una imagen y está equipado con el filtro apropiado (GFP en este trabajo).
   NOTA: La configuración de imágenes debe ser coherente en las diferentes diapositivas.
2. Guarde las imágenes capturadas como un archivo TIFF o según sea necesario y ábralas en el software de análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales) como se describe en el paso 4.2 a continuación para la cuantificación 6E10.
   NOTA: Incluya una barra de escala antes de capturar la imagen para cuantificar en el software de análisis de imágenes, ImageJ.

4. Análisis de la región completa de interés

NOTA: Las dos regiones de interés del presente trabajo son el hipocampo y la isocorteza. El análisis de la región completa de interés representa el análisis de toda la isocorteza (conocida como la corteza en el futuro) o el hipocampo en la sección de tejido cerebral fotografiada.

1. Descargue el software de análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales) e inicie el software una vez instalado.
2. Una vez que se ejecute el software, haga clic en archivo | Abrir | Elija la imagen que desea analizar.
3. Haga clic en Analizar | Establecer escala| Haga clic para quitar la escala. Seleccione la herramienta Recta de la barra de herramientas del software y dibuje una línea recta a lo largo de la longitud de la barra de escala. Haga clic en Analizar | Medida. Anote la longitud o distancia de la barra de escala en píxeles. Haga clic en Analizar | Establecer escala.
   1. En la ventana emergente, introduzca la distancia en píxeles, la distancia conocida de la barra de escala (en μm en este caso) y la unidad de longitud como μm. Marque Global para aplicar la nueva configuración de escala a todas las imágenes siguientes si se procesan varias imágenes. Haga clic en Aceptar para aplicar la configuración.
      NOTA: Siempre se recomienda verificar si se aplica la escala precisa a la imagen antes de un análisis posterior.
4. Para establecer la medición deseada en el área de la sección, vaya a Analizar | Establecer medidas | Seleccione los cuadros Área y Mostrar etiqueta. Compruebe que la imagen que se está analizando está seleccionada en Redirigir a.
5. Para facilitar la visualización del hipocampo o la corteza, vaya a imagen | Ajustar | Brillo/Contraste. Arrastre la barra deslizante Máximo gradualmente hacia la izquierda para aumentar la claridad del tejido hasta que las regiones cerebrales de interés sean identificables.
   NOTA: No aplique esta configuración para evitar mediciones falsas durante el análisis, en su lugar continúe con el siguiente paso.
6. Utilice la herramienta selección de polígono o la herramienta de selección a mano alzada para delinear la región del hipocampo. Haga clic en la opción Restablecer de la configuración de brillo / contraste una vez que se delinea el hipocampo para volver al brillo original.
   NOTA: Los pasos deben repetirse por separado para la región cortical.
7. Para medir el área total de tejido de la región seleccionada, haga clic en Editar | Despejar por fuera. Una vez que la región seleccionada sea la única imagen en pantalla, haga clic en Analizar | Medida para obtener el área total de tejido analizada en una ventana emergente. Guarde los datos en un archivo de Excel para su uso posterior.
8. Para medir el área 6E10 positiva, vaya a imagen | Ajustar | Umbral de color. Un filtro prefabricado bajo el método Thresholding generalmente proporciona los resultados deseados destacando las señales más fuertes en rojo.
   NOTA: La selección óptima del umbral dependerá del fondo de la imagen y de la intensidad de la tinción. Seleccione una configuración de umbral que recoja la mancha y no el fondo.
9. Después de seleccionar el umbral apropiado, marque Fondo oscuro. Esto resaltará las manchas Aβ (la mancha de interés) sobre un fondo negro. Haga clic en Seleccionar | | original Seleccionar, dando las señales oscuras (los depósitos Aβ) sobre un fondo blanco. Haga clic en Analizar | Analice las partículas y haga clic en Aceptar cuando se genere la ventana emergente.
10. Copie el resultado del resumen generado por el software haciendo clic en Editar | Copia. Pegue en el archivo de Excel iniciado anteriormente con las etiquetas respectivas. Esta es el área 6E10 positiva en las regiones seleccionadas de interés (ya sea hipocampo o corteza).
    NOTA: En Excel, habrá una columna para el área total de 6E10 positivos (paso 4.10) y el área total de tejido (paso 4.7).
11. Calcule el área 6E10 positiva (%) de la siguiente manera¹⁶: (Área total 6E10 positiva / Área total de tejido analizada) x 100.

5. Análisis de la subregión de interés

NOTA: El análisis de subregión de interés representa el análisis de una parte de la corteza o el hipocampo en la sección de tejido cerebral fotografiada.

1. Descargue el software de análisis de imágenes e inicie el software una vez instalado.
2. Una vez que se ejecute el software, haga clic en archivo | Abrir | Elija la imagen que desea analizar.
3. Haga clic en Analizar | Establecer escala| Haga clic para quitar la escala. Seleccione la herramienta Recto en la barra de herramientas del software y dibuje una línea recta a lo largo de la longitud de la barra de escala. Haga clic en Analizar | Medida. Anote la longitud o distancia de la barra de escala en píxeles. Haga clic en Analizar | Establecer escala.
   1. En la ventana emergente, ingrese la distancia en píxeles, la distancia conocida de la barra de escala (en μm en este caso) e ingrese la unidad de longitud como μm. Marque Global para aplicar la nueva configuración de escala a todas las imágenes siguientes si se procesan varias imágenes. Haga clic en Aceptar para aplicar la configuración.
      NOTA: Siempre se recomienda verificar si se aplica la escala precisa a la imagen antes de un análisis posterior.
4. Para establecer la medición deseada en el área de la sección, vaya a Analizar | Establecer medidas | seleccione los cuadros Área y Mostrar etiqueta. Compruebe que la imagen que se está analizando está seleccionada en Redirigir a.
5. Ajuste el brillo y el contraste si la imagen es demasiado tenue y las regiones del cerebro (por ejemplo, el hipocampo o la corteza en este caso) no se pueden identificar fácilmente. Utilice la barra de herramientas del software y haga clic en imagen | Ajustar | Brillo/Contraste y arrastre los controles deslizantes Máximo hacia la izquierda según sea necesario para aumentar la visibilidad del tejido.
   NOTA: No aplique esta configuración para evitar mediciones falsas durante el análisis, en su lugar continúe con el siguiente paso.
6. Con la herramienta Rectángulo, seleccione la región de interés en la corteza o el hipocampo. Utilice la barra de herramientas y haga clic en Editar | Selección | Especifique, cambiando la altura y el ancho a un valor predefinido. Ajuste la caja, para que esté completamente cubierta por tejido. Restablezca el brillo/contraste para volver al brillo original.
   NOTA: El tamaño del cuadro utilizado para seleccionar las regiones de interés debe ser coherente para todas las imágenes. Para el presente análisis, el tamaño de la caja fue de 300 píxeles x 300 píxeles (equivalente a 1177 μm x 1177 μm) o 400 píxeles x 200 píxeles (equivalente a 1569 μm x 784 μm).
7. Duplique la región de interés seleccionada haciendo clic con el botón derecho en el cuadro y haciendo clic en Duplicar. Se abrirá una nueva ventana con la región seleccionada. Cambie el nombre de la imagen duplicada para mostrar la región en la que se encuentra (por ejemplo, corteza o hipocampo).
8. Ajuste el tipo de imagen duplicada utilizando la barra de herramientas y haciendo clic en Imagen | Tipo | 8 bits para convertir la imagen RGB duplicada a 8 bits para analizar mejor las placas. Invierta la imagen haciendo clic en Editar | Invertir.
9. Para medir el área 6E10 positiva, vaya a imagen | Ajustar | Umbral. Un filtro predefinido bajo el método Thresholding generalmente proporciona los resultados deseados al resaltar las señales más fuertes en rojo.
   NOTA: La selección óptima del umbral dependerá del fondo de la imagen y de la intensidad de la tinción. Seleccione una configuración de umbral que recoja la mancha y no el fondo.
10. Después de seleccionar el umbral apropiado, seleccione Aplicar.
11. Para analizar el área 6E10 positiva, use la barra de herramientas y haga clic en Analizar | Analice las partículas, asegurándose de que se verifique el "Resumen de resultados".
12. Copie el resultado del resumen con el %Área generada por el software haciendo clic en Editar | Copia. Pegue en el archivo de Excel iniciado anteriormente con las etiquetas respectivas.
13. Repita los pasos 5.3-5.12 para las diferentes regiones del tejido. Asegúrese de que la ubicación de cada cuadro para delinear la región de interés sea consistente entre cada imagen.
    NOTA: La herramienta de rotación se puede utilizar si las dimensiones de la caja de herramientas del rectángulo no pueden encajar en la región especificada debido a la curvatura del tejido.
14. Para girar el rectángulo, utilice la barra de herramientas y haga clic en Editar | Selección | Gire y ajuste el grado de rotación según sea necesario. Duplique la imagen como se mencionó en el paso 5.7 y borre el exterior utilizando la barra de herramientas y haciendo clic en Editar | Borrar por fuera, lo que borra las manchas 6E10 fuera del rectángulo especificado. Continúe con el paso 5.8 descrito anteriormente.

Aquí, se comparan dos métodos diferentes para cuantificar el área 6E10 positiva en el hipocampo y la corteza de los tejidos cerebrales del ratón. Los dos métodos son los análisis de región completa y subregión de interés (Figura 1). El análisis de la región completa de interés, como su nombre indica, implica delinear toda la región de interés (en este caso, ya sea la isocorteza o el hipocampo) para determinar el área 6E10 positiva (Figura 1A, B). El análisis de la subregión de interés implica seleccionar una región predefinida dentro de la región de interés para determinar el área 6E10 positiva (Figura 1C, D). El protocolo StepWise ImageJ para los dos métodos se muestra en la Figura 2, figura 3 y Figura 4.

Este estudio utilizó tres lectores; dos lectores independientes realizaron el análisis de la subregión de interés, y el tercer lector realizó el análisis de la región completa de interés. Como se ve en la Figura 5A,B, hubo una fuerte correlación positiva significativa (p < 0,0001) entre el área 6E10 positiva reportada por los dos lectores que realizaron el análisis de la subregión de interés (coeficiente de correlación de Pearson r = 0,97 para la corteza y r = 0,96 para el hipocampo). Se promediaron las áreas 6E10 positivas reportadas por los dos lectores para el análisis de la subregión de interés, y el área promedio de la subregión de interés 6E10 positiva compartió una fuerte correlación positiva significativa (p < 0.0001) con el área 6E10 positiva obtenida utilizando el análisis de la región completa de interés para ambas cortezas (coeficiente de correlación de Pearson r = 0.96; Figura 5C) y el hipocampo (coeficiente de correlación de Pearson r = 0,95; Figura 5D). La media del área cortical e hipocampal-6E10 positiva obtenida por los análisis de región completa y subregión de interés fue comparable sin diferencias significativas, confirmando la concordancia entre los dos métodos (Figura 5E). Además, el Aβ1-42 insoluble se midió en homogeneizados de todo el cerebro en un subconjunto de ratones y el área cortical (Figura 5F) e hipocampal (Figura 5G) 6E10 positiva determinada por el análisis de la región completa de interés se correlacionó significativamente (p < 0,01) con la carga insoluble de Aβ1-42 utilizando ELISA (ver Tabla de Materiales).

Figura 1: Selección completa versus subregiones de interés. Imágenes representativas que muestran la isocorteza completa (corteza) y el hipocampo delineadas para el análisis de la región completa de interés en (A) y (B), respectivamente. Las imágenes representativas muestran la selección de la subregión/s de la corteza y el hipocampo para el análisis de la subregión de interés en (C) y (D), respectivamente. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Protocolo para la cuantificación de áreas 6E10 positivas de toda la región de interés. Pasos de análisis de imagen que muestran la imagen original (A), la imagen después del ajuste de brillo/contraste (B), la selección del área de interés (C), el borrado (D), el ajuste de umbral (E) y la imagen final lista para el análisis (F). Los números de la figura designan los números de paso en el protocolo. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Protocolo para la subregión de interés 6E10-cuantificación de área positiva. Pasos de análisis de imagen que muestran la imagen original (A), la imagen después del ajuste de brillo/contraste (B), la selección del área de interés (C), la duplicación de la imagen de la región de interés (D), el cambio de la imagen a 8 bits y la inversión de la imagen (E), el ajuste del umbral (F) y la imagen final lista para el análisis (G). Los números de la figura designan los números de paso en el protocolo. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Protocolo para la rotación de la región de interés. Pasos de análisis de imagen que muestran la selección del área de interés y la rotación del cuadro de selección para ajustarse a la curvatura del tejido (A), la imagen de la región de interés después de la duplicación (B) y la imagen después de despejar el área exterior (no región de interés) (C). Los números de la figura designan el número de paso en el protocolo. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Correlación entre los análisis completos y las subregiones de interés. Los gráficos de dispersión muestran la correlación entre el área 6E10 positiva por los dos lectores independientes que realizan el análisis de la subregión de interés para la corteza (A) y el hipocampo (B). Se observa una fuerte correlación positiva entre el área 6E10 positiva resultante del análisis de la subregión de interés y el análisis de la región completa de interés tanto para la corteza (C) como para el hipocampo (D). No hay diferencias estadísticamente significativas en el área media 6E10 positiva por la región completa de interés y la subregión de interés analizan en la corteza y el hipocampo (E). Se observa una correlación significativa entre las mediciones de Aβ1-42 insoluble homogeneizada de todo el cerebro utilizando ELISA y el análisis de la región completa de interés tanto para la corteza (F) como para el hipocampo (G). Los datos se analizaron utilizando el coeficiente de correlación de Pearson, r, en (A-D) y (F-G), y utilizando ANOVA de medidas repetidas bidireccionales en (E) utilizando un software de gráficos y estadísticas. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM) de n = 35 ratones en (E), y un p de dos colas < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.