Method Article

Evaluación de la función mitocondrial en el nervio ciático mediante respirometría de alta resolución

DOI:

10.3791/63690

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May 5th, 2022

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1Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro

In This Article

Summary

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La respirometría de alta resolución acoplada a sensores de fluorescencia determina el consumo de oxígeno mitocondrial y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). El presente protocolo describe una técnica para evaluar la frecuencia respiratoria mitocondrial y la producción de ROS en el nervio ciático permeabilizado.

Abstract

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La disfunción mitocondrial en los nervios periféricos acompaña a varias enfermedades asociadas con la neuropatía periférica, que puede desencadenarse por múltiples causas, incluidas enfermedades autoinmunes, diabetes, infecciones, trastornos hereditarios y tumores. La evaluación de la función mitocondrial en los nervios periféricos del ratón puede ser un desafío debido al pequeño tamaño de la muestra, un número limitado de mitocondrias presentes en el tejido y la presencia de una vaina de mielina. La técnica descrita en este trabajo minimiza estos desafíos mediante el uso de un protocolo de permeabilización único adaptado de uno utilizado para las fibras musculares, para evaluar la función mitocondrial del nervio ciático en lugar de aislar las mitocondrias del tejido. Al medir la producción fluorimétrica de especies reactivas con Amplex Red/Peroxidasa y comparar diferentes sustratos e inhibidores mitocondriales en nervios permeabilizados con saponina, fue posible detectar estados respiratorios mitocondriales, especies reactivas de oxígeno (ROS) y la actividad de complejos mitocondriales simultáneamente. Por lo tanto, el método presentado aquí ofrece ventajas en comparación con la evaluación de la función mitocondrial mediante otras técnicas.

Introduction

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Las mitocondrias son esenciales para mantener la viabilidad celular y realizan numerosas funciones celulares, como el metabolismo energético (vías de metabolismo de glucosa, aminoácidos, lípidos y nucleótidos). Como sitio principal de producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), las mitocondrias son centrales en varios procesos de señalización celular como la apoptosis y participan en la síntesis de grupos de hierro-azufre (Fe-S), la importación y maduración de proteínas mitocondriales y el mantenimiento de su genoma y ribosomas 1,2,3. La red de dinámica de membranas mitocondriales está controlada por procesos de fusión y fisión, y también cuentan con maquinaria para el control de calidad y mitofagia 4,5,6.

La disfunción mitocondrial se asocia con la aparición de varias afecciones patológicas como el cáncer, la diabetes y la obesidad7. Se detectan alteraciones en la función mitocondrial en trastornos neurodegenerativos que afectan al sistema nervioso central, como en la enfermedad de Alzheimer 8,9, la enfermedad de Parkinson10,11, la esclerosis lateral amiotrófica12,13 y la enfermedad de Huntington 14,15 . En el sistema nervioso periférico, la pérdida de la función mitocondrial en los axones se observa en neuropatías inmunes, como el síndrome de Guillain-Barré16,17, y en asociación con una alta producción de ROS mitocondriales en axones, estos eventos conducen a la activación de la MAP quinasa en las células de Schwann18. Esto demuestra que la fisiología mitocondrial puede ser esencial no solo para una célula específica del sitio, sino para un tejido completo. En la polineuropatía sensorial distal asociada al VIH (HIV-DSP), las mitocondrias tienen un papel en el mecanismo por el cual la proteína transactivadora de la transcripción (HIV-TAT) permite que el VIH se replique de manera eficiente, así como varias otras funciones en la patogénesis de la infección por VIH19,20.

La evaluación de la fisiología mitocondrial del nervio ciático se ha convertido en un objetivo esencial para la investigación de la neuropatía 7,21,22. En la neuropatía diabética, los análisis proteómicos y metabolómicos sugieren que la mayoría de las alteraciones moleculares en la diabetes afectan a la fosforilación oxidativa mitocondrial del nervio ciático y al metabolismo lipídico7. Estas alteraciones también parecen ser signos tempranos de diabetes inducida por la obesidad21. En un modelo de ratón de neuropatía dolorosa inducida por quimioterapia, el deterioro mitocondrial en el nervio ciático se detecta como una disminución en la fosforilación oxidativa22 y una reducción de las actividades de los complejos mitocondriales, el potencial de membrana y el contenido de ATP23. Sin embargo, aunque varios grupos han citado la disfunción mitocondrial en neuropatías, estos estudios se limitan a las mediciones de la actividad en complejos mitocondriales sin preservación de las membranas mitocondriales, careciendo de evaluación de la integridad mitocondrial o mediciones del contenido de ATP como parámetro para la producción de ATP mitocondrial. En general, una evaluación adecuada del consumo de oxígeno mitocondrial y la producción de ROS requiere el aislamiento de las mitocondrias por centrifugación diferencial en un gradiente percol/sacarosa. El aislamiento de las mitocondrias también puede ser un factor limitante para el tejido nervioso ciático debido a la gran cantidad de tejido necesario y la pérdida e interrupción de las mitocondrias.

El presente estudio tiene como objetivo proporcionar un protocolo para medir la fisiología mitocondrial como el consumo de oxígeno mitocondrial y la producción de ROS en el nervio ciático, preservando las membranas mitocondriales y sin necesidad de aislar las mitocondrias. Este protocolo se adapta a partir de mediciones de consumo de oxígeno en fibras musculares permeabilizadas24 mediante respirometría de alta resolución (HRR). Las ventajas de este procedimiento son la posibilidad de evaluar las mitocondrias en pequeñas cantidades de tejido como el nervio ciático y evaluar los parámetros mitocondriales in situ, preservando así el entorno mitocondrial, la estructura y el perfil bioenergético, para obtener un resultado fisiológicamente confiable. Los estados respiratorios mitocondriales se determinaron con sustratos e inhibidores después de la permeabilización del nervio ciático para evaluar adecuadamente la bioenergética mitocondrial y el coeficiente del citocromo c para la integridad de la membrana mitocondrial, proporcionando una guía para los pasos de la evaluación del sistema de transporte de electrones mitocondrial (ETS) y el cálculo de los parámetros esenciales. Este estudio puede proporcionar herramientas para responder preguntas sobre mecanismos fisiopatológicos en los que está implicado el metabolismo del nervio ciático, como las neuropatías periféricas.

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Protocol

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El presente protocolo está aprobado por el Comité de Ética sobre el Uso de Animales en la Investigación, CCS/UFRJ (CEUA-101/19), y las directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de experimentación. El nervio ciático se aísla de ratones machos C57BL/6 de cuatro meses de edad, sacrificados por luxación cervical según las pautas institucionales. Los pasos del protocolo están optimizados para evitar el deterioro mitocondrial. Por lo tanto, en este protocolo, la calibración de los sensores polarográficos de oxígeno se realizó antes de la disección y permeabilización del tejido nervioso ciático del ratón.

1. Preparación de reactivos

  1. Prepare el tampón de preservación de tejidos (TP Buffer).
    1. Preparar los siguientes reactivos en solución de agua ultrapura: 10 mM de tampón de Ca-EGTA con 0,1 μM de calcio libre, 20 mM de imidazol, 20 mM de taurina, 50 mM de K-MES, 0,5 mM de TDT, 6,56 mM de MgCl2, 5,77 mM de ATP, 15 mM de fosfocreatina (ver Tabla de Materiales), pH 7.1. Conservar a -20°C.
  2. Prepare el Mitochondria Respiration Buffer (MR Buffer).
    1. Preparar los siguientes reactivos en solución de agua ultrapura: 0,5 mM de K2EGTA, 3 mM de MgCl2, 60 mM de MES, 20 mM de taurina, 10 mM de KH2PO4, 20 mM de HEPES, 110 mM de D-sacarosa, 1 mg/mL de BSA (libre de ácidos grasos) (ver Tabla de Materiales), pH 7.4. Conservar a -20 °C.
  3. Prepare la solución madre de saponina disolviendo 5 mg de saponina (ver Tabla de Materiales) en 1 ml de TP Buffer (paso 1.1) y manténgala en hielo. La saponina se prepara fresca.
  4. Preparar Amplex Red resuspendiendo el polvo (ver Tabla de Materiales) con DMSO para obtener una concentración de stock de 2 mM y almacenar a -20 °C en un vial protegido de la luz.
    NOTA: Para evitar el desgaste de la sonda por congelación y descongelación, haga pequeñas alícuotas para almacenamiento de no más de 6 meses25.

2. Calibración de sensores polarográficos de oxígeno para respirometría de alta resolución (HRR)

  1. Limpie las cámaras HRR del instrumento y las jeringas (consulte la Tabla de materiales).
    1. Abra las cámaras HRR, llene con agua destilada hasta la parte superior y revuelva durante 5 min 3x. Repetir con etanol y luego de nuevo con agua. Lave los tapones y las jeringas con agua/etanol/agua 3 veces cada uno.
  2. Aplique los siguientes ajustes de calibración en el software HRR (consulte la Tabla de materiales).
    1. En el control de software HRR, agregue la temperatura experimental (37 ° C), los parámetros para el sensor de oxígeno (ganancia, 2; voltaje de polarización, 800 mV) y para el sensor amperométrico (ganancia, 1000; voltaje de polarización, 100 mV).
  3. Calibrar los sensores de oxígeno.
    1. Pipetear 2,1 ml de tampón MR (paso 1,2) en cada cámara. Cierre con los tapones y extraiga aire hacia la cámara hasta que se forme una burbuja. Revuelva a 37 °C durante 1 h en modo de calibración hasta que el flujo de oxígeno por masa sea estable.
    2. Realizar una calibración de aire de los sensores polarográficos de oxígeno en el software según el protocolo del fabricante24.
      NOTA: El paso de calibración solo se realiza una vez antes de un experimento. Se pueden realizar experimentos adicionales en el mismo medio de respiración y temperatura después de simplemente lavar las cámaras (paso 2.1).

3. Disección y permeabilización del nervio ciático

  1. Retire el nervio ciático siguiendo los pasos a continuación.
    1. Eutanasiar al animal por luxación cervical después de retirarlo de su jaula y sujetarlo suavemente para descansar en el banco.
    2. En el animal sacrificado, haga una incisión con tijeras en la parte baja de la espalda, comenzando cerca de la columna vertebral y avanzando por el muslo hacia el pie. Retire la piel y el músculo unidos al nervio, y luego corte y elimine todo el nervio ciático.
    3. Pesar el tejido inmediatamente y colocarlo en un vial lleno de tampón para la tuberculosis fría (4 °C). Realice los pasos 3.2-3.3 sobre hielo.
      NOTA: El peso del tejido húmedo se utiliza para normalizar el consumo de oxígeno y el flujo de producción de ROS en los siguientes pasos. Si el tejido no se puede pesar inmediatamente, consérvelo en Cold TB Buffer. El procedimiento se realiza en tejido fresco y no debe congelarse para evitar daños mitocondriales.
  2. Para la preparación del tejido, coloque el nervio ciático en una placa de Petri con suficiente TP Buffer para cubrirlo. Sostenga un extremo del nervio con fórceps, y con otro par de fórceps, extraiga los haces nerviosos horizontalmente.
    NOTA: Este procedimiento debe realizarse en menos de 10 minutos para evitar el deterioro del tejido. El tejido estará listo cuando se pueda visualizar como capas de niebla transparentes, opuestas al tejido opaco blanco anterior (Figura 1).
  3. Primero, transfiera el tejido estirado a un plato pequeño que contenga 1 ml de TP Buffer para la permeabilización del tejido. Para iniciar la permeabilización, transfiera el tejido con fórceps a un plato que contenga 1 ml de TP Buffer y 10 μL de saponina (de la solución madre, paso 1.3).
    1. Agite en un agitador de microplacas suavemente durante 30 minutos, luego transfiera el tejido con fórceps a un plato fresco que contenga MR Buffer (1 ml) y agite suavemente durante 10 minutos. Transfiera el tejido con fórceps a una cámara HRR calibrada.

4. Consumo de oxígeno y determinación de la producción de ROS

  1. Llene las cámaras HRR con 2,1 ml de MR Buffer, agregue Amplex Red (paso 1.4) a una concentración final de 5 μM y peroxidasa a 2 U / ml, y agregue el nervio ciático permeabilizado (paso 3).
    1. Conecte los sensores de fluorescencia del instrumento, apague las luces en la sección de control del software y presione Conectar al oxógrafo. En "protocolos de edición" en el software, inserte el peso del tejido medido en el paso 3.1.3.
  2. Vaya a "diseño", elija la opción "flujo específico por unidad de muestra" y seleccione Parcelas para acceder simultáneamente a la lectura del consumo de oxígeno y, si lo desea, a la producción de H2O2 . Espere ~ 10 min.
    NOTA: Este tiempo es necesario para estabilizar el flujo basal del consumo de oxígeno sin sustrato añadido (basal). Antes de nuevas inyecciones, asegúrese de que el flujo de oxígeno esté estabilizado.
  3. Inyectar dos pulsos de H2O2, cada uno a una concentración final de 260 μM, para su posterior calibración en la cámara.
  4. Inyectar 20 μL de succinato (ver Tabla de Materiales), un sustrato del complejo mitocondrial II, para activar el sistema de transporte de electrones mitocondrial.
    NOTA: Se pueden agregar diferentes sustratos mitocondriales en este punto para evaluar la función mitocondrial mediante diferentes complejos. Los resultados representativos con sustratos variables para los complejos mitocondriales I y II se muestran en la Figura 2 y la Figura 3. En este punto, se observa un aumento en el consumo de O2y la producción de H2 O 2, simultáneamente, en la Figura 3.
  5. Añadir 20 μL de difosfato de adenosina (ADP) para activar la síntesis de trifosfato de adenosina (ATP).
    NOTA: ADP estimula la síntesis de ATP y reduce el potencial de membrana. Se espera observar un aumento en el consumo de O2y una disminución en la producción de H2 O2 2 26,27.
  6. En secuencia, agregue 5 μL de citocromo c (ver Tabla de Materiales) como indicador de la integridad de la membrana.
    NOTA: Si el tejido está bien preparado y permeabilizado, el citocromo c no debe aumentar el consumo de oxígeno en más del 15%. Si ocurre, consulte la sección de solución de problemas para obtener recomendaciones.
  7. Valorar con alícuotas de 0,2 μg/ml de oligomicina (ver Tabla de Materiales) hasta que no se observe una nueva disminución en el consumo de O2 .
    NOTA: La oligomicina actúa inhibiendo la síntesis de ATP dando lugar a una disminución en el flujo de O2 y una mejora en la formaciónde H2 O 2 favorecida por el alto potencial de membrana26,27.
  8. Valorar con alícuotas de 0,5 μmol/L de cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP) (ver Tabla de Materiales), el desacoplador mitocondrial, hasta que no sea posible observar más aumento en el consumo de O2 . Para finalizar el experimento, inyecte 2 μl de antimicina A a una concentración final de 5 μM y espere la estabilización del flujo.
    NOTA: Se observa una disminución en la producción de H2O2 debido a la disipación del potencial de membrana después de inyectar FCCP. La antimicina A inhibe el complejo III, impidiendo así el flujo de electrones. Por lo tanto, el consumo de O2 dependiente de las mitocondrias se ve afectado, disminuyendo el flujo de oxígeno por masa y estimulando la fuga de electrones, aumentandolaproducciónde H 2 O2 26,27.
  9. Vaya a la barra de comandos, busque "multisensorial" en el software, haga clic en Control > Guardar archivo y Desconectar.
    NOTA: La adición de otros sustratos e inhibidores se puede realizar de acuerdo con la pregunta en estudio. Un ejemplo se describe en los resultados representativos. La calibración H2O2 se realiza después de terminar el experimento, de acuerdo con el protocolo del fabricante28.
  10. Abra el archivo guardado y seleccione el rastro "Flujo de oxígeno por masa" para obtener los resultados experimentales de consumo de oxígeno. Seleccione manualmente la ventana entre inyecciones pulsando Mayús + Botón izquierdo del ratón.
    1. Vaya a Marcas > Estadísticas para visualizar los resultados de cada inyección de sustrato/inhibidores/protocolo desacoplado. Para la producción de H2O2 , realice el mismo procedimiento con el trazado "Amp-Slope".
      NOTA: Al seleccionar la ventana, evite los artefactos de las inyecciones de volumen eligiendo una ventana donde el oxígeno (o H2O2) sea más estable y constante. Los ejemplos de ventanas seleccionadas están representados por llaves negras en los resultados representativos (Figura 2 y Figura 3).

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Results

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El consumo de oxígeno mitocondrial por el nervio ciático permeabilizado está representado en la Figura 2. La traza roja representa el flujo de O2 por unidad de masa en pmol/s.mg. Después de registrar un consumo basal de oxígeno con sustratos endógenos (respiración de rutina), se inyecta succinato (SUCC) para registrar la respiración impulsada por el complejo II (succinato deshidrogenasa), lo que resulta en un aumento en la tasa de consumo de oxígeno. En secuencia, se agrega una co...

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Discussion

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Varias enfermedades o afecciones que acompañan a las neuropatías tienen la disfunción mitocondrial como factor de riesgo. La evaluación de la función mitocondrial en los nervios periféricos es esencial para dilucidar cómo actúan las mitocondrias en estas condiciones neurodegenerativas. La evaluación de la función mitocondrial es laboriosa debido a la dificultad del método de aislamiento y la escasez de material. Por lo tanto, el desarrollo de técnicas de permeabilización tisular que no requieran el aislamiento de las mit...

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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Este estudio fue financiado por el Instituto Serrapilheira, la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), el Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) y la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Agradecemos al Dr. Antonio Galina Filho, a la Dra. Mónica Montero Lomeli y al Dr. Claudio Masuda por el apoyo con las instalaciones del laboratorio, y a la Dra. Martha Sorenson por los amables y valiosos comentarios para mejorar el artículo.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Adenosina 5' trifosfato sódico sodio hidratoSigma-AldrichA26209
Adenosina 5′-difosfato sodio salSigma-AldrichA2754
Amplex Red ReactivoThermo Fisher scientificA12222Amplex Red se prepara en DMSO de acuerdo con la ficha técnica
del producto Antimicina A (de Streptomyces sp.)Sigma-AldrichA8674
Albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA7030fracción de choque térmico, libre de proteasa, libre de ácidos grasos, esencialmente libre de globulina, pH 7, ≥ 98%
Carbonato de calcioSigma-AldrichC6763
Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP)Sigma-AldrichC2920
Citocromo cSigma-AldrichC7752(de corazón equino; hemoproteína pequeña)
DataLab versión 5.1.1.91OROBOROS INSTRUMENTS, AustriaCopyright (c) 2002 - 13 por el Dr. Erich Gnaiger
Agitador de microplacas orbital digital 120VThermo Fisher scientific88882005
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich43819
EGTA sal sódicaSigma-AldrichE8145
Jeringa HamiltonSigma-Aldrich HAM8007510 uL, 25 uL y 50 uL
HEPESSigma-AldrichH3375
Hidrógeno solución de peróxido 30% p/pMerckH1009
ImidazolSigma-AldrichI2399
L-(−)-Ácido málicoSigma-AldrichM7397
Cloruro de magnesio hexahidratadoSigma-AldrichM2393
MES sal sódicaSigma-AldrichM3885
Pinza de microdisección, curvadaSigma-AldrichF4142
Pinza de microdisección, rectaSigma-AldrichF4017
O2K - Juego de filtros Amplex RojoOROBOROS INSTRUMENTS, Austria44321-01Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR y producción de H2O2 en mitocondrias cerebrales de ratón. Red Mitocondral Physiol 17.17.
O2K - Fluorescencia LED2 - componente del módulo Sensor de fluorescencia verdeOROBOROS INSTRUMENTS, Austria44210-01
OligomicinaSigma-AldrichO4876(de Streptomyces diastatochromogenes; mezcla de oligomicinas A, B y C
OROBOROS Oxygraph-2kOROBOROS INSTRUMENTS, Austriahttp://www.oroboros.at
Palmitoilcarnitina (Palmitoyl-DL-carnitina-HCl)Sigma-AldrichP4509
Peroxidasa de rábano picanteSigma-AldrichP8375
Placas de Petri, poliestirenoMERCKP5606
Hidrato de sal disódica de fosfocreatinaSigma-AldrichP7936
Dihidrógeno fosfato de potasio monobásicoSigma-AldrichPHR1330
Hidróxido de potasioSigma-Aldrich221473
RotenonaSigma-AldrichR8875
SaponinaSigma-AldrichSAE0073
Piruvato de sodioSigma-AldrichP5280
Succinato de sodio dibásico hexahidratadoSigma-AldrichS2378
SacarosaSigma-AldrichS9378
TaurinaSigma-AldrichT0625

References

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