Genética inversa para diseñar variantes de virus de ARN de sentido positivo

Shalini Soni; Shubhra Agarwal; Rakesh Aggarwal; Naga Suresh Veerapu

doi:10.3791/63685

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Artículo de método

Genética inversa para diseñar variantes de virus de ARN de sentido positivo

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DOI:

10.3791/63685

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9 de junio de 2022

Shalini Soni¹ , Shubhra Agarwal¹ , Rakesh Aggarwal² , Naga Suresh Veerapu¹

¹Virology Section, Department of Life Sciences, Shiv Nadar University, ²Gastroenterology, Sanjay Gandhi Postgraduate Institute of Medical Sciences

En este artículo

Resumen

El protocolo describe un método para introducir una diversidad genética controlable en el genoma del virus de la hepatitis C mediante la combinación de la síntesis de ARN mutante de longitud completa mediante PCR propensa a errores y genética inversa. El método proporciona un modelo para la selección del fenotipo y se puede utilizar para genomas de virus de ARN de sentido positivo de 10 kb de largo.

Resumen

La falta de un método conveniente para la generación iterativa de diversas variantes virales de longitud completa ha impedido el estudio de la evolución dirigida en los virus de ARN. Al integrar una PCR propensa a errores en el genoma de ARN completo y una genética inversa, se puede inducir la mutagénesis de sustitución aleatoria de todo el genoma. Hemos desarrollado un método que utiliza esta técnica para sintetizar diversas bibliotecas con el fin de identificar mutantes virales con fenotipos de interés. Este método, llamado síntesis de ARN mutante de longitud completa (FL-MRS), ofrece las siguientes ventajas: (i) la capacidad de crear una gran biblioteca a través de una PCR altamente eficiente y propensa a errores en un solo paso; (ii) la capacidad de crear grupos de bibliotecas con diferentes niveles de diversidad genética mediante la manipulación de la fidelidad de la ADN polimerasa; iii) la creación de un producto de PCR de longitud completa que pueda servir directamente como molde para la síntesis de ARN mutante; y (iv) la capacidad de crear ARN que se puede entregar a las células huésped como un grupo de entrada no seleccionado para detectar mutantes virales del fenotipo deseado. Hemos encontrado, utilizando un enfoque de genética inversa, que FL-MRS es una herramienta confiable para estudiar la evolución dirigida al virus en todas las etapas del ciclo de vida del virus de la hepatitis C, aislado de JFH1. Esta técnica parece ser una herramienta invaluable para emplear la evolución dirigida para comprender la adaptación, la replicación y el papel de los genes virales en la patogénesis y la resistencia antiviral en los virus de ARN de sentido positivo.

Introducción

El cribado genético directo comienza con un fenotipo viral de interés y luego, a través de la secuenciación de su genoma y su comparación con el de la cepa original, intenta identificar la(s) mutación(es) causante(s) de ese fenotipo. Por el contrario, en los cribados genéticos inversos, se introducen mutaciones aleatorias en un gen diana, seguidas de un examen del fenotipo o fenotipos ^resultantes1. Para el enfoque de genética inversa, la mutagénesis in vitro es la técnica más utilizada para crear un conjunto de variantes que posteriormente se examinan en busca de fenotipos de interés. Se han descrito varias herramientas genéticas para ....