La combinación de la transducción de vectores virales y la limpieza cerebral utilizando el método CLARITY permite la investigación de un gran número de neuronas y astrocitos simultáneamente.
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Artículo de método
Investigación de la interacción espacial entre astrocitos y neuronas en cerebros despejados
En este artículo
Resumen
Resumen
La combinación de la transducción de vectores virales y la limpieza de tejidos utilizando el método CLARITY permite investigar simultáneamente varios tipos de células cerebrales y sus interacciones. La transducción de vectores virales permite el marcado de diversos tipos de células en diferentes colores de fluorescencia dentro del mismo tejido. Las células pueden ser identificadas genéticamente por actividad o proyección. Utilizando un protocolo CLARITY modificado, el tamaño potencial de la muestra de astrocitos y neuronas ha crecido en 2-3 órdenes de magnitud. El uso de CLARITY permite la obtención de imágenes de astrocitos completos, que son demasiado grandes para caber en su totalidad en rodajas, y el examen de los somata con todos sus procesos. Además, brinda la oportunidad de investigar la interacción espacial entre los astrocitos y los diferentes tipos de células neuronales, a saber, el número de neuronas piramidales en cada dominio astrocítico o la proximidad entre los astrocitos y las poblaciones específicas de neuronas inhibitorias. Este documento describe, en detalle, cómo se deben aplicar estos métodos.
Introducción
En los últimos años, el conocimiento de la función de los astrocitos y cómo interactúan con los circuitos neuronales ha aumentado dramáticamente. Los astrocitos pueden influir en la plasticidad 1,2, ayudar en la recuperación neuronal postinjuria 3,4 e incluso inducir la potenciación neuronal de novo, con estudios recientes que muestran la importancia de los astrocitos en la adquisición y recompensa de la memoria, anteriormente consideradas como funciones puramente neuronales 5,6,7....
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Protocolo
Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Hebrea y cumplieron con las pautas de la Guía del Instituto Nacional de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Transducción de vectores virales
NOTA: La transducción de vectores virales se utiliza para expresar fluoróforos en el cerebro.
- Utilice un atlas (por ejemplo, Allen Brain Atlas) para localizar la coordinación relevante del área objetivo.
NOTA: Los atlas 3D se pueden encontrar en línea (por ejemplo, http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer).
....
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Resultados
La limpieza exitosa de rebanadas gruesas de tejido cerebral da como resultado una nueva gama de preguntas que se pueden hacer con respecto a las propiedades de las poblaciones de células grandes en comparación con las propiedades de las células individuales o grupos vecinos de células. Para lograr resultados exitosos, uno debe adherirse estrictamente al protocolo CLARITY, ya que hay una amplia gama de parámetros que deben considerarse para reducir la varianza entre muestras (por ejemplo, porcentaje de claridad, informaci.......
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Discusión
Los métodos de limpieza de tejidos presentan una herramienta revolucionaria en la investigación del cerebro, invitando a preguntas que antes no se podrían haber hecho. A partir de apuntar a las propiedades de un pequeño grupo de células, una sola célula o incluso una sola sinapsis, CLARITY ahora permite la orientación de poblaciones celulares totales o características de conectividad de largo alcance mediante el uso de fluoróforos relevantes.
El resultado de la combinación de la expresión del .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este proyecto ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención n.º 803589), la Fundación de Ciencias de Israel (subvención ISF n.º 1815/18) y las subvenciones Canadá-Israel (CIHR-ISF, subvención n.º 2591/18). Agradecemos a Nechama Novick por comentar todo el manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | vector viral utilizado para detectar astrocitos | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | vector viral utilizado para detectar neuronas | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | vector viral utilizado para detectar núcleos neuronales | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral utilizado para detectar neuronas | |
| Acrilamida (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrilamida (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Ácido bórico | Sigma | #B7901 | Peso molecular: 61,83 g/mol |
| Microscopio confocal, de escaneo, FV1000 | Olympus | 4x objetivo (UPlanSApo, 0.16 NA) | |
| Software | ImarisBitplane, Reino Unido | Un software que permite el análisis 3D de imágenes | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| Software | Un software que permite el análisis 3D de imágenes utilizando realidad virtual | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Peso molecular - 121,14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Microscopio de dos fotones | Neurolabware | Ti:láser de zafiro (Chameleon Discovery TPC, Coherent), tubos fotomultiplicadores GaAsP (Hamamatsu, H10770-40), filtro de paso de banda (Semrock), objetivo de inmersión en agua 16x (Nikon, 0.8 NA) | |
| VA-044 Iniciador | Wako | #011-19365 |
Referencias
- Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).
- Ciappelloni, S., et al. Aquaporin-4 sur....
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Reimpresiones y permisos
