Evaluación de la función mitocondrial en el nervio ciático mediante respirometría de alta resolución

Summary

La respirometría de alta resolución acoplada a sensores de fluorescencia determina el consumo de oxígeno mitocondrial y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). El presente protocolo describe una técnica para evaluar la frecuencia respiratoria mitocondrial y la producción de ROS en el nervio ciático permeabilizado.

Abstract

La disfunción mitocondrial en los nervios periféricos acompaña a varias enfermedades asociadas con la neuropatía periférica, que puede desencadenarse por múltiples causas, incluidas enfermedades autoinmunes, diabetes, infecciones, trastornos hereditarios y tumores. La evaluación de la función mitocondrial en los nervios periféricos del ratón puede ser un desafío debido al pequeño tamaño de la muestra, un número limitado de mitocondrias presentes en el tejido y la presencia de una vaina de mielina. La técnica descrita en este trabajo minimiza estos desafíos mediante el uso de un protocolo de permeabilización único adaptado de uno utilizado para las fibras musculares, para evaluar la función mitocondrial del nervio ciático en lugar de aislar las mitocondrias del tejido. Al medir la producción fluorimétrica de especies reactivas con Amplex Red/Peroxidasa y comparar diferentes sustratos e inhibidores mitocondriales en nervios permeabilizados con saponina, fue posible detectar estados respiratorios mitocondriales, especies reactivas de oxígeno (ROS) y la actividad de complejos mitocondriales simultáneamente. Por lo tanto, el método presentado aquí ofrece ventajas en comparación con la evaluación de la función mitocondrial mediante otras técnicas.

Introduction

Las mitocondrias son esenciales para mantener la viabilidad celular y realizan numerosas funciones celulares, como el metabolismo energético (vías de metabolismo de glucosa, aminoácidos, lípidos y nucleótidos). Como sitio principal de producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), las mitocondrias son centrales en varios procesos de señalización celular como la apoptosis y participan en la síntesis de grupos de hierro-azufre (Fe-S), la importación y maduración de proteínas mitocondriales y el mantenimiento de su genoma y ribosomas ^1,2,3. La red de dinámica de membranas mi....

Protocol

El presente protocolo está aprobado por el Comité de Ética sobre el Uso de Animales en la Investigación, CCS/UFRJ (CEUA-101/19), y las directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de experimentación. El nervio ciático se aísla de ratones machos C57BL/6 de cuatro meses de edad, sacrificados por luxación cervical según las pautas institucionales. Los pasos del protocolo están optimizados para evitar el deterioro mitocondrial. Por lo tanto, en este protocolo, la calibración de los sensores polarográficos de oxígeno se realizó antes de la disección y permeabilización del tejido nervioso ciático del ratón.

Results

El consumo de oxígeno mitocondrial por el nervio ciático permeabilizado está representado en la Figura 2. La traza roja representa el flujo de O₂ por unidad de masa en pmol/s.mg. Después de registrar un consumo basal de oxígeno con sustratos endógenos (respiración de rutina), se inyecta succinato (SUCC) para registrar la respiración impulsada por el complejo II (succinato deshidrogenasa), lo que resulta en un aumento en la tasa de consumo de oxígeno. En secuencia, se agrega una co.......

Discussion

Varias enfermedades o afecciones que acompañan a las neuropatías tienen la disfunción mitocondrial como factor de riesgo. La evaluación de la función mitocondrial en los nervios periféricos es esencial para dilucidar cómo actúan las mitocondrias en estas condiciones neurodegenerativas. La evaluación de la función mitocondrial es laboriosa debido a la dificultad del método de aislamiento y la escasez de material. Por lo tanto, el desarrollo de técnicas de permeabilización tisular que no requieran el aislamiento de las mit.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosina 5' trifosfato sódico sodio hidrato	Sigma-Aldrich	A26209
Adenosina 5′-difosfato sodio sal	Sigma-Aldrich	A2754
Amplex Red Reactivo	Thermo Fisher scientific	A12222	Amplex Red se prepara en DMSO de acuerdo con la ficha técnica
del producto Antimicina A (de Streptomyces sp.)	Sigma-Aldrich	A8674
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A7030	fracción de choque térmico, libre de proteasa, libre de ácidos grasos, esencialmente libre de globulina, pH 7, ≥ 98%
Carbonato de calcio	Sigma-Aldrich	C6763
Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Citocromo c	Sigma-Aldrich	C7752	(de corazón equino; hemoproteína pequeña)
DataLab versión 5.1.1.91	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria		Copyright (c) 2002 - 13 por el Dr. Erich Gnaiger
Agitador de microplacas orbital digital 120V	Thermo Fisher scientific	88882005
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
EGTA sal sódica	Sigma-Aldrich	E8145
Jeringa Hamilton	Sigma-Aldrich HAM80075		10 uL, 25 uL y 50 uL
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hidrógeno solución de peróxido 30% p/p	Merck	H1009
Imidazol	Sigma-Aldrich	I2399
L-(−)-Ácido málico	Sigma-Aldrich	M7397
Cloruro de magnesio hexahidratado	Sigma-Aldrich	M2393
MES sal sódica	Sigma-Aldrich	M3885
Pinza de microdisección, curvada	Sigma-Aldrich	F4142
Pinza de microdisección, recta	Sigma-Aldrich	F4017
O2K - Juego de filtros Amplex Rojo	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	44321-01	Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR y producción de H2O2 en mitocondrias cerebrales de ratón. Red Mitocondral Physiol 17.17.
O2K - Fluorescencia LED2 - componente del módulo Sensor de fluorescencia verde	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	44210-01
Oligomicina	Sigma-Aldrich	O4876	(de Streptomyces diastatochromogenes; mezcla de oligomicinas A, B y C
OROBOROS Oxygraph-2k	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	http://www.oroboros.at
Palmitoilcarnitina (Palmitoyl-DL-carnitina-HCl)	Sigma-Aldrich	P4509
Peroxidasa de rábano picante	Sigma-Aldrich	P8375
Placas de Petri, poliestireno	MERCK	P5606
Hidrato de sal disódica de fosfocreatina	Sigma-Aldrich	P7936
Dihidrógeno fosfato de potasio monobásico	Sigma-Aldrich	PHR1330
Hidróxido de potasio	Sigma-Aldrich	221473
Rotenona	Sigma-Aldrich	R8875
Saponina	Sigma-Aldrich	SAE0073
Piruvato de sodio	Sigma-Aldrich	P5280
Succinato de sodio dibásico hexahidratado	Sigma-Aldrich	S2378
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S9378
Taurina	Sigma-Aldrich	T0625