Summary
L'esaurimento extracellulare del glucosio marcato fluorescentemente è correlato all'assorbimento del glucosio e potrebbe essere utilizzato per lo screening ad alto rendimento dell'assorbimento del glucosio negli organi asportati e nelle colture cellulari.
Abstract
L'epidemia mondiale in corso di diabete aumenta la domanda per l'identificazione di fattori ambientali, nutrizionali, endocrini, genetici ed epigenetici che influenzano l'assorbimento del glucosio. La misurazione della fluorescenza intracellulare è un metodo ampiamente utilizzato per testare l'assorbimento di glucosio marcato fluorescentemente (FD-glucosio) nelle cellule in vitro o per l'imaging di tessuti che consumano glucosio in vivo. Questo test valuta l'assorbimento del glucosio in un punto temporale scelto. L'analisi intracellulare presuppone che il metabolismo del glucosio FD sia più lento di quello del glucosio endogeno, che partecipa alle reazioni cataboliche e anaboliche e alla segnalazione. Tuttavia, il metabolismo dinamico del glucosio altera anche i meccanismi di assorbimento, che richiederebbero misurazioni cinetiche dell'assorbimento del glucosio in risposta a diversi fattori. Questo articolo descrive un metodo per misurare l'esaurimento extracellulare di FD-glucosio e convalida la sua correlazione con l'assorbimento intracellulare di FD-glucosio in cellule e tessuti ex vivo. La deplezione extracellulare del glucosio può essere potenzialmente applicabile per studi cinetici e dose-dipendenti ad alto rendimento, nonché per l'identificazione di composti con attività glicemica e dei loro effetti specifici per i tessuti.
Introduction
La domanda di misurazione dell'assorbimento di glucosio aumenta insieme alla necessità critica di affrontare un aumento epidemico di una moltitudine di malattie dipendenti dal metabolismo del glucosio. I meccanismi alla base delle malattie metaboliche degenerative, dei disturbi neurologici e cognitivi1, delle malattie infiammatorie2 e infettive3, del cancro 4,5, così come dell'invecchiamento6, dipendono dal metabolismo del glucosio per l'energia e il suo stoccaggio, i processi anabolici, le proteine e la modificazione genica, la segnalazione, la regolazione dei geni e la sintesi e la replicazione degli acidi nucleici 7,8,9 . Il diabete mellito (DM) è direttamente correlato al malfunzionamento della regolazione dell'assorbimento del glucosio. La DM è uno spettro di malattie croniche come il diabete mellito di tipo 1, -2 e -3, il diabete gestazionale, il diabete ad esordio maturo dei giovani e altri tipi di questa malattia indotti da fattori ambientali e / o genetici. Nel 2016, il primo rapporto globale dell'OMS sul diabete ha dimostrato che il numero di adulti che vivono con il DM più diffuso è quasi quadruplicato dal 1980 a 422 milioni di adulti10, e questo numero di pazienti DM è aumentato esponenzialmente negli ultimi decenni. Solo nel 2019, una stima di 1,5 milioni di morti è stata causata direttamente da10 DM. Questo drammatico aumento è dovuto all'aumento del DM di tipo 2 e alle condizioni che lo guidano, tra cui sovrappeso e obesità10. La pandemia di COVID-19 ha rivelato un aumento di due volte della mortalità nei pazienti con DM rispetto alla popolazione generale, suggerendo il ruolo profondo ma poco compreso del metabolismo del glucosio nella difesa immunitaria3. La prevenzione, la diagnosi precoce e il trattamento del DM, dell'obesità e di altre malattie richiedono l'ottimizzazione delle misurazioni dell'assorbimento del glucosio da parte di diversi tessuti e l'identificazione dei fattori ambientali11, nutrizionali12, endocrini13,genetici 14 ed epigenetici15 che influenzano l'assorbimento del glucosio.
Nella ricerca, l'assorbimento intracellulare e/o tissutale di glucosio è comunemente misurato da glucosio marcato fluorescentemente (FD-glucosio) in vitro 16,17,18 e in vivo19. Fd-glucosio è diventato un metodo preferito rispetto a metodi più precisi che utilizzano glucosio20 marcato radioattivamente, analisi analitica di spettroscopiadi massa 21, metabolomica22, metodi di risonanza magnetica nucleare23 e tomografia ad emissione di positroni / tomografia computerizzata (PET / CT) 5,24. A differenza dell'assorbimento di FD-glucosio, i metodi analitici che richiedono più materiale biologico possono comportare una preparazione del campione in più fasi, strumenti costosi e analisi di dati complessi. Misurazioni efficaci e poco costose dell'assorbimento di glucosio FD in colture cellulari sono state utilizzate in esperimenti proof-of-concept e potrebbero richiedere la convalida con altri metodi.
La base dell'applicazione di FD-glucosio per gli studi sull'assorbimento del glucosio è il ridotto metabolismo del glucosio FD rispetto al glucosio endogeno25. Tuttavia, sia il glucosio endogeno che il glucosio FD sono distribuiti dinamicamente tra tutti i compartimenti cellulari per l'uso nei processi anabolici, catabolici e di segnalazione. La compartimentazione e l'elaborazione dipendente dal tempo25 del glucosio FD interferiscono con le misurazioni di fluorescenza e rappresentano i principali fattori limitanti per l'uso di questo test in esperimenti di screening ad alto rendimento, analisi cinetica, coltura cellulare 3D, co-colture ed esperimenti di espianto tissutale. Qui, forniamo dati che dimostrano un'alta correlazione tra l'esaurimento extracellulare di FD-glucosio e il suo assorbimento intracellulare, suggerendo l'esaurimento extracellulare di FD-glucosio come misura surrogata per l'assorbimento intracellulare di glucosio. La misurazione della deplezione extracellulare del glucosio è stata applicata per convalidare le differenze tessuto-specifiche nell'assorbimento del glucosio nei topi trattati con insulina e un farmaco sperimentale18 per fornire una prova di principio di questo metodo.
L'attuale protocollo descrive le misurazioni intracellulari ed extracellulari (Figura 1) dell'assorbimento di FD-glucosio nelle cellule 3T3-L1. Le sezioni del protocollo 1-7 spiegano la coltura e la crescita delle cellule per 48 ore; fame cellulare, stimolazione e misurazioni extracellulari di base; e misure post-stimolazione di FD-glucosio extracellulare e misurazioni intracellulari di FD-glucosio e proteine. La sezione 8 del protocollo descrive la misurazione ex vivo dell'assorbimento extracellulare di FD-glucosio in tessuti sezionati da topi ob/ob in presenza e assenza di insulina e composto di aminoacidi 2 (AAC2) descritti altrove18.
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Protocol
Gli studi sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Ohio State University (OSU, protocollo 2007A0262-R4).
NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in un armadio di biosicurezza di classe II con il ventilatore acceso e le luci spente.
1. Preparazione dei materiali
NOTA: Tutti i materiali sono elencati nella Tabella dei materiali.
- Preparare il mezzo 1, il mezzo di centrifugazione 2 e le soluzioni di stoccaggio e di lavoro fluorescenti 2-deossi-2-[(7-nitro-2,1,3-benzossadiazol-4-il) ammino]-D-glucosio (2-NBDG o FD-glucosio) secondo la Tabella 1 in un armadio di biosicurezza di Classe II. Proteggi fd-glucosio dalla luce durante l'esperimento spegnendo tutte le luci sotto il cofano.
- Utilizzare reagenti di coltura cellulare pronti all'uso: Tripsina-EDTA, soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e Dulbecco's Modified Eagle Medium senza glucosio e fenolo rosso (di seguito, DMEM senza glucosio).
- Utilizzare 20 mL di tampone di lisi del saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA).
NOTA: Nelle sezioni seguenti, la deplezione extracellulare e l'assorbimento intracellulare di diverse dosi di FD-glucosio sono confrontati nei fibroblasti 3T3-L1 con e senza stimolazione insulinica (Figura 2).
2. Coltura cellulare 3T3-L1 e mantenimento
- Coltura 3T3-L1 fibroblasti di topo placcando 1 x 106 cellule diluite in 20 ml di Medium 1 in due piastre a 96 pozzetti. Piastra 100 μL di sospensione cellulare per pozzetto, assicurando di mantenere l'omogeneità di questa sospensione mediante miscelazione. Coltiva le cellule per 48 ore in un incubatore a 37 °C (5% CO2 e 95% di umidità) senza cambiare i mezzi fino a circa il 70% -80% di confluenza.
- Mantenere le cellule confluenti e a digiuno coltivandole nello stesso mezzo per 48 ore. Variare il tempo di incubazione da 24-72 h a seconda dello stato catabolico di digiuno desiderato.
3. Fame di cellule 3T3-L1
- Decantare i mezzi dalle cellule nelle piastre a 96 pozzetti. Assorbire il fluido rimanente utilizzando asciugamani di carta sterili.
- Risciacquare la piastra da 96 pozzetti con 100 μL di PBS per pozzetto e assorbire il fluido rimanente con carta assorbente sterile.
- Aggiungere 100 μL di DMEM senza glucosio per pozzetto e incubare per 40 minuti. Regola il tempo di incubazione in base al tipo di cellula, agli stimoli e al livello di digiuno desiderato.
NOTA: Il tempo di incubazione può richiedere un'ottimizzazione a seconda della stagione.
4. Preparazione di soluzioni fd-glucosio con diverse concentrazioni
NOTA: L'esperimento in Figura 2 esamina i mezzi extracellulari e intercellulari con e senza stimolazione con insulina.
- Utilizzare otto repliche (una riga in una piastra a 96 pozzetti) per ogni condizione di stimolazione. Pertanto, preparare 1 mL per ogni condizione di stimolazione (specificata nella Tabella 2 e sotto).
- Utilizzare otto condizioni di stimolazione senza insulina: FD-glucosio di 2,5 μg / mL, 1 μg / mL, 0,5 μg / mL, 0,2 μg / mL, 0,1 μg / mL, 0,05 μg / mL e 0 μg / mL (controllo senza FD-glucosio) in una piastra a 96 pozzetti.
- Utilizzare otto condizioni di stimolazione con insulina (10 μg / mL, concentrazione finale): FD-glucosio di 2,5 μg / mL, 1 μg / mL, 0,5 μg / mL, 0,2 μg / mL, 0,1 μg / mL, 0,05 μg / mL e 0 μg / mL (controllo senza FD-glucosio) in un'altra piastra a 96 pozzetti.
- Per preparare le condizioni di stimolazione, diluire 1 μL di soluzione di lavoro FD-glucosio da 5 mg/mL (Tabella 1) in 999 μL di DMEM senza glucosio per ottenere 1 mL di soluzione madre di lavoro (diluizione 1:1000 o 5 μg/mL).
- Utilizzando questa soluzione madre di lavoro, preparare 1:2000, 1:5000, 1:10.000, 1:25.000, 1:50.000 e 1:100.000 diluizioni di FD-glucosio per ottenere 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL e 0,05 μg/mL (Tabella 2) in tubi da 2 mL immediatamente prima degli esperimenti in un armadio di biosicurezza senza luci.
- Ripetere il passaggio 4.4 e aggiungere 1 μL di insulina (10 mg/mL, concentrazione finale) a ciascuna delle condizioni sopra specificate.
NOTA: La concentrazione finale di insulina in questi campioni è di 10 μg/mL = 1,7 nmol/mL. Per ottenere l'omogeneizzazione, aggiungere insulina ai tubi prima di aggiungere altre soluzioni.
5. Trattamento delle cellule 3T3-L1 affamate
- Dopo 40 minuti di incubazione, decantare il DMEM senza glucosio da ciascun pozzetto in piastre da 96 pozzetti e assorbire il fluido rimanente con asciugamani di carta sterili.
- Aggiungere 100 μL (per pozzetto) ciascuno dalle varie condizioni di trattamento sopra descritte ai pozzetti lungo una colonna e 100 μL (per pozzetto) dalla stessa condizione di trattamento ai pozzetti lungo la fila (otto repliche) in entrambe le piastre a 96 pozzetti. Etichettare le piastre che hanno utilizzato le condizioni con e senza insulina. Aggiungere DMEM senza glucosio da solo ai pozzetti di controllo (n = 8).
- Incubare la piastra per 40 minuti in un incubatore di colture cellulari (37 °C, 5% CO2 e 95% di umidità) al buio.
6. Misure extracellulari e intercellulari per cellule stimolate 3T3-L1
- Dopo che le cellule sono state stimolate per 40 minuti, trasferire i mezzi di stimolazione da entrambe le piastre in nuove piastre a 96 pozzetti mantenendo lo stesso layout sperimentale.
- Decantare qualsiasi soluzione rimanente dalle piastre a 96 pozzetti stimolate originali con cellule su asciugamani di carta sterili.
- Opzionalmente, lavare le celle con PBS. Rimuovere PBS e decantare qualsiasi soluzione rimanente su carta assorbente sterile.
- Aggiungere 100 μL del tampone di lisi RIPA a ciascun pozzetto. Facoltativamente, aggiungere l'inibitore della proteasi al tampone RIPA per proteggere le proteine. Posizionare le piastre contenenti RIPA in uno shaker per 30 minuti.
- Utilizzando un lettore di micropiastre (Table of Materials), misurare la fluorescenza a lunghezze d'onda di eccitazione (Ex) ed emissione (Em) di 485 e 535 nm, rispettivamente, prima nel mezzo contenente FD-glucosio extracellulare e poi, la piastra con cellule RIA-lisate alla fine dell'incubazione di 30 minuti (vedere il passaggio 6.4).
7. Normalizzazione basata sulle proteine dell'assorbimento intracellulare del glucosio
NOTA: l'assorbimento intracellulare di FD-glucosio dipende dal numero di cellule. I livelli di proteine nei lisati cellulari sono proporzionali ai numeri cellulari che consentono di normalizzare i livelli intracellulari di FD-glucosio al numero di cellule in ciascun pozzetto.
- Eseguire il test delle proteine BCA secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). Quantificare le concentrazioni proteiche in ciascun pozzo contenente cellule RIPA-lisate.
- Utilizzare 10 μL di omogeneizzato RIPA e misurare le concentrazioni proteiche in triplice copia per aumentare l'accuratezza delle misurazioni in piastre a 96 pozzetti.
- Quantificare le proteine in base agli standard proteici (0, 10, 20, 30, 40, 50 e 60 μg/mL di proteine) analizzate insieme ai campioni su ogni piastra a 96 pozzetti.
- Misurare l'assorbanza a 562 nm e quantificare le concentrazioni proteiche in ciascun campione in base alla formula di regressione lineare ottenuta per lo standard proteico.
- Normalizzare i livelli di FD-glucosio intracellulare utilizzando il valore fluorescente / concentrazione proteica in ciascun pozzetto. L'esaurimento extracellulare fd-glucosio non richiede normalizzazione.
- Facoltativamente, utilizzare i valori basali medi nei campioni di controllo per un'ulteriore normalizzazione (100%).
8. Misurazione ex vivo della deplezione extracellulare di glucosio FD negli organi
- Pretrattare i topi con composti che stimolano il metabolismo del glucosio prima della dissezione dell'organo, come segue.
- Utilizzare topi maschi Lepob di nove settimane (n = 11). Dai da mangiare a tutti i topi con una dieta regolare di chow prima dell'esperimento.
- Assegnare i topi in modo casuale in tre gruppi per iniezioni intraperitoneali (i.p.).
- Iniettare topi dal gruppo lepob di controllo con 0,1 ml di PBS sterile (n = 4).
- Iniettare topi del gruppo insulina Lepob con 0,1 mL di PBS sterile, contenenti 12 UI di insulina umana per grammo di peso corporeo (BW) (n = 3).
- Iniettare topi del gruppo AAC2 Lepob con 0,1 mL di PBS sterile, contenenti 0,1 nmol AAC2 per grammo di peso corporeo (BW) (n = 4).
- Dopo 15 minuti, sottoporre i topi all'inalazione del 5% di isoflurano ed essanguare il sangue mediante puntura cardiaca dagli animali anestetizzati26.
- Sezionare il tessuto adiposo bianco epididico viscerale (200 mg), il fegato (200 mg) e l'intero cervello di ciascun animale. Utilizzare una cappa di biosicurezza di Classe II per la manipolazione dei tessuti.
- Preparare la soluzione di lavoro FD-glucosio (0,29 mM) in DMEM senza glucosio in un armadio di biosicurezza di Classe II senza luce.
- Misurare la fluorescenza della soluzione di lavoro FD-glucosio (0,29 mM) a lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 485 e 535 nm, rispettivamente, utilizzando un lettore di micropiastre.
- Incubare i tessuti/organi prelevati in una piastra a 6 pozzetti contenente PBS per 1 minuto. Maneggiare ogni tessuto o organo in un pozzo separato.
- Dopo 1 minuto, posizionare ogni fazzoletto su un tovagliolo di carta sterile per assorbire PBS. Trasferire tessuti/organi in una piastra separata a 6 pozzetti contenente 4.000 μL di DMEM senza glucosio e incubare per 2 minuti.
- Dopo 2 minuti, rimuovere e trasferire i tessuti in pozzetti di una piastra a 6 pozzetti contenente 0,29 mM di soluzione di lavoro FD-glucosio (1 mL / pozzetto). Incubare le piastre a 6 pozzetti contenenti tessuti in soluzione di lavoro FD-glucosio a 37 °C (5% CO2 e 95% di umidità).
- Raccogliere 100 μL di soluzione di lavoro FD-glucosio da ciascun pozzetto dopo 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 minuti di incubazione, per analizzare la cinetica della deplezione extracellulare di glucosio FD. Agitare prima e dopo la raccolta.
- Trasferire 100 μL di soluzione di lavoro FD-glucosio in piastre a 96 pozzetti per misurare la fluorescenza a lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 485 e 535 nm, rispettivamente, utilizzando un lettore di micropiastre.
- Normalizzare la fluorescenza al valore di 0 min (100%) per ogni organo in ogni animale (Figura 3).
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Representative Results
L'assunzione intracellulare e la deplezione extracellulare di glucosio sono state misurate nei preadipociti 3T3-L1, in risposta a diverse concentrazioni di FD-glucosio (Figura 2) con e senza stimolazione insulinica. La Figura 2A mostra un aumento dose-dipendente dell'assorbimento intracellulare di FD-glucosio, che è stato significativamente aumentato in presenza di insulina. La concomitante diminuzione del fd-glucosio extracellulare nelle stesse cellule è mostrata nella Figura 2B, dove la stimolazione insulinica ha portato a una significativa diminuzione dei livelli extracellulari di FD-glucosio rispetto ai campioni senza stimolazione insulinica. L'assunzione intracellulare di FD-glucosio è correlata con l'esaurimento extracellulare di FD-glucosio in modo dose-dipendente in campioni con e senza insulina (Figura 2C). Pertanto, l'esaurimento extracellulare di FD-glucosio può misurare un cambiamento nell'assorbimento di glucosio con precisione comparabile (R2 = 0,99, P < 0,001) come assorbimento intracellulare di FD-glucosio.
Successivamente, è stato sviluppato un setting sperimentale per convalidare l'applicazione extracellulare di assorbimento di FD-glucosio in studi cinetici che esaminano diversi tessuti dopo stimolazione con induttori canonici e sperimentali di assorbimento del glucosio (Figura 3). Abbiamo selezionato il modello murino Lepob di insulino-resistenza nei tessuti periferici, incluso il tessuto adiposo bianco viscerale27,28. Le risposte ben consolidate all'insulina in questi topi sono state confrontate con gli effetti del nuovo composto AAC2, che agisce su entrambi i tessuti periferici e nervosi attraverso il recettore della leptina e il trasportatore del glucosio GLUT1 meccanismi dipendenti18. I topi Lepob sono stati iniettati con insulina o AAC2. Gli organi sono stati sezionati 15 minuti dopo l'iniezione. Quindi, la cinetica della deplezione extracellulare di FD-glucosio è stata studiata nel grasso viscerale, nel fegato e nel cervello ex vivo (Figura 3). In accordo con l'insulino-resistenza riportata nei tessuti periferici, il glucosio FD extracellulare non è stato impoverito nel grasso viscerale di controllo non stimolato durante 120 minuti di incubazione (Figura 3A). Al contrario, il pretrattamento di topi con insulina o AAC2 prima della dissezione ha portato a un significativo esaurimento del glucosio FD extracellulare entro un intervallo di tempo di 30 minuti e 60 minuti, rispettivamente.
L'assorbimento epatico del glucosio utilizza trasportatori di glucosio, tra cui GLUT2, che è indipendente dalla stimolazione dell'insulina29,30. Di conseguenza, il fd-glucosio extracellulare non è stato inizialmente impoverito negli espianti epatici stimolati dall'insulina rispetto agli espianti epatici non stimolati (Figura 3B), sebbene sia stata osservata una significativa deplezione di FD-glucosio dopo 120 minuti di incubazione nell'espianto epatico stimolato con insulina rispetto ai livelli iniziali (0 min). D'altra parte, il glucosio FD extracellulare è stato significativamente ridotto in modo dipendente dal tempo negli espianti epatici pretrattati con AAC2.
Nel cervello, il trasportatore principale è GLUT1 tra gli altri trasportatori31. La cinetica di deplezione fd-glucosio era sorprendentemente diversa nel cervello rispetto ad altri tessuti (Figura 3C). La significativa deplezione di glucosio è stata osservata nel mezzo extracellulare contenente il cervello non trattato dopo 60 minuti di incubazione (dal 100% a 0 min al 78%). Il mezzo incubato con cervelli di topi Lepob trattati con insulina ha mostrato una moderata ma significativa diminuzione lineare del glucosio FD (dal 100% a 0 min al 95%). I cervelli stimolati da AAC2 portano ad una profonda rapida diminuzione del glucosio FD extracellulare durante i primi 20 minuti (dal 100% a 0 min al 67,4%). Insieme, le misurazioni della deplezione extracellulare del glucosio supportano le differenze precedentemente riportate nell'assorbimento del glucosio in questi tessuti in vivo32.
Figura 1: Principio del metodo di deplezione extracellulare FD-glucosio. Le cellule coltivate in formato a 96 pozzetti sono adatte per questo test. Per sopravvivere, le cellule assorbono glucosio e questo afflusso diminuisce i livelli di glucosio extracellulare. La sostituzione del glucosio con FD-glucosio consente il monitoraggio di questi cambiamenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: L'esaurimento del glucosio FD extracellulare correlato con l'assorbimento intracellulare in vitro. I preadipociti 3T3-L1 sono stati incubati in un mezzo privo di glucosio per 40 minuti prima dell'incubazione con diverse concentrazioni di FD-glucosio con e senza insulina (1,7 mM; incubazione di 40 minuti). (A, B) Assorbimento dose-dipendente di FD-glucosio (A) e deplezione extracellulare fd-glucosio (B) in controllo (cioè senza insulina) (barre tratteggiate) e cellule stimolate dall'insulina (barre nere). L'assorbimento di FD-glucosio è stato normalizzato dalle concentrazioni proteiche. I dati sono mostrati come % del valore misurato nel controllo incubato senza FD-glucosio (SD medio, n = 8 per condizione). Il significato è stato esaminato mediante t-test spaiato. (C) Correlazione tra misure fd-glucosio (%) intracellulare ed extracellulare con (quadrati) o senza (cerchi) insulina negli esperimenti descritti in (A) e (B). Correlazione di Pearson, P < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Cinetica della deplezione extracellulare di FD-glucosio in diversi organi ex vivo. (A-C) I topi Lepob sono stati iniettati con veicolo (PBS, n = 4), insulina (12 UI / kg BW, n = 3) e AAC2 (1 nmol / g BW, n = 3). Dopo 15 minuti, i tessuti sono stati sezionati e isolati. Gli espianti di (A) grasso viscerale, (B) fegato e (C) cervello sono stati incubati in FD-glucosio (0,29 mM). La cinetica della deplezione extracellulare del glucosio è stata misurata in aliquote del mezzo in diversi punti temporali. I dati (SD media) sono mostrati come % di fluorescenza in ciascun organo a 0 minuti di incubazione. Significatività P < 0,05, t-test spaiato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Soluzione/Media | Componenti |
| Etanolo: DMSO (1: 1 / v / v) | Etanolo (200 μL) e DMSO (200 μL) in tubo da 1-1,5 mL; utilizzare etanolo di grado di coltura cellulare e DMSO |
| Medio 1 | DMEM (89 mL), Penicillina/streptomicina (1%) (1 mL) e Siero di Vitello (10%) (10 mL) in tubo sterile da 50 mL |
| Mezzo di centrifugazione 2 | DMEM (89 mL), Penicillina/streptomicina (1%) (1 mL) e Siero bovino (10%) (10 mL) in tubo sterile da 50 mL |
| Soluzione di FD-glucosio da stoccaggio 5 mg/mL (14,5 mM) | FD glucosio (1 mg) ed etanolo:DMSO (1:1/v/v) (200 μL) in tubo da 0,5 mL; conservare a -80 °C, preferibilmente in atmosfera di argon o azoto |
| Soluzione di fd-glucosio funzionante 5 μg/mL (14,5 mM) | Soluzione di glucosio FD di stoccaggio 5 mg/mL (1 μL), DMEM senza glucosio (999 μL); prepararsi immediatamente prima dell'esperimento. |
Tabella 1: Preparazione dei terreni di coltura e delle soluzioni fd-glucosio.
| Diluizione | Controllo | 1:2x103 | 1:5x103 | 1:1x104 | 1:2,5x104 | 1:5x104 | 1:1x105 |
| Concentrazione (μg/mL) | 0 | 2.5 | 1 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 |
| DMEM senza glucosio (μL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FD Glucosio 5 μg/mL (μL) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
Tabella 2: Preparazione di soluzioni di FD-glucosio con diverse concentrazioni per gli esperimenti mostrati nella Figura 2.
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Discussion
Il confronto diretto della deplezione extracellulare di FD-glucosio con l'assorbimento di glucosio intracellulare normalizzato nella coltura cellulare ha mostrato un'alta correlazione, suggerendo che l'esaurimento extracellulare del glucosio potrebbe essere una misura surrogata per la valutazione dell'assorbimento del glucosio. La misurazione del glucosio FD extracellulare può utilizzare una vasta gamma di concentrazioni di glucosio FD, anche 0,5-2,5 μg FD-glucosio / mL sembrano fornire l'intervallo ottimale. Il glucosio FD extracellulare non richiede la normalizzazione del numero cellulare o delle concentrazioni proteiche necessarie per l'assorbimento intracellulare di FD-glucosio. La limitazione prevista delle misurazioni extracellulari fd-glucosio è lo studio degli agenti reattivi che inducono le specie dell'ossigeno e delle tracce di sangue all'interno di espianti che possono spegnere la fluorescenza. Dovrebbero essere considerati anche altri fattori ambientali che influenzano la fluorescenza, come la luce. Il tempo di manipolazione prolungato richiesto durante l'utilizzo di più espianti tissutali può compromettere la vitalità dei tessuti e il metabolismo del glucosio. Questa potrebbe essere un'ulteriore limitazione. I tessuti asportati devono essere in un intervallo di piccole dimensioni (50-300 mg) per consentire la permeabilità del glucosio all'interno del tessuto. La manipolazione simultanea dei tessuti da parte di più operatori può ridurre i tempi di manipolazione. Sebbene non abbiamo misurato l'assorbimento di glucosio all'interno degli espianti tissutali, le osservazioni accumulate negli espianti di tessuto in coltura suggeriscono che sopravvivono nel mezzo contenente glucosio fino a 17 giorni con la progressiva perdita di funzionalità33. In questo protocollo, il breve tempo di incubazione per gli espianti consente di monitorare il metabolismo del glucosio in tessuti relativamente funzionali. Nei tessuti con organizzazione cellulare complessa, come il cervello, la dimensione presenta una limitazione irrisolvibile, perché la disintegrazione del tessuto complesso e la conseguente morte cellulare influenza l'assorbimento del glucosio. Tuttavia, l'incubazione del cervello per 24 ore è stata precedentemente utilizzata per l'identificazione del meccanismo di regolazione endogeno, supportando la relativa funzionalità fisiologica del cervello di topo asportato nel mezzo contenente glucosio34. Indipendentemente da ciò, la procedura semplificata e la facile accessibilità del glucosio FD extracellulare possono consentire l'utilizzo di questo test in un formato ad alto rendimento. Il confronto tra l'esaurimento di glucosio FD extracellulare di base e stimolato dall'insulina suggerisce che questo test potrebbe essere applicato per identificare fattori umorali, nutrizionali, patogeni, ambientali o farmaci che regolano l'assorbimento del glucosio. Sebbene questo test semplifichi la scoperta, i risultati hanno richiesto la convalida con la radioetichettatura quantitativa20 metodi analitici 21,22,23 e/o metodi di imaging 5,24 per una rigorosa delucidazione meccanicistica dei percorsi.
I passaggi critici in questo protocollo includono l'ottimizzazione della confluenza e del tempo di digiuno che influenzano l'assorbimento di FD-glucosio sia basale che stimolato. Questi parametri potrebbero anche essere influenzati dalla stagione in base alle osservazioni degli autori. Inoltre, diversi tipi di cellule utilizzano meccanismi specifici per l'assorbimento del glucosio, compresi diversi trasportatori del glucosio e interazioni regolatorie ormone/recettore 32,35,36. Pertanto, è necessario prendere in considerazione controlli positivi diversi dall'insulina per le colture cellulari che rappresentano tessuti diversi dal tessuto muscolare o adiposo regolati da assi insulina/GLUT4. La risoluzione dei problemi include anche la regolazione della confluenza cellulare e l'ottimizzazione dei tempi per il digiuno / rialimentazione con FD-glucosio. Inoltre, la sensibilità della misurazione extracellulare del glucosio potrebbe essere migliorata riducendo i livelli di FD-glucosio extracellulare, tenendo conto dei livelli di soglia richiesti per l'assorbimento del glucosio. L'esperimento descritto nella Figura 2 può aiutare i ricercatori a personalizzare questo test per l'uso con altre colture cellulari o la risoluzione dei problemi.
La variabilità intrinseca del metabolismo del glucosio richiedeva anche una dimensione del campione più elevata (n = 5-8). Sebbene le misurazioni extracellulari della perdita di GLUCOSIO FD abbiano mostrato la stessa accuratezza dell'assorbimento intracellulare del glucosio FD normalizzato dalla proteina, la normalizzazione può ridurre la variabilità del test. Oltre alla misurazione delle concentrazioni proteiche, la misurazione del contenuto di DNA nella cellula può essere un'altra valutazione surrogata affidabile del numero di cella37.
Il glucosio FD extracellulare è accessibile per le misurazioni cinetiche. Qui, è stata sviluppata una semplice procedura di misurazione cinetica del glucosio FD extracellulare per identificare le risposte organo-specifiche ai mediatori dell'assorbimento del glucosio. Questi studi ex vitro possono testare direttamente la risposta degli organi a vari stimoli in vivo che è combinata con l'esposizione degli organi a FD-glucosio e misurazioni cinetiche ex vivo , come mostrato nella Figura 3. Sebbene gli studi ex vivo non assomiglino completamente alle condizioni in vivo , presentano molteplici vantaggi. Gli espianti d'organo mantengono una complessa struttura cellulare primaria multicellulare, a differenza delle colture cellulari immortali che mostrano un'espressione genica alterata. Lo sviluppo di farmaci moderni utilizza organismi modello, valutazione indiretta dell'assorbimento di glucosio basata sul trascrittoma o sul metaboloma22, tecnica completa del morsetto per insulina38 o imaging costoso32. Sebbene la misurazione del glucosio FD extracellulare negli organi espiantati non sostituirà queste tecnologie, fornirà una rapida valutazione di composti, metaboliti e geni per facilitare la scoperta di nuovi bersagli terapeutici che regolano l'assorbimento del glucosio in modo specifico per i tessuti. Lo sviluppo di terapie sicure che affrontano il metabolismo del glucosio in tessuti specifici può offrire una soluzione per il cancro, la demenza, l'invecchiamento, il diabete, le malattie autoimmuni, l'obesità e altre applicazioni correlate.
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Disclosures
Gli autori non hanno problemi a rivelare e non hanno conflitti di interessi.
Acknowledgments
Il progetto è stato sostenuto da Ralph e Marian Falk Medical Research Catalyst Award e Kathleen Kelly Award. Altri supporti includevano il National Center for Research Resources UL1RR025755 e NCI P30CA16058 (OSUCCC), la roadmap NIH per la ricerca medica. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta le opinioni ufficiali del National Center for Research Resources o del NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-L1 mouse fibroblasts | ATCC | CL-173 | Cell line |
| 96-well plates | Falcon | 353227 | Plastic ware |
| B6.V-Lepob/J male mice | Jackson Laboratory | stock number 000632 | Mice |
| BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | Device |
| Bovine serum | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Cell culture |
| Calf serum | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Cell culture |
| Cell incubator | Forma | Series II Water Jacket | Device |
| Diet (mouse/rat diet, irradiated) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | Reagent |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Cell culture |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagent |
| Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) | Sigma | 72987-1MG | Assay |
| Glucose-free and phenol red-free DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Cell culture |
| Human insulin 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagent |
| Isoflurane, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestaetic |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Cell culture |
| Phosphate buffered solution | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Cell culture |
| Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay | ThermoFisher | Cat N23225 | Assay |
| Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Assay |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Cell culture |
References
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