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Un modelo para la epilepsia de etiología infecciosa utilizando el virus de la encefalomielitis murina de Theiler

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DOI:

10.3791/63673

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23 de junio de 2022

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1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Utah, 2Interdepartmental Program in Neuroscience, University of Utah, 3Faculty of Veterinary Medicine, Institute of Pharmacology and Toxicology, Freie Universität Berlin

En este artículo

Resumen

La infección intracerebral con el virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV) en ratones C57BL / 6 replica muchos de los síntomas clínicos tempranos y crónicos de la encefalitis viral y la epilepsia posterior en pacientes humanos. Este artículo describe la infección por virus, los síntomas y la histopatología del modelo TMEV.

Resumen

Una de las principales causas de epilepsia es una infección del sistema nervioso central (SNC); Aproximadamente el 8% de los pacientes que sobreviven a una infección de este tipo desarrollan epilepsia como consecuencia, con tasas significativamente más altas en los países menos desarrollados económicamente. Este trabajo proporciona una visión general del modelado de la epilepsia de etiología infecciosa y su uso como plataforma para nuevas pruebas de compuestos anticonvulsivos. Se presenta un protocolo de inducción de epilepsia por inyección intracerebral no estereotáctica del virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV) en ratones C57BL/6, que replica muchos de los síntomas clínicos tempranos y crónicos de la encefalitis viral y la epilepsia posterior en pacientes humanos. Se describe la evaluación clínica de ratones durante la encefalitis para monitorizar la actividad convulsiva y detectar los posibles efectos anticonvulsivos de nuevos compuestos. Además, se muestran las consecuencias histopatológicas de la encefalitis viral y las convulsiones, como el daño del hipocampo y la neuroinflamación, así como las consecuencias a largo plazo, como los ataques epilépticos espontáneos. El modelo TMEV es una de las primeras plataformas experimentales traslacionales, impulsadas por infecciones, que permite la investigación de los mecanismos del desarrollo de la epilepsia como consecuencia de la infección del SNC. Por lo tanto, también sirve para identificar posibles objetivos terapéuticos y compuestos para pacientes con riesgo de desarrollar epilepsia después de una infección del SNC.

Introducción

Una de las consecuencias frecuentes de la encefalitis viral son las convulsiones epilépticas. Muchas infecciones virales desencadenan convulsiones sintomáticas durante la fase aguda de la infección; El riesgo de tales convulsiones aumenta en más del 20% entre el público en general 1,2,3. Los pacientes que sobreviven a la infección también tienen un mayor riesgo de 4% -20% de desarrollar epilepsia crónica en los meses o años posteriores a la infección 1,4. El virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV) ha sido identificado como un virus adecuado para estudiar las convulsiones agudas y crónicas en un modelo de ratón de encefalitis viral 5,6,7. TMEV es un virus de ARN monocatenario sin envoltura, de sentido positivo de la familia Picornaviridae y se ha utilizado tradicionalmente para estudiar la desmielinización en la médula espinal de ratones SJL, de los cuales los ratones C57BL / 6 (B6) están protegidos porque tienen la capacidad de eliminar el virus rápidamente después de la infección. Sin embargo, TMEV induce convulsiones agudas en el 50% -75% de los ratones B6 machos y hembras dentro de la primera semana postinfección (pi), mientras que alrededor del 25% -40% desarrollan epilepsia crónica semanas a meses pi 2,5,6,8,9. Además de las convulsiones, los ratones también muestran la histopatología común de un hipocampo epiléptico con neurodegeneración y gliosis 5,6,8,10,11,12. Además, los ratones B6 infectados con TMEV se desempeñan significativamente peor en las pruebas de comportamiento para el aprendizaje y la memoria y tienen comorbilidad cognitiva, que también se observa en pacientes clínicos con epilepsia13,14,15.

Tradicionalmente, los modelos de epilepsia y convulsiones utilizan la aplicación de sustancias quimioconvulsivas o estimulación eléctrica para inducir convulsiones; Sin embargo, estos modelos carecen de validez de constructo y a menudo muestran convulsiones y daño cerebral más graves que los observados en pacientes clínicos16. No existe un modelo que sea apropiado para cada pregunta de investigación17. El uso del modelo TMEV es especialmente interesante si se investigan los factores predisponentes del desarrollo de convulsiones después de una infección del SNC o si se examinan los compuestos por su eficiencia anticonvulsiva.

Dado que el modelo TMEV se ha establecido y utilizado en varios laboratorios diferentes a nivel internacional, los autores han identificado muchos detalles que permiten la implementación exitosa del modelo, por ejemplo, la especificidad de diferentes cepas de virus y ratones. La inducción convulsiva más fiable se generó con la cepa de Daniel de ratones TMEV y B6J 2,5,6,8,9. El modelo es utilizado actualmente por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) como plataforma para identificar nuevos fármacos contra la epilepsia y las convulsiones18,19. Este documento incluye el protocolo detallado de inducción del virus y el monitoreo clínico para permitir que otros investigadores utilicen este modelo de encefalitis viral para mejorar la comprensión de los mecanismos de la enfermedad, así como para las pruebas de drogas.

El siguiente protocolo refleja un estudio diseñado para pruebas de compuestos en este modelo, aunque se pueden realizar muchos otros tipos de estudios. Los ratones son anestesiados brevemente antes de la inyección con la cepa de Daniel de TMEV en la región temporal del hemisferio derecho (posterior y medial al ojo derecho). Dependiendo de la pregunta de investigación, si se requieren animales de control no infectados, los ratones reciben solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS, pH 7.4, incluyendo KH 2 PO 4 [1.06 mM], NaCl [155.17 mM] y Na 2 HPO4·7H 2 O [2.97mM]) en lugar de TMEV. La experiencia previa en ratones infectados con TMEV ha indicado que las convulsiones inducidas por el manejo ocurren entre el día 3 y el día 7 después de la infección. La frecuencia de la inyección, la vía y el tiempo de prueba de los compuestos experimentales varían según sus propiedades. Se recomienda realizar la inoculación del virus un viernes, lo que permite que el monitoreo de las convulsiones del día 3-7 ocurra la semana siguiente, de lunes a viernes. Durante la semana de monitoreo de convulsiones, los compuestos experimentales pueden administrarse (i.p.) dos veces al día (con al menos 4 h de diferencia) a menos que la cinética o el mecanismo de acción del compuesto sugieran lo contrario. El monitoreo de las convulsiones durante el tratamiento se puede realizar en un punto de tiempo previamente determinado. Los tiempos de inyección y observación varían dependiendo de los compuestos individuales. A los animales se les inyecta el compuesto de ensayo o con un vehículo en lugar del compuesto farmacológico. Estos dos grupos pueden ser manejados y observados de manera análoga al grupo experimental. Durante el experimento, la única persona que maneja los ratones y califica las convulsiones debe estar cegada al tratamiento.

Protocolo

Todos los procedimientos descritos fueron autorizados por las autoridades respectivas. Los animales se mantienen siguiendo las recomendaciones de la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio" (Consejo Nacional de Investigación) y de acuerdo con la política del Servicio de Salud Pública y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Utah, protocolo animal (número: 21-11009, Departamento de Farmacología y Toxicología) y en Freie Universität Berlin (protocolo: G0015/21, LAGeSo Berlin, Instituto de Farmacología y Toxicología), respectivamente. Los resultados mostrados en la Figura 3 y la Figura 5 fueron aprobados bajo 33.9-42502-04-11/0516 y 33.9-42502-04-15/1892 (LAVES Oldenburg, Departamento de Farmacología, Toxicología y Farmacia, Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover).

1. Consideraciones y preparativos para el diseño del estudio

  1. Virus
    1. La cepa de Daniel's de TMEV fue amablemente proporcionada por Robert Fujinami de la Universidad de Utah. Originalmente, estaba aislado de un ratón en la colonia20 de Harvard. Busque la clasificación y las regulaciones específicas para agentes biológicos en los respectivos países antes de manejar TMEV, y discuta con el personal de bioseguridad institucional para garantizar el cumplimiento de las regulaciones. Por lo general, TMEV se clasifica como BSL 2, dependiendo de la cepa y las modificaciones genéticas. La dosis estándar necesaria para inducir convulsiones en la mayoría de los animales es de 3 x 105 unidades formadoras de placa (UFP).
      NOTA: La dosis podría tener que ser adaptada, por ejemplo, si se utilizan ratones transgénicos. En general, se han utilizado títulos entre 2 x 104 PFU y 2,44 x 107 PFU para inducir con éxito las convulsiones. Los animales de control reciben PBS estéril y no experimentan convulsiones. El virus no infecta a los humanos; sin embargo, los experimentadores deben usar EPP (bata de laboratorio, guantes, gafas de seguridad) en todo momento, y las carcasas de ratones y la ropa de cama deben esterilizarse en autoclave antes de su eliminación.
  2. Animales
    1. Para inducir e investigar convulsiones, use ratones B6J, ya que otras cepas de ratones no necesariamente muestran convulsiones, por ejemplo, ratones SJL / J, FVB / N o ratones Balb / c5. No hay diferencia entre ratones hembra y macho en la frecuencia de convulsiones agudas5. Realice los experimentos en ratones adolescentes a adultos (a partir de las 5-6 semanas de edad).
  3. Dieta
    1. La dieta se ha determinado como una fuente de variabilidad de laboratorio a laboratorio en la gravedad de la enfermedad; Por lo tanto, considere la dieta como un factor potencial para la variación22.
  4. Tamaño del grupo
    1. Dado que no todos los animales desarrollan convulsiones agudas o crónicas en este modelo, use alrededor de 20 ratones / grupo para las pruebas de compuestos.
  5. Bienestar animal
    1. Si algún ratón demuestra efectos adversos significativos de la infección o administración del compuesto en investigación (por ejemplo, letargo, aseo deficiente, enrojecimiento excesivo y secreción purulenta de la herida) después de un tiempo de observación determinado por las pautas locales de IACUC (por ejemplo, 48 h), eutanasia al ratón humanamente.
    2. Eutanasia a cualquier ratón que demuestre una pérdida extrema de peso corporal (>20%) durante el período de infección de manera humanitaria.
    3. Si los animales no comen adecuadamente, dales acceso a gránulos suplementarios humedecidos con solución electrolítica pediátrica o similar.

2. Inoculación del virus

  1. Esterilización de la jeringa inyectable
    1. Retire la tapa de la jeringa de insulina. Agregue tubos de polietileno como collar alrededor de la aguja para garantizar una profundidad de inyección adecuada de 2,5 mm. Sumerja la jeringa en etanol durante 30 min. Coloque la jeringa bajo luz UV durante 30 min.
    2. Vuelva a colocar la tapa en la aguja. Envuelva la jeringa en una bolsa esterilizante y ciérrela con cinta adhesiva. Etiqueta con la fecha de preparación.
  2. Inyección de virus
    1. Obtenga alícuotas de la cepa de TMEV de Daniel del congelador de -80 °C. Descongele el virus y manténgalo en hielo. Evite descongelar y volver a congelar el virus. Cargue la jeringa con la suspensión del virus (3 x 105 PFU diluidas en 20 μL de PBS o medio de cultivo DMEM).
      PRECAUCIÓN: El virus es infeccioso para los ratones pero no para los humanos.
    2. Limpie el banco con desinfectante y trabaje bajo un absorbedor de humos. La inoculación del virus no es estéril, pero es lo más limpia posible.
    3. Transfiera el ratón a la cámara de inducción de anestesia y use isoflurano al 2% en oxígeno para inducir la anestesia. Alcanzar la tolerancia quirúrgica toma unos minutos; Ajuste la concentración en función de la respiración del animal y la profundidad de la anestesia.
    4. Transfiera el ratón anestesiado de la caja de anestesia debajo del capó. Verifique la tolerancia quirúrgica, por ejemplo, pellizcando el dedo del pie. Todo el procedimiento se realiza en menos de 30 s, por lo que el animal no necesita inhalar isoflurano durante la inyección. Agregue ungüento para los ojos para evitar que se seque la córnea.
    5. Limpie la cabeza del animal con una almohadilla de alcohol. Gire la cabeza del ratón ligeramente hacia la izquierda para que el lugar de inyección apunte hacia arriba.
    6. Tire de la piel un poco hacia atrás, inserte la aguja en la cabeza e inyecte 20 μL intracorticalmente a una profundidad de 2,5 mm en la región temporal del hemisferio derecho (posterior y medial al ojo derecho).
    7. Realizar la inyección unilateralmente en el mismo hemisferio en todos los animales. Use el ojo y el oído como puntos de referencia para la ubicación de la corteza parietal. La colocación ha sido previamente verificada histológicamente; ver Figura 1. Las coordenadas de inyección según la inyección estereotáxica en relación con bregma son −2,0 (PA); +3,0 (ML); −1,5 (DV).
    8. Deje la jeringa en su lugar durante 5-15 s. Anote si hay alguna fuga de la inyección o si se observan burbujas de aire; en ese caso, prepare una jeringa nueva. Cuando saque con cuidado la jeringa, gírela ligeramente. Aplique ungüento para los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
    9. OPCIONAL: Codifique el animal en la cola o la oreja dependiendo de los procedimientos locales (opcional pero fácil ya que el animal está inconsciente).
    10. Transfiera al animal a una jaula nueva, que se coloca medio encendido / mitad fuera de una almohadilla térmica (35-40 ° C) durante la recuperación de la anestesia. No deje a los animales desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
      NOTA: Los animales pueden ser alojados en grupo nuevamente después de la recuperación (los animales infectados no se mezclan con animales infectados simulados). Los ratones infectados no deben alojarse en la misma habitación que los ratones no infectados.
    11. Mantenga un registro del peso de los ratones durante los primeros 7 días pi, ya que pierden peso después de la infección y pueden requerir alimentación adicional.

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Figura 1: Esquema del procedimiento de inyección de TMEV. De izquierda a derecha: Para una inyección de corteza parietal derecha, la aguja se inyecta ligeramente lateral de una línea imaginaria entre el ojo y el oído opuesto. El collar para el control de profundidad está indicado en amarillo. El tracto de inyección se puede ver en la sección coronal del cerebro, marcada por la flecha. El lugar de inyección corresponde a las coordenadas dadas sobre la flecha. La imagen de la derecha muestra la distribución del virus Theiler (violeta) dentro del CA1 de la formación del hipocampo. La figura se preparó utilizando biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Pruebas de compuestos

  1. Preparación de compuestos
    1. Revise las instrucciones de formulación. Prepare la solución del vehículo según las recomendaciones o instrucciones proporcionadas. Como ejemplo, se presenta el procedimiento para el fármaco antiepiléptico levetiracetam (LEV). LEV reduce la carga convulsiva al 30%-40% de los niveles del vehículo a una dosis de 350 mg/kg. El vehículo utilizado en este estudio es 0,5% metilcelulosa.
    2. Calcular las dosis dependiendo del compuesto. Pese el medicamento de acuerdo con el cálculo. Para tratar 1 kg de ratones, pesar 350 mg de LEV.
    3. Prepare una solución madre con el volumen adecuado de solución del vehículo, según lo indicado por las instrucciones de formulación (por ejemplo, sonicación, excipientes del vehículo, etc.). Considerando un volumen de inyección de 0,01 mL/g de ratón, el volumen de inyección para 1 kg sería de 10 mL con 350 mg de LEV, resultando en una solución de 35 mg/mL19. Informe el cálculo y la dosis en mg/kg y el volumen en ml.
      NOTA: Un protocolo ejemplar se puede encontrar en la página 2 del Material Suplementario 1.
  2. Administración de compuestos
    1. Aleatorizar jaulas al vehículo o grupo compuesto. Utilice ratones infectados simulados para estudios sobre los mecanismos de desarrollo de la epilepsia o para fines de validación, pero no para la detección rutinaria de drogas.
    2. Informe las condiciones del entorno, como la temperatura, la humedad, la hora del día, etc.
    3. Vórtice la solución con el compuesto, así como la solución del vehículo. Aspire el vehículo o compuesto en una jeringa y codifique por colores las jeringas para evitar confusiones.
    4. Pesa los animales. Asegúrese de que los ratones B6J tengan >18 g en el día 3 pi (no redondeados). Informe el peso.
    5. Administrar el compuesto (por ejemplo, por inyección intraperitoneal u otras vías apropiadas). Escriba la hora y la ruta de administración.
    6. Controle a los animales para detectar cualquier cambio de comportamiento después de la administración del compuesto, especialmente después de las primeras inyecciones. Si ocurren convulsiones, informar la intensidad de las convulsiones de acuerdo con la escala de Racine23; Consulte el paso 3.2.
      NOTA: Un protocolo ejemplar para la administración de compuestos se puede encontrar en el Material Suplementario 1, página 3, mientras que las convulsiones observadas durante la administración se registrarían en el Material Suplementario 1, páginas 4-5.
  3. Monitoreo de las convulsiones inducidas por manipulación
    1. Realizar este procedimiento por un experimentador cegado al tratamiento. Lleva todas las jaulas al banco. Observe a los animales para detectar convulsiones 2 veces al día durante la fase de luz.
    2. Puntuar la actividad convulsiva mediante una escala de Racine modificada23: 0 = ningún cambio en el comportamiento, 1 = movimientos de la boca y la cara, 2 = cabeceo con la cabeza, 3 = clono unilateral de las extremidades anteriores, 4 = clono bilateral de las extremidades anteriores con crianza, 5 = actividad tónico-clónica generalizada con pérdida del tono postural, a veces saltando, 6 = salto prolongado y excesivo e hiperactividad. Informe el número y la intensidad de las convulsiones.
    3. Deslice un bolígrafo por la jaula para hacer algo de ruido.
    4. Transfiera cada animal a otra caja y viceversa.
    5. Agite suavemente la jaula con un movimiento de ida y vuelta, teniendo cuidado de no sacudir la jaula tan vigorosamente que los animales golpeen los lados o la parte superior de la jaula y corran el peligro de sufrir lesiones físicas.
    6. Controle a todos los animales en la jaula para detectar convulsiones. En cualquier momento, si un ratón tiene una convulsión, transfiérala de nuevo a la jaula de la casa y anote el nivel de la convulsión sin más estimulación de las convulsiones por ruido o manipulación.
    7. Para los animales que no se han agarrado espontáneamente o después de una suave sacudida de la jaula, desencadene las convulsiones mediante un manejo más intenso: gire cuidadosamente el mouse volteándolo en su cola de izquierda a derecha.
      NOTA: Los animales con convulsiones son hiperexcitables y pueden estar nerviosos.
    8. Observe a cada animal para detectar el comportamiento convulsivo nuevamente. Repita el proceso para jaulas posteriores.
      NOTA: Un protocolo ejemplar para el monitoreo de convulsiones se puede encontrar en el Material Suplementario 1, páginas 6-7.
  4. Informe de datos sobre efectos compuestos
    1. Analice el peso corporal diario utilizando ANOVA de medidas repetidas (RM).
    2. Utilice los valores diarios acumulativos de la carga convulsiva para obtener una representación gráfica de los datos. Presente los datos de eficacia (número de animales sin convulsiones en estadio 3-5 de Racine) como el número protegido / el número probado en cada grupo respectivo (generalmente N = 20). Por lo tanto, compare los datos entre los grupos tratados con vehículos y medicamentos para las respuestas (incautación o no incautación) utilizando una prueba exacta de Fisher.
      NOTA: Un animal se considera "protegido" de las convulsiones si tiene una convulsión de la etapa 2 o menos y los animales no protegidos tienen convulsiones de las etapas 3-5.
    3. Analice los datos de tolerabilidad de manera similar, como el número de animales con trastornos de comportamiento o efectos tóxicos / el número probado en cada grupo. Tenga en cuenta cualquier efecto adverso, incluidas las muertes.
    4. Si menos del 50% de los ratones inyectados con el vehículo se apoderan agudamente, no considere los datos.

Resultados

Efectos compuestos sobre las convulsiones agudas
Las convulsiones conductuales se registran si ocurren durante la inyección de drogas (DI) o durante las sesiones posteriores de manejo / monitoreo de convulsiones AM / PM. Las convulsiones observadas durante la manipulación de las convulsiones se pueden presentar como un mapa de calor, que se muestra en la Figura 2 para LEV (350 mg / kg). Para el análisis de la carga convulsiva, se toma el promedio de los valores acumulados finales (día 7) de la carga convulsiva para el grupo tratado con vehículo y se compara mediante la prueba U de Mann-Whitney con el grupo compuesto tratado (los valores de la carga convulsiva incluyen los recogidos en la observación posterior a la inyección). Para la eficacia del compuesto, una prueba exacta de Fisher determina si existe una diferencia estadística en la eficacia entre los grupos tratados con vehículos y medicamentos. Del mismo modo, los datos de tolerabilidad se analizan con la prueba exacta de Fisher. El análisis del peso corporal se realiza mediante ANOVA de medidas repetidas para determinar los cambios en el transcurso del experimento, así como las diferencias entre los ratones tratados con compuestos y vehículos.

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Figura 2: Un mapa de calor de las convulsiones conductuales después de la prueba con vehículo (0,5% metilcelulosa) o LEV (350 mg / kg). Las inyecciones dos veces al día ocurrieron 1 h antes de la manipulación y las observaciones de convulsiones. Las convulsiones conductuales se registraron si ocurrieron durante la inyección de drogas (DI) o durante las sesiones posteriores de manejo / monitoreo de convulsiones AM / PM. LEV (350 mg/kg) reduce significativamente las convulsiones observadas durante las sesiones de manipulación (35,9% de la carga convulsiva del vehículo) durante el período de observación de 5 días. El mapa de calor se crea representando las convulsiones etapa 1-3 en verde, 4 en amarillo y 5 en naranja. Esta nueva figura se creó a partir de un conjunto de datos publicado19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Epilepsia crónica
Además de la carga convulsiva reportada en la primera semana pi, hay varias lecturas que podrían ser útiles dependiendo del estudio y la hipótesis. Si los animales se mantienen a largo plazo, un subconjunto de animales infectados desarrollará ataques epilépticos espontáneos a las varias semanas pi, que ocurren con menos frecuencia que las convulsiones agudas y, por lo tanto, requieren el registro de EEG. Para registrar el EEG de ratones, los electrodos necesitan ser implantados en una cirugía estereotáxica24. La Figura 3 muestra varios eventos epilépticos en la fase crónica mediante el registro de EEG en ratones infectados con TMEV8.

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Figura 3: Trazas típicas de EEG en la fase crónica (14 semanas pi) después de la infección por el virus DA en ratones. (A-C) Eventos de EEG representativos en los que no se observó correlación motora conductual, es decir, (A) picos individuales, (B) grupos de picos, (C), así como una convulsión electrográfica, presumiblemente focal. (D-F) Eventos representativos de EEG con correlatos conductuales. El ratón ilustrado en D tuvo eventos similares a convulsiones con contracciones mioclónicas (indicadas por "M", acompañadas de artefactos de movimiento), movimientos estereotipados (indicados por "press de cabeza", cuando el ratón presionó la cabeza contra el suelo) o arresto de comportamiento; "Scr" describe un artefacto de movimiento de rascado, (E) y (F) muestran alteraciones típicas del EEG durante las convulsiones convulsivas generalizadas: (E) una convulsión de Racine etapa 3 con una duración de 22 s y 1 Hz, y (F) una convulsión en etapa 5 con una duración de 34 s y 5.4 Hz. Esta cifra se ha publicado antes de8 y se reproduce con permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Histología
Dado que la epilepsia y las convulsiones suelen ir acompañadas de patología del hipocampo en los pacientes, que se recapitula en modelos experimentales, la mayoría de los laboratorios también analizan los cambios en el hipocampo o el efecto de un posible tratamiento anticonvulsivo en la patología. Los parámetros comúnmente analizados incluyen la neurodegeneración y la contracción del hipocampo, así como la inflamación mediante el etiquetado de poblaciones específicas de células inmunes. Para tales análisis, al final del experimento, los ratones son profundamente anestesiados hasta que se produce un paro respiratorio y la frecuencia cardíaca disminuye significativamente o muestra arritmia. La sangre se extrae por perfusión intracárdica de PBS seguida de paraformaldehído (PFA) al 4%25 para fijar el tejido. El tejido se procesa entonces mediante criosección y tinción (inmuno)26, seguida de análisis microscópicos.

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Figura 4: Degeneración del hipocampo en ratones epilépticos infectados con TMEV. (A,B) Las secciones coronales teñidas de violeta de Cresyl muestran citoarquitectura normal en un ratón (A) control (PBS) y degeneración del hipocampo en un ratón TMEV (B) a los 2 meses pi. Nota: Ventrículos laterales agrandados, colapso del alveo y adelgazamiento de la capa celular piramidal. (C) La cuantificación de este daño muestra una disminución significativa en el área del hipocampo y un aumento correspondiente en el área ventricular de ratones TMEV (N = 7) frente a ratones PBS (N = 6; los datos son medios ± SEM; p < 0,001; Prueba t de Student). (D,E) El etiquetado de NeuN ilustra aún más la magnitud de la pérdida de células neuronales en secciones tomadas a los 6 meses pi. Las flechas indican regiones con pérdida celular piramidal completa. (E) El giro dentado parece estar relativamente intacto incluso en ratones epilépticos. Barra de escala = (A,B) 2 mm; (D,E) 0,5 mm. Esta figura ha sido publicada antes de6 y se reproduce con permiso de Oxford University Press. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Fotomicrografías representativas de diferente gravedad de la infiltración de células T por encefalitis aguda a los 7 días de la infección. Las secciones seriadas que contienen el hipocampo dorsal ipsilateral se tiñeron con anticuerpos contra CD3 para marcar los linfocitos T. (A, D) Un hipocampo normal sin infiltración de células T como apareció en animales infectados simulados. (B, E) Infiltración moderada de células T como se observa en la mayoría de los ratones infectados con TMEV. (C, F) Una infiltración severa de linfocitos T, que solo se observó en algunos de los ratones infectados. Esta cifra se ha publicado antes de8 y se reproduce con permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: El archivo complementario consiste en el formulario utilizado para las pruebas de compuestos en el modelo TMEV. La página 1 ofrece una visión general de la configuración experimental. La información sobre el compuesto, el vehículo y la preparación de la solución compuesta se registra en las páginas 1-2. La aplicación compuesta se registra en la página 3. Las hojas de puntuación en las páginas 4-5 se utilizan para registrar las convulsiones observadas y cuantificadas por el experimentador que realiza la inyección del compuesto. En la página 4, se pueden recopilar datos para las jaulas 1-4 de 5 ratones cada una, y en la página 5, se pueden registrar las jaulas 5-8, que es el número estándar de animales para pruebas de compuestos en nuestras manos. Las hojas de puntuación en las páginas 6-7 son utilizadas por el observador ciego que está realizando la observación, el manejo y el suave agito de la jaula 1 h después de cada inyección de compuesto. Una vez más, los puntajes de las convulsiones se pueden observar para ocho jaulas en total en estas hojas de puntaje ejemplares. La última página 8 se puede utilizar para registrar cualquier otra observación o nota. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Este es el primer modelo de roedor basado en infecciones para la epilepsia que permite la investigación del desarrollo de convulsiones agudas y crónicas. Ayudará a identificar dianas farmacológicas y nuevos compuestos para la prevención o modificación de enfermedades para una de las etiologías más comunes de la epilepsia.

Como se describió anteriormente, puede ser necesario considerar cuidadosamente el lote y el título viral para garantizar que una proporción adecuada de ratones tratados con TMEV demuestren convulsiones inducidas por el manejo. Si los animales tienen menos convulsiones de lo habitual, use un lote de N = 20 animales para verificar la eficiencia del virus. Si su actividad está disminuida (menos del 50%), es hora de hacer nuevas alícuotas y probarlas con N = 20 animales. Si las nuevas alícuotas no son más eficientes, se debe purificar un nuevo lote del virus. Para algunas líneas de ratones transgénicos, puede ser necesario usar un título viral más bajo; Por lo tanto, el título viral debe diluirse según sea necesario después de los experimentos preliminares. La mayoría de los datos disponibles sobre ratones B6 se originaron en Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, EE.UU. o Charles River, Sulzfeld, Alemania); sin embargo, se han confirmado tasas de convulsiones similares en ratones B6 obtenidos de Harlan (Eystrup, Alemania)8. Las tasas de incautación de animales transgénicos con antecedentes de B6 son comparables a las de ratones B6 de tipo salvaje, pero podrían diferir si los cambios genéticos influyen en la invasión del virus, la respuesta inflamatoria o la neurodegeneración21. Las convulsiones agudas se observan espontáneamente pero se desencadenan por la manipulación y el ruido, por lo que es de suma importancia manipular a todos los animales de manera similar cuando se comparan las tasas de convulsiones. Las sesiones de manipulación dos veces al día han proporcionado previamente una alta carga convulsiva y una mayor proporción de ratones que demostraron convulsiones durante los días 3-7 después de la infección 6,8,19. También se pueden emplear sesiones adicionales de manipulación (día 1 y día 2) para aumentar la carga de las convulsiones. Además, se puede observar a los animales antes de cada sesión de manipulación para garantizar que no se produzcan convulsiones espontáneas. Un entorno de laboratorio ruidoso, por ejemplo, puede producir convulsiones, lo que a su vez puede hacer que los animales sean refractarios a las convulsiones inducidas por el manejo durante los tiempos de prueba.

Si bien la infección por TMEV produce convulsiones inducidas por manipulación en la mayoría de los ratones, se desconoce por qué algunos animales son resistentes a este tratamiento. Como se describió anteriormente, puede ser que las convulsiones electrográficas (con comportamientos mínimos o nulos) ocurran y normalmente no se cuantifiquen sin el registro concomitante del EEG. También puede ser que pequeñas diferencias en la ubicación de la inyección faciliten la reducción del efecto viral en el cerebro; Sin embargo, se han reportado convulsiones después de la infección cortical y estriatal 5,6,8,9 debido al tropismo del virus al hipocampo. Para los estudios de detección de drogas en este modelo, para identificar una reducción en las convulsiones (por ejemplo, una reducción del 50% en la carga convulsiva), se requiere un mayor número de animales para cada grupo (por ejemplo, N = 20). Además, la variabilidad en los comportamientos de convulsiones en este modelo requiere mayores diferencias en los efectos de las drogas frente a los de los vehículos para identificar una reducción significativa de las convulsiones. Por lo tanto, una limitación de este modelo es el requisito de grupos más grandes. Sin embargo, el tamaño suficiente de los grupos también permite la identificación de efectos anticonvulsivos y antiinflamatorios en este modelo19.

La gran mayoría de las convulsiones observables en este modelo ocurren durante el período de infección aguda. A pesar de la aparición de degeneración del hipocampo, activación de células inmunes y déficits cognitivos observados en ratones tratados con TMEV, solo una pequeña porción de los animales tratados eventualmente desarrollan convulsiones crónicas y espontáneas. Esta baja carga general de convulsiones requeriría un gran número de ratones infectados para estudiar adecuadamente las convulsiones espontáneas en este modelo, que está más allá del alcance y la capacidad de muchos proyectos. La implantación de electrodos de profundidad y el monitoreo de EEG también aumentarían la carga sobre los animales de experimentación. Si bien los electrodos de profundidad pueden ayudar en la identificación de la actividad convulsiva espontánea, los cambios en la anatomía del hipocampo después de la infección pueden hacer que la colocación constante de los electrodos sea un desafío.

La necesidad urgente de identificar nuevos tratamientos para la epilepsia requiere el desarrollo de modelos que puedan usarse como un método de detección rápida para la eficacia anticonvulsiva. Este modelo proporciona características para atender esta solicitud urgente. Además, el hecho de que no requiera ninguna cirugía estereotáctica lo convierte en un modelo adecuado y fácil de realizar para la investigación de compuestos anticonvulsivos.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

SB es apoyado por una subvención inicial de la FU Berlín. KSW cuenta con el apoyo de R37 NS065434 y la Fundación ALSAM. LAB está respaldado por un premio D-SPAN 1F99NS125773-01. Agradecemos a Robert Fujinami, Ph.D. por proporcionarnos el virus Theiler y a la Instalación Central de Imágenes Celulares de la Universidad de Utah por el apoyo de microscopía.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Balanza
analíticaMettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.)302165420. 1 mg– 220 g 
Equilibrio animalOhaus (Parsippany, NJ, U.S.A.)STX22020,01 g– 2200 g 
Jeringas de insulina BD Lo-Dose U-100BD (Mississauga, ON, Canadá) BD329461Jeringas estériles Lo-Dose con aguja intravenosa BD Micro-Fine permanente - 1 mL
Cepa de TMEV de Daniel'samablemente proporcionada por Robert Fujinami (Universidad de Utah)-3 unidades formadoras de placas de 105 alícuota(s)
Desinfectante, p. ej. VennoVet 1 superMenno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH,Alemania-Recomendadopor los veterinarios del campus con menos o igual al 5% de alcohol
Almohadilla de preparación con alcohol estéril mediana Fisherbrand C7 Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, EE. UU.)22-363-750
FlurisoVETone (Boise, ID, EE. UU.)Isoflurano 250 mL, 2%– 5%
Absorbedor de humos Labconco (Kansas City, Missouri, EE.UU.)--
Batas de laboratorio blancas desechables SMS de protección general   Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, EE. UU.)17-100-810A Prisma
GraphPad versión 9 (La Jolla, CA, EE.UU.)
Cubo de hielo:cualquier
Microsoft Excel Microsoft  (Redmond, WA, EE.UU.)
Microsoft Word Microsoft (Redmond, WA, EE.UU.)
Jaula de ratón:cualquier jaula de ratón que contenga al menos 5
agujas PrecisionGlide de ratón BD (Mississauga, ON, Canadá)329652Punta deslizante BD con jeringas de insulina con aguja PrecisionGlide - 26 g x 3/8 - 0,45 mm x 10 mm
esterilizante autosellante Fisher Scientific (Hampton, Nueva York, EE. UU.)NC9241087 12,6 x 25,5 cm
Matraz de vidrio pequeño:cualquiera, volumen 25 mL
estéril PBSThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.)
Barra agitadoraCarl Roth GmbH & CO. KGX171.1tamaño según el volumen de solución Placa agitadora
Carl Roth GmbH & CO. KGAAN2.1
Jeringa Luer-LokBD (Mississauga, ON, Canadá)309628Jeringa de 1 mL solamente
Limpiador ultrasónico, calentador/temporizador mecánicoCole-Parmer (Vernon Hills, IL, EE. UU.)EW-08895-23Sonicador de baño - 0.5 gal, 115 V
Soluciónpara vehículos,dependiendo del vehículo compuesto
Vortex REAX Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Alemania541-10000-00
502017 bolsa 10010056

Referencias

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