Evaluación de la función mitocondrial en el nervio ciático mediante respirometría de alta resolución

Las mitocondrias son esenciales para mantener la viabilidad celular y realizan numerosas funciones celulares, como el metabolismo energético (vías de metabolismo de glucosa, aminoácidos, lípidos y nucleótidos). Como sitio principal de producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), las mitocondrias son centrales en varios procesos de señalización celular como la apoptosis y participan en la síntesis de grupos de hierro-azufre (Fe-S), la importación y maduración de proteínas mitocondriales y el mantenimiento de su genoma y ribosomas ^1,2,3. La red de dinámica de membranas mitocondriales está controlada por procesos de fusión y fisión, y también cuentan con maquinaria para el control de calidad y mitofagia ^4,5,6.

La disfunción mitocondrial se asocia con la aparición de varias afecciones patológicas como el cáncer, la diabetes y la obesidad⁷. Se detectan alteraciones en la función mitocondrial en trastornos neurodegenerativos que afectan al sistema nervioso central, como en la enfermedad de Alzheimer ^8,9, la enfermedad de Parkinson^10,11, la esclerosis lateral amiotrófica^12,13 y la enfermedad de Huntington ^14,15 . En el sistema nervioso periférico, la pérdida de la función mitocondrial en los axones se observa en neuropatías inmunes, como el síndrome de Guillain-Barré^16,17, y en asociación con una alta producción de ROS mitocondriales en axones, estos eventos conducen a la activación de la MAP quinasa en las células de Schwann¹⁸. Esto demuestra que la fisiología mitocondrial puede ser esencial no solo para una célula específica del sitio, sino para un tejido completo. En la polineuropatía sensorial distal asociada al VIH (HIV-DSP), las mitocondrias tienen un papel en el mecanismo por el cual la proteína transactivadora de la transcripción (HIV-TAT) permite que el VIH se replique de manera eficiente, así como varias otras funciones en la patogénesis de la infección por VIH^19,20.

La evaluación de la fisiología mitocondrial del nervio ciático se ha convertido en un objetivo esencial para la investigación de la neuropatía ^7,21,22. En la neuropatía diabética, los análisis proteómicos y metabolómicos sugieren que la mayoría de las alteraciones moleculares en la diabetes afectan a la fosforilación oxidativa mitocondrial del nervio ciático y al metabolismo lipídico⁷. Estas alteraciones también parecen ser signos tempranos de diabetes inducida por la obesidad²¹. En un modelo de ratón de neuropatía dolorosa inducida por quimioterapia, el deterioro mitocondrial en el nervio ciático se detecta como una disminución en la fosforilación oxidativa²² y una reducción de las actividades de los complejos mitocondriales, el potencial de membrana y el contenido de ATP²³. Sin embargo, aunque varios grupos han citado la disfunción mitocondrial en neuropatías, estos estudios se limitan a las mediciones de la actividad en complejos mitocondriales sin preservación de las membranas mitocondriales, careciendo de evaluación de la integridad mitocondrial o mediciones del contenido de ATP como parámetro para la producción de ATP mitocondrial. En general, una evaluación adecuada del consumo de oxígeno mitocondrial y la producción de ROS requiere el aislamiento de las mitocondrias por centrifugación diferencial en un gradiente percol/sacarosa. El aislamiento de las mitocondrias también puede ser un factor limitante para el tejido nervioso ciático debido a la gran cantidad de tejido necesario y la pérdida e interrupción de las mitocondrias.

El presente estudio tiene como objetivo proporcionar un protocolo para medir la fisiología mitocondrial como el consumo de oxígeno mitocondrial y la producción de ROS en el nervio ciático, preservando las membranas mitocondriales y sin necesidad de aislar las mitocondrias. Este protocolo se adapta a partir de mediciones de consumo de oxígeno en fibras musculares permeabilizadas²⁴ mediante respirometría de alta resolución (HRR). Las ventajas de este procedimiento son la posibilidad de evaluar las mitocondrias en pequeñas cantidades de tejido como el nervio ciático y evaluar los parámetros mitocondriales in situ, preservando así el entorno mitocondrial, la estructura y el perfil bioenergético, para obtener un resultado fisiológicamente confiable. Los estados respiratorios mitocondriales se determinaron con sustratos e inhibidores después de la permeabilización del nervio ciático para evaluar adecuadamente la bioenergética mitocondrial y el coeficiente del citocromo c para la integridad de la membrana mitocondrial, proporcionando una guía para los pasos de la evaluación del sistema de transporte de electrones mitocondrial (ETS) y el cálculo de los parámetros esenciales. Este estudio puede proporcionar herramientas para responder preguntas sobre mecanismos fisiopatológicos en los que está implicado el metabolismo del nervio ciático, como las neuropatías periféricas.

El presente protocolo está aprobado por el Comité de Ética sobre el Uso de Animales en la Investigación, CCS/UFRJ (CEUA-101/19), y las directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de experimentación. El nervio ciático se aísla de ratones machos C57BL/6 de cuatro meses de edad, sacrificados por luxación cervical según las pautas institucionales. Los pasos del protocolo están optimizados para evitar el deterioro mitocondrial. Por lo tanto, en este protocolo, la calibración de los sensores polarográficos de oxígeno se realizó antes de la disección y permeabilización del tejido nervioso ciático del ratón.

1. Preparación de reactivos

1. Prepare el tampón de preservación de tejidos (TP Buffer).
   1. Preparar los siguientes reactivos en solución de agua ultrapura: 10 mM de tampón de Ca-EGTA con 0,1 μM de calcio libre, 20 mM de imidazol, 20 mM de taurina, 50 mM de K-MES, 0,5 mM de TDT, 6,56 mM de MgCl₂, 5,77 mM de ATP, 15 mM de fosfocreatina (ver Tabla de Materiales), pH 7.1. Conservar a -20°C.
2. Prepare el Mitochondria Respiration Buffer (MR Buffer).
   1. Preparar los siguientes reactivos en solución de agua ultrapura: 0,5 mM de K₂EGTA, 3 mM de MgCl₂, 60 mM de MES, 20 mM de taurina, 10 mM de KH₂PO₄, 20 mM de HEPES, 110 mM de D-sacarosa, 1 mg/mL de BSA (libre de ácidos grasos) (ver Tabla de Materiales), pH 7.4. Conservar a -20 °C.
3. Prepare la solución madre de saponina disolviendo 5 mg de saponina (ver Tabla de Materiales) en 1 ml de TP Buffer (paso 1.1) y manténgala en hielo. La saponina se prepara fresca.
4. Preparar Amplex Red resuspendiendo el polvo (ver Tabla de Materiales) con DMSO para obtener una concentración de stock de 2 mM y almacenar a -20 °C en un vial protegido de la luz.
   NOTA: Para evitar el desgaste de la sonda por congelación y descongelación, haga pequeñas alícuotas para almacenamiento de no más de 6 meses²⁵.

2. Calibración de sensores polarográficos de oxígeno para respirometría de alta resolución (HRR)

1. Limpie las cámaras HRR del instrumento y las jeringas (consulte la Tabla de materiales).
   1. Abra las cámaras HRR, llene con agua destilada hasta la parte superior y revuelva durante 5 min 3x. Repetir con etanol y luego de nuevo con agua. Lave los tapones y las jeringas con agua/etanol/agua 3 veces cada uno.
2. Aplique los siguientes ajustes de calibración en el software HRR (consulte la Tabla de materiales).
   1. En el control de software HRR, agregue la temperatura experimental (37 ° C), los parámetros para el sensor de oxígeno (ganancia, 2; voltaje de polarización, 800 mV) y para el sensor amperométrico (ganancia, 1000; voltaje de polarización, 100 mV).
3. Calibrar los sensores de oxígeno.
   1. Pipetear 2,1 ml de tampón MR (paso 1,2) en cada cámara. Cierre con los tapones y extraiga aire hacia la cámara hasta que se forme una burbuja. Revuelva a 37 °C durante 1 h en modo de calibración hasta que el flujo de oxígeno por masa sea estable.
   2. Realizar una calibración de aire de los sensores polarográficos de oxígeno en el software según el protocolo del fabricante²⁴.
      NOTA: El paso de calibración solo se realiza una vez antes de un experimento. Se pueden realizar experimentos adicionales en el mismo medio de respiración y temperatura después de simplemente lavar las cámaras (paso 2.1).

3. Disección y permeabilización del nervio ciático

1. Retire el nervio ciático siguiendo los pasos a continuación.
   1. Eutanasiar al animal por luxación cervical después de retirarlo de su jaula y sujetarlo suavemente para descansar en el banco.
   2. En el animal sacrificado, haga una incisión con tijeras en la parte baja de la espalda, comenzando cerca de la columna vertebral y avanzando por el muslo hacia el pie. Retire la piel y el músculo unidos al nervio, y luego corte y elimine todo el nervio ciático.
   3. Pesar el tejido inmediatamente y colocarlo en un vial lleno de tampón para la tuberculosis fría (4 °C). Realice los pasos 3.2-3.3 sobre hielo.
      NOTA: El peso del tejido húmedo se utiliza para normalizar el consumo de oxígeno y el flujo de producción de ROS en los siguientes pasos. Si el tejido no se puede pesar inmediatamente, consérvelo en Cold TB Buffer. El procedimiento se realiza en tejido fresco y no debe congelarse para evitar daños mitocondriales.
2. Para la preparación del tejido, coloque el nervio ciático en una placa de Petri con suficiente TP Buffer para cubrirlo. Sostenga un extremo del nervio con fórceps, y con otro par de fórceps, extraiga los haces nerviosos horizontalmente.
   NOTA: Este procedimiento debe realizarse en menos de 10 minutos para evitar el deterioro del tejido. El tejido estará listo cuando se pueda visualizar como capas de niebla transparentes, opuestas al tejido opaco blanco anterior (Figura 1).
3. Primero, transfiera el tejido estirado a un plato pequeño que contenga 1 ml de TP Buffer para la permeabilización del tejido. Para iniciar la permeabilización, transfiera el tejido con fórceps a un plato que contenga 1 ml de TP Buffer y 10 μL de saponina (de la solución madre, paso 1.3).
   1. Agite en un agitador de microplacas suavemente durante 30 minutos, luego transfiera el tejido con fórceps a un plato fresco que contenga MR Buffer (1 ml) y agite suavemente durante 10 minutos. Transfiera el tejido con fórceps a una cámara HRR calibrada.

4. Consumo de oxígeno y determinación de la producción de ROS

1. Llene las cámaras HRR con 2,1 ml de MR Buffer, agregue Amplex Red (paso 1.4) a una concentración final de 5 μM y peroxidasa a 2 U / ml, y agregue el nervio ciático permeabilizado (paso 3).
   1. Conecte los sensores de fluorescencia del instrumento, apague las luces en la sección de control del software y presione Conectar al oxógrafo. En "protocolos de edición" en el software, inserte el peso del tejido medido en el paso 3.1.3.
2. Vaya a "diseño", elija la opción "flujo específico por unidad de muestra" y seleccione Parcelas para acceder simultáneamente a la lectura del consumo de oxígeno y, si lo desea, a la producción de H₂O₂ . Espere ~ 10 min.
   NOTA: Este tiempo es necesario para estabilizar el flujo basal del consumo de oxígeno sin sustrato añadido (basal). Antes de nuevas inyecciones, asegúrese de que el flujo de oxígeno esté estabilizado.
3. Inyectar dos pulsos de H₂O₂, cada uno a una concentración final de 260 μM, para su posterior calibración en la cámara.
4. Inyectar 20 μL de succinato (ver Tabla de Materiales), un sustrato del complejo mitocondrial II, para activar el sistema de transporte de electrones mitocondrial.
   NOTA: Se pueden agregar diferentes sustratos mitocondriales en este punto para evaluar la función mitocondrial mediante diferentes complejos. Los resultados representativos con sustratos variables para los complejos mitocondriales I y II se muestran en la Figura 2 y la Figura 3. En este punto, se observa un aumento en el consumo de O₂y la producción de H_{2 O 2}, simultáneamente, en la Figura 3.
5. Añadir 20 μL de difosfato de adenosina (ADP) para activar la síntesis de trifosfato de adenosina (ATP).
   NOTA: ADP estimula la síntesis de ATP y reduce el potencial de membrana. Se espera observar un aumento en el consumo de O₂y una disminución en la producción de H₂ O^{2 2 26,27}.
6. En secuencia, agregue 5 μL de citocromo c (ver Tabla de Materiales) como indicador de la integridad de la membrana.
   NOTA: Si el tejido está bien preparado y permeabilizado, el citocromo c no debe aumentar el consumo de oxígeno en más del 15%. Si ocurre, consulte la sección de solución de problemas para obtener recomendaciones.
7. Valorar con alícuotas de 0,2 μg/ml de oligomicina (ver Tabla de Materiales) hasta que no se observe una nueva disminución en el consumo de O₂ .
   NOTA: La oligomicina actúa inhibiendo la síntesis de ATP dando lugar a una disminución en el flujo de O₂ y una mejora en la formación_{de H2 O 2} favorecida por el alto potencial de membrana^26,27.
8. Valorar con alícuotas de 0,5 μmol/L de cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP) (ver Tabla de Materiales), el desacoplador mitocondrial, hasta que no sea posible observar más aumento en el consumo de O₂ . Para finalizar el experimento, inyecte 2 μl de antimicina A a una concentración final de 5 μM y espere la estabilización del flujo.
   NOTA: Se observa una disminución en la producción de H₂O₂ debido a la disipación del potencial de membrana después de inyectar FCCP. La antimicina A inhibe el complejo III, impidiendo así el flujo de electrones. Por lo tanto, el consumo de O₂ dependiente de las mitocondrias se ve afectado, disminuyendo el flujo de oxígeno por masa y estimulando la fuga de electrones, aumentando_laproducción_{de H 2} O^{2 26,27}.
9. Vaya a la barra de comandos, busque "multisensorial" en el software, haga clic en Control > Guardar archivo y Desconectar.
   NOTA: La adición de otros sustratos e inhibidores se puede realizar de acuerdo con la pregunta en estudio. Un ejemplo se describe en los resultados representativos. La calibración H₂O₂ se realiza después de terminar el experimento, de acuerdo con el protocolo del fabricante²⁸.
10. Abra el archivo guardado y seleccione el rastro "Flujo de oxígeno por masa" para obtener los resultados experimentales de consumo de oxígeno. Seleccione manualmente la ventana entre inyecciones pulsando Mayús + Botón izquierdo del ratón.
    1. Vaya a Marcas > Estadísticas para visualizar los resultados de cada inyección de sustrato/inhibidores/protocolo desacoplado. Para la producción de H₂O₂ , realice el mismo procedimiento con el trazado "Amp-Slope".
       NOTA: Al seleccionar la ventana, evite los artefactos de las inyecciones de volumen eligiendo una ventana donde el oxígeno (o H₂O₂) sea más estable y constante. Los ejemplos de ventanas seleccionadas están representados por llaves negras en los resultados representativos (Figura 2 y Figura 3).

El consumo de oxígeno mitocondrial por el nervio ciático permeabilizado está representado en la Figura 2. La traza roja representa el flujo de O2 por unidad de masa en pmol/s.mg. Después de registrar un consumo basal de oxígeno con sustratos endógenos (respiración de rutina), se inyecta succinato (SUCC) para registrar la respiración impulsada por el complejo II (succinato deshidrogenasa), lo que resulta en un aumento en la tasa de consumo de oxígeno. En secuencia, se agrega una concentración saturante de ADP, activando la ATP sintasa e impulsando la fosforilación oxidativa. Esto resulta en un estado fosforilativo de la respiración mitocondrial. La respiración en estado fosforilativo significa que la ATP sintasa puede producir ATP a partir de ADP + Pi (fosfato inorgánico) utilizando el potencial de membrana formado por el gradiente de protones como una fuerza protón-motriz para generar ATP26. Con la disminución del potencial de membrana promovida por la actividad de la ATP sintasa, el consumo de oxígeno se acelera y se observa un aumento en el flujo de oxígeno. La adición de citocromo c exógeno (CYTC) promovió solo una estimulación mínima de la respiración, certificando la integridad de la membrana externa mitocondrial para esta preparación. La permeabilización de los tejidos puede dañar la integridad de la membrana y la pérdida del citocromo c. El aumento de las tasas de respiración de más del 10%-15% indica mitocondrias dañadas y una preparación inadecuada de los tejidos28,29. En este resultado representativo, hay un aumento del 8,7% en la respiración, lo que indica una buena calidad de la preparación del tejido (Tabla 1). La titulación con oligomicina (OLIGO) debe realizarse con dosis mínimas para evitar alcanzar una concentración de OLIGO que pueda interferir en la evaluación de la capacidad máxima30. La inhibición de la ATP sintasa por OLIGO - o la respiración de estado 4 por oligomicina26 - resultó en una disminución del flujo de consumo de oxígeno. La titulación con FCCP, un reactivo desacoplador mitocondrial, disipa el potencial de la membrana mitocondrial, estimulando el flujo respiratorio y mostrando la capacidad máxima para la transferencia de electrones (capacidad máxima ETS). Al final del experimento, se inyecta antimicina A (AA), un inhibidor del complejo III, para inhibir la respiración mitocondrial y registrar el consumo de oxígeno no mitocondrial (respiración residual) (Figura 2). Los flujos absolutos de oxígeno registrados en este experimento representativo se calculan en la Tabla 1.

La posibilidad de analizar el consumo de oxígeno mitocondrial simultáneamente con la producción reactiva de oxígeno (ROS) -determinada mediante la detección de peróxido de hidrógeno (H2O2) por Amplex Red con sensores de fluorescencia- es una gran ventaja para determinar un perfil bioenergético y una herramienta estándar para la detección de disfunción mitocondrial en diversas patologías. La adición de diferentes sustratos para diferentes complejos para alimentar el ETS mitocondrial también puede proporcionar más información sobre los sitios específicos para la disfunción mitocondrial. La Figura 3 se muestra con la medición simultánea del consumo de oxígeno (Figura 3A) y la producción de ROS (Figura 3B) en presencia de diferentes sustratos que proporcionan combustible para el ETS. Después de registrar la respiración basal, se agrega piruvato + malato (PM) a la cámara como sustrato para el complejo mitocondrial I, aumentando el flujo del consumo de oxígeno. La adición de SUCC, el sustrato del complejo II, también aumenta la respiración, pero la adición adicional de palmitoil-carnitina (PC) no aumenta el flujo de oxígeno en comparación con las adiciones de sustrato anteriores, lo que sugiere que PM y SUCC ya pueden haber saturado el sitio mitocondrial de ubiquinona o una falta de oxidación de ácidos grasos. Como era de esperar, la producción de ROS también aumenta después de la adición de sustratos, lo que representa la fuga de oxígeno que escapa de ETS y forma ROS (Figura 3B, traza verde). La adición de ADP en la concentración de saturación aumenta el consumo de oxígeno, impulsando la formación de ATP (traza roja en la Figura 3A) y disminuyendo la producción de ROS (Figura 3B, traza verde). La adición de CYTC solo aumenta el flujo de oxígeno en un 6,8%, confirmando la integridad de la membrana mitocondrial. La titulación con OLIGO disminuye el flujo de consumo de oxígeno (traza roja en la Figura 3A) y aumenta la producción de ROS (traza verde en la Figura 3B). Los efectos ADP y OLIGO sugieren que el nervio ciático permeabilizado en este protocolo puede replicar la relación estándar en la fisiología mitocondrial, en la que un aumento en el consumo de oxígeno conduce a una disminución en el potencial de membrana e impide la producción de ROS31,32.

La adición de FCCP, como se espera para un desacoplador, aumenta el consumo de oxígeno a su velocidad máxima y, como resultado de la disipación del potencial de membrana, la producción de ROS disminuye. La adición de rotenona, un inhibidor de los complejos I y AA, reduce el consumo de oxígeno y aumenta la formación de ROS (Figura 3A, B), confirmando que se conservan la fisiología mitocondrial y el perfil bioenergético en el nervio ciático permeabilizado. Los valores absolutos para los flujos de oxígeno registrados en este experimento se calculan en la Tabla 2.

Figura 1: Preparación del nervio ciático para la permeabilización de las mitocondrias. Todos los procedimientos deben realizarse sobre hielo. (A) El nervio ciático se extrae de un ratón sacrificado y se coloca en una placa de Petri que contiene tampón de preservación de tejidos a 4 ° C. (B) Separación de los haces de nervios ciáticos con fórceps. (C,D) El tejido está listo cuando se disecciona en mechones translúcidos, en lugar de la estructura tubular opaca blanca (A) original. Barra de escala = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Resultado representativo del consumo de oxígeno mitocondrial en el nervio ciático permeabilizado del ratón. El experimento es un rastro representativo de un extracto de nervio ciático de un ratón sacrificado. El nervio ciático se permeabilizó antes, como se describe en la sección de protocolo. Las inyecciones están indicadas como flechas en momentos específicos. SUCC: succinato; ADP: difosfato de adenosina; Cyt c: citocromo c; OLIGO: oligomicina; FCCP: cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona; AA: antimicina A. Se muestra la concentración de oxígeno en tiempo real como [nmol/mL] (traza azul) y la tasa de consumo de oxígeno como flujo por unidad de masa [pmol/(s.mg)] (traza roja). Los brackets negros representan ventanas de las tasas de consumo de oxígeno seleccionadas para los resultados después de cada inyección. Basal se refiere a la respiración sin sustratos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: El resultado del consumo de oxígeno mitocondrial acoplado a la producción de ROS en el nervio ciático de ratón permeabilizado. Se muestra un rastro representativo de un extracto de nervio ciático de un ratón sacrificado. El nervio ciático se permeabilizó antes, como se describe en la sección de protocolo. Las inyecciones están indicadas como flechas en momentos específicos. H2O2: peróxido de hidrógeno; PM: piruvato/malato; SUCC: succinato; PC: palmitoil-carnitina; ADP: difosfato de adenosina; Cyt c: citocromo c; OLIGO: oligomicina; FCCP: cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona; ROT: rotenona; AA: antimicina A. (A) Se muestra la concentración de oxígeno en tiempo real como [nmol/mL] (traza azul) y la tasa de consumo de oxígeno como flujo por unidad de masa [O2 pmol/(s.mg)] (traza roja). (B) La producción de ROS se demuestra como fluorescencia H2O2 (traza púrpura) y pendiente de producción H2O2 [pmol/(s.mg)] (traza verde), después de la calibración. Los brackets negros representan ventanas de las tasas de consumo de oxígeno seleccionadas para los resultados después de cada inyección. Basal se refiere a la respiración sin sustratos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Protocolo sustratos/desacoplador/inhibidores/titulación (SUIT) y resultados de las tasas de consumo de oxígeno en el nervio ciático permeabilizado de ratón. El consumo de oxígeno se representa en [O2pmol/(s.mg)], después de cada adición del protocolo SUIT. Los resultados se obtienen por el promedio de ventanas seleccionadas marcado en la Figura 2.

Tabla 2: Protocolo sustratos/desacoplador/inhibidores/titulación (SUIT) y resultados de la producción de ROS acoplado a las tasas de consumo de oxígeno del nervio ciático permeabilizado del ratón. El consumo de oxígeno está representado en [O2 pmol/(s.mg)] y la producción de ROS por [H2O2 pmol/(s.mg)] después de cada adición del protocolo SUIT. Los resultados se obtienen por el promedio de ventanas seleccionadas marcado en la Figura 3.

Tabla 3: Cálculo de parámetros para la evaluación de la función mitocondrial en nervio ciático permeabilizado de ratón. Parámetros para la fórmula de evaluación de la fisiología mitocondrial por tasas de consumo de oxígeno.

Los autores no tienen nada que revelar.