Sondeo de la mecánica del conjunto de miosina en haces de filamentos de actina utilizando pinzas ópticas

Resumen

Se presenta y discute la formación de haces de actomiosina in vitro y la medición de la generación de fuerza del conjunto de miosina utilizando pinzas ópticas.

Resumen

Las miosinas son proteínas motoras que hidrolizan ATP para avanzar a lo largo de las pistas de filamentos de actina (FA) y son esenciales en procesos celulares como la motilidad y la contracción muscular. Para comprender sus mecanismos de generación de fuerza, la miosina II se ha investigado tanto a nivel de molécula única (SM) como como equipos de motores in vitro utilizando métodos biofísicos como el atrapamiento óptico.

Estos estudios mostraron que el comportamiento generador de fuerza de miosina puede diferir mucho cuando se mueve desde el nivel de una sola molécula en una disposición de tres perlas a grupos de motores que trabajan juntos en una superficie rígida de talón o cubreobjetos en una disposición de deslizamiento. Sin embargo, estas construcciones de ensayo no permiten evaluar la dinámica de grupo de la miosina dentro de la jerarquía estructural viscoelástica como lo harían dentro de una célula. Hemos desarrollado un método que utiliza pinzas ópticas para investigar la mecánica de la generación de fuerza por conjuntos de miosina que interactúan con múltiples filamentos de actina.

Estos paquetes de actomiosina facilitan la investigación en un entorno jerárquico y compatible que captura la comunicación motora y la salida de fuerza del conjunto. La naturaleza personalizable del ensayo permite alterar las condiciones experimentales para comprender cómo las modificaciones al conjunto de miosina, el haz de filamentos de actina o el entorno circundante dan como resultado diferentes salidas de fuerza.

Introducción

Las proteínas motoras son esenciales para la vida, convirtiendo la energía química en trabajo mecánico ^1,2,3. Los motores de miosina interactúan con los filamentos de actina dando pasos a lo largo de los filamentos similares a una pista, y la dinámica de las redes actina-miosina lleva a cabo la contracción muscular, la motilidad celular, el anillo contráctil durante la citocinesis y el movimiento de la carga dentro de la célula, entre otras tareas esenciales 3,4,5,6,7,8

Protocolo

1. Cubreobjetos de grabado

1. Disolver 100 g de KOH en 300 ml de etanol al 100% en un vaso de precipitados de 1.000 ml. Revuelva con una barra de agitación hasta que la mayoría del KOH se haya disuelto.
   PRECAUCIÓN: La solución concentrada de KOH puede causar quemaduras y daños a la ropa. Use guantes, protección para los ojos y una bata de laboratorio.
2. Coloque los cubreobjetos individualmente en los bastidores de limpieza de cubreobjetos.
   NOTA: Los bastidores están diseñados con ranuras que sostienen cubreobjetos individuales separados para permitir el grabado y el enjuague en cada cara del cubreobjetos, orificios de drenaje en l....

Resultados

Las células de flujo que contienen los sistemas de haz de actomiosina son de un diseño estándar, que consiste en un portaobjetos de microscopio y un cubreobjetos grabados separados por un canal hecho de cinta adhesiva de doble cara (Figura 1). Luego, el ensayo se construye desde el cubreobjetos utilizando introducciones escalonadas como se describe en el protocolo. El ensayo final consiste en filamentos de actina marcados con rodamina plantilla; la concentración de miosina deseada (se utiliz.......

Discusión

Se realizó un estudio in vitro utilizando pinzas ópticas combinadas con imágenes de fluorescencia para investigar la dinámica de los conjuntos de miosina que interactúan con los filamentos de actina. Los haces de actina-miosina-actina se ensamblaron utilizando miosina muscular II, actina rodamina en la parte inferior del haz y en la superficie del cubreobjetos, y filamentos de actina biotinilados marcados con 488 en la parte superior del paquete. La proteína de actina del músculo del conejo se polimerizó y estab.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Proteína de actina (biotina): músculo esquelético	Citoesqueleto	AB07-A	Proteína de actina biotinilada
Proteína de actina, músculo esquelético de conejo	Citoesqueleto	AKL99-A Proteína	de actina
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379	estabilizador de actina y Alexa Fluor 488 tinción
ATP	Fisher scientific	BP413-25	Requerido para la actina Ensamblaje y motilidad de la miosina
Beta-D-glucosa	Fisher scientific MP218069110		Parte del sistema de eliminación de oxígeno utilizado para reducir el fotoblanqueo durante la obtención de imágenes de fluorescencia
Bloqueador de grado de transferencia (caseína)	Biorad	1706404	Se utiliza para bloquear la superficie de la unión inespecífica
CaCl2	Fisher scientific	C79500	Cloruro de calcio, proporciona el control necesario sobre la dinámica de la red de miosina de actina
Catalasa	Fisher scientific	ICN10040280	Parte del sistema de eliminación de oxígeno utilizado para reducir el fotoblanqueo durante la obtención de imágenes de fluorescencia
Cubreobjetos	Fisher scientific	12544C	Se utiliza para fabricar celdas de flujo
DTT	Fisher scientific	AC327190010	Se utiliza para la preparación
de tamponesEtanol	Fisher scientific	A4094	Regent utilizado para la limpieza de cubreobjetos
Glucosa oxidasa	Fisher scientific	34-538-610KU	Parte del sistema de eliminación de oxígeno utilizado para reducir el fotoblanqueo durante la obtención de imágenes de fluorescencia
KCl	Fisher scientific	P217-500	Se utiliza para la preparación de tampones
KOH	Fisher scientific	P250-1	Se utiliza para grabar cubreobjetos y ajustar tampón pH
MgCl2	Fisher scientific	M33-500	Se utiliza para la preparación de tampones
Portaobjetos de microscopio	Fisher scientific	12-544-2	Se utiliza para fabricar células de flujo
Proteína de miosina II: músculo esquelético de conejo	Citoesqueleto	MY02	Proteína motora de miosina de longitud completa aislada del músculo esquelético de conejo
Nanotracker2	Bruker/JPK	NT2	Instrumento de captura óptica
Poly-l-lisina	Sigma-Aldrich	P8920	Instalaciones adhesión de filamentos de actina sobre la superficie de vidrio del cubreobjetos
Rodamina Faloidina		Citoesqueleto PHDR1	Estabilizador de actina y tinción fluorescente de rodamina
Perlas de estreptavidina, 1 μ m	Spherotech	SVP-10-5	Mango de captura óptica
Tris-HCl	Fisher scientific	PR H5121	Se utiliza para la preparación de tampones