Metodología para probar agentes de control e insecticidas contra el barrenador de la baya del café Hypothenemus hampei

El barrenador de la baya del café (CBB), Hypothenemus hampei, se detectó por primera vez en 1988 en Colombia y desde entonces se ha convertido en la especie de plaga más importante del cultivo de café. Las hembras CBB dejan el fruto natal ya fertilizado, buscando nuevos frutos guiados por los químicos volátiles que emiten ^1,2. Un ciclo completo se cumple dentro de los 23 días³ a una temperatura de 25 °C. El ciclo comienza con la hembra fundadora penetrando la semilla y poniendo huevos en el endospermo de la fruta. Las larvas eclosed comen la semilla. Si los frutos se diseccionan en este punto, sería posible observar tanto a la hembra fundadora como a su descendencia. Después de 14 días, las larvas se convierten en pupas, generalmente, la etapa de pupas dura 5 días. En la etapa adulta, las hembras copulan con sus hermanos, y las hembras recién fertilizadas vuelan lejos de las frutas dañadas en busca de nuevas frutas de café para comenzar un nuevo ciclo⁴.

Tanto el proceso de penetración como el resultado de la alimentación larvaria dañan la semilla de café, disminuyendo la calidad de la bebida de café y reduciendo significativamente los ingresos; la infestación superior al 5% en las plantaciones de café generalmente se considera el umbral económico.

El control de CBB se basa en una estrategia de manejo integrado de plagas (MIP), que incluye el control cultural y las prácticas agronómicas, los agentes biológicos naturales y el uso de insecticidas químicos, lo que requiere condiciones de seguridad y aplicación oportuna⁴.

Para evaluar nuevos insecticidas para el control del CBB, se necesitan metodologías de bajo costo que permitan obtener resultados rápidos. Actualmente se utilizan tanto procedimientos de laboratorio como de campo, incluidas dietas artificiales que contienen café en las que se incorporan los insecticidas ^5,6, o rociar los insecticidas sobre café pergamino seco ^7,8,9. Además, se han reportado experimentos realizados en campo utilizando ramas de cafeto cubiertas con mangas entomológicas^10,11; sin embargo, estos métodos requieren un trabajo de parto intenso y largos períodos de evaluación.

Una condición que se asemeja a las condiciones naturales del campo, que también es rápida y económica, es el uso de frutas de café verde o maduras. No obstante, estos frutos deben mantenerse en condiciones adecuadas para el desarrollo del CBB, evitando alteraciones y contaminantes por microorganismos para mantener su calidad y propiedades. Para ello, se han utilizado diferentes desinfectantes, así como procedimientos de calor y radiación 7,9,12,13,14,15,16.

Además, los métodos para la evaluación de insecticidas contra el CBB requieren simulaciones de hembras adultas volando en busca de frutos o penetrando en esos frutos^17,18. Para ello, se han realizado infestaciones artificiales de frutos en el campo ^8,11,19, aunque este proceso es laborioso y depende de las condiciones ambientales.

Aquí, describimos una metodología estandarizada para la evaluación de productos que pueden tener diferentes efectos en el CBB bajo condiciones ambientales controladas que se asemejan a las condiciones del campo.

NOTA: Este protocolo aborda diferentes métodos para identificar diferentes efectos sobre el CBB en condiciones de laboratorio.

1. Recolección de frutas

1. Elija GF con una edad de desarrollo de ~ 120-150 días después de la floración de los árboles en una plantación de café temprano en la mañana.

2. Desinfección de frutas²⁰

1. Lleve alrededor de 300 GFs al laboratorio. Seleccione GFs de tamaño uniforme y sanos y retire los pedúnculos.
2. Sumerja los GF en una solución de jabón (2 ml de jabón líquido para lavar platos en 998 ml de agua del grifo), seguido de frotar para lavar los GF. Luego, enjuague las frutas con agua, cambiando el agua tres veces.
3. Sumerja los GF en una solución de hipoclorito de sodio al 0,5% (100 ml en 900 ml de agua del grifo) y revuelva en un agitador a 110 rpm durante 15 min. Luego, enjuague los GF con agua revolviendo en una coctelera y cambiando el agua tres veces, cada 10 minutos.
4. Seque los GF con toallas de papel estériles.
5. Coloque los GF en bandejas (33 cm x 25 cm x 2 cm) e irradie durante 15 minutos, colocando los GF a una distancia de 55 cm de la fuente UV dentro de una estación de flujo laminar horizontal habilitada para UV.
6. Durante el período de 15 minutos, cada 5 minutos, mueva los GF para garantizar la irradiación de la fruta entera.

3. Desinfección de insectos²¹

1. Use insectos CBB recién surgidos (el mismo día) para configurar los bioensayos.
2. Sumergir los CBB en una solución de hipoclorito de sodio al 0,5%, agitándolos lentamente con un cepillo durante 10 min.
3. Filtre los CBB a través de un paño de muselina y lávelos tres veces con agua destilada estéril.
4. Retire el exceso de agua con toallas de papel estériles.

4. Evaluación de un producto con efecto protector sobre los frutos (preinfestación) (Figura 1)

1. Utilice un grupo de GF por unidad experimental. Generalmente, se utiliza un grupo de 30 GFs por unidad experimental.
2. Coloque los GF en cajas de plástico (unidad experimental).
3. Aplicar el producto de ensayo en las diferentes concentraciones para su evaluación. Realice la aplicación con una unidad pulverizadora portátil. Aquí se probó una emulsión alcaloide al 5% y al 6%.
4. Como control, rocíe un grupo de GF con agua.
5. Utilice al menos tres repeticiones (unidad experimental) por tratamiento, rociando una tras otra.
6. En una campana estéril, libere dos adultos CBB por GF (se introducen un total de 60 CBB en las cajas de plástico). Después de 30 min, cubra las cajas.
7. Deje las cajas de plástico con los GF infestados en una habitación o incubadora en condiciones controladas (oscuro, 25 ± 2 ° C y humedad relativa 71% ± 5%).
8. Después de 1, 7, 15 y 21 días, cuente el número de frutos de barrenador e insectos vivos y muertos fuera de las frutas en cada caja.
9. A los 20 días después de la infestación, diseccionar cada GF bajo un estereomicroscopio, con aumento 10x.
10. Cuente el número de semillas sanas o semillas dañadas por los insectos en cada fruta.
11. Contar las diferentes etapas biológicas de CBB^{observadas 22} y contar el número de insectos muertos en cada semilla para determinar la mortalidad de insectos por unidad experimental.

5. Evaluación del efecto de un producto después de la infestación por CBB (postinfestación) (Figura 3)

1. Utilizar grupos de 200 frutas por tratamiento.
2. En la capucha estéril, libere a los adultos CBB (proporción 2: 1 de adultos CBB a GF) a los GF previamente desinfectados, permitiendo que la infestación proceda durante 3 h a 21 ° C.
3. Examine los GF. Después de 3 h, la mayoría debe estar infestada, con el abdomen de los CBB aún expuesto (posición A²⁰), como se muestra en la Figura 2.
4. Seleccione 46 GF infestados (posición A) y colóquelos en bastidores de plástico de 96 pocillos (unidad experimental). Los frutos deben permanecer en esta posición para que el tratamiento pueda ser rociado directamente sobre el CBB perforando el fruto.
5. Rocíe al menos tres veces (tres bastidores) por tratamiento, uno tras otro, cubriendo los bastidores después de 30 min.
6. Deje los bastidores con los GF infestados en una habitación o incubadora en condiciones controladas (oscuro, 25 ± 2 ° C y humedad relativa 71% ± 5%).
7. Después de 20 días, diseccione los GF bajo un estereomicroscopio a un aumento de 10x.
8. Cuente el número de semillas sanas o semillas dañadas por los insectos en cada fruta.
9. Cuente las diferentes etapas biológicas de CBB²² y el número de insectos muertos en cada semilla para determinar la mortalidad de insectos por unidad experimental.

6. Evaluación de un producto con un efecto disuasorio sobre el CBB

1. Siga los pasos 4.1-4.6 descritos para evaluar un producto con un efecto protector sobre las frutas.
2. Después de liberar a los adultos CBB en las cajas de plástico, cuente el número de CBB que vuelan lejos de las cajas y el número que infesta los GFs. A continuación, siga los pasos 4.7 a 4.11.
3. Siga los pasos 5.1-5.5 descritos para evaluar el producto después de la infestación de CBB.
4. Después de rociar cada tratamiento en los insectos en la posición A, cuente el número de CBB que salieron del GF y / o volaron lejos del GF. A continuación, siga los pasos 5.6-5.9.

7. Análisis estadístico

NOTA: Las variables de respuesta son los porcentajes de mortalidad a lo largo del tiempo y el porcentaje de semillas de café sanas no infestadas.

1. Estimar el promedio y la desviación estándar de cada variable de respuesta para cada tratamiento.
2. Realizar análisis de varianza para cada variable de respuesta con un modelo para un diseño completamente aleatorizado.
   NOTA: La prueba de comparación del 5% de Dunnett se realiza para comparar los tratamientos con el control absoluto (control del agua).
3. Cuando los tratamientos son significativamente diferentes del control absoluto, use una prueba de diferencia menos significativa (LSD) del 5% para comparar los tratamientos.
4. Evaluar el poder de la prueba; si es superior al 85%, se cumplen los supuestos de normalidad y homogeneidad de las varianzas.

Figura 1: Procedimiento para la evaluación de los efectos preinfestantes de los insecticidas en el CBB. Pasos para evaluar los efectos previos a la infestación de los insecticidas sobre Hypothenemus hampei (CBB) utilizando frutos verdes (GFs). (A) Selección de frutas. (B) Pulverización de los insecticidas sobre las frutas del café. (C) Infestación de CBB de frutas de café en una proporción de 2: 1 CBB por GF. D) Frutos infestados. E) Incubación de los frutos en condiciones controladas. F) Disección de frutas. (G) Contar la población de CBB dentro de las semillas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Procesar la infestación de CBB de las frutas de café. Las frutas infestadas contienen adultos CBB con el abdomen parcialmente expuesto (posición A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Procedimiento para la evaluación de los efectos de posinfestación de los insecticidas sobre el CBB. Pasos para evaluar los efectos postinfestación de los insecticidas en el CBB utilizando GFs. (A) Selección de frutas. (B) Infestación de los frutos con CBB en una proporción de 2:1 CBB por GF. (C) Selección de frutas infestadas. (D) Pulverización del insecticida sobre los frutos. (E) Incubación de los frutos. F) Disección de frutas. G) Contabilización de la población CBB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los resultados mostraron que las hembras CBB reconocieron los frutos, y dependiendo de las características de la superficie del fruto y los olores emitidos, las hembras CBB comenzaron a penetrar o dar a luz los frutos dentro de las 3 h a 21 ° C.

El efecto de un insecticida sobre el CBB cuando se aplica a los frutos del café (procedimiento de preinfestación) después de 24 h y con el tiempo se muestra en la Figura 4. Los dos insecticidas (emulsión alcaloide al 5% y 6%) causaron una alta mortalidad de insectos en el día 20 (Tabla 1) y mostraron diferencias significativas en comparación con el control absoluto del agua (P < 0,001), según la prueba de LSD. En cuanto a los porcentajes de semillas sanas no infestadas (Tabla 1), también hubo diferencias entre los grupos de control y los de insecticidas según la prueba de Dunnett en 5% (P < 0,001). En el grupo de control, el 37% de las semillas no estaban infestadas, mientras que la aplicación de insecticidas protegía las semillas, con el 94% de las semillas permaneciendo sanas cuando se usaba insecticida 2 y el 89% con insecticida 1.

Figura 4: Efectos previos a la infestación de insecticidas en el control frente a dos grupos de insecticidas. Efectos previos a la infestación de los insecticidas. Porcentajede mortalidad de H. hampei adulto evaluado en los días 1, 7, 15 y 21 después de la infestación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Efecto del tratamiento previo a la infestación sobre el CBB. Porcentaje de mortalidad y porcentaje de semillas saludables después de 20 días. * Para cada variable, las diferencias con respecto al control (agua) según la prueba de Dunnett al 5%.

Los resultados previos a la infestación después de 21 días se muestran en la Tabla 1, y los resultados a lo largo del tiempo corresponden a la Figura 4. En este caso, las frutas del café fueron cubiertas con una sustancia tóxica que causa mortalidad por insectos. Los insectos se impregnan cuando caminan sobre las frutas, prueban las frutas con sus palpos o comienzan a masticar la epidermis de las frutas. Además, las sustancias aplicadas sobre la superficie de la fruta pueden alterar o cambiar el olor natural de la fruta, por lo que los individuos CBB pueden detener el proceso de infestación, ya sea volando o prefiriendo separarse de la fruta sin tocarla o infestarla. Dependiendo del tiempo de acción del producto, la mortalidad de insectos o evitar el comportamiento de infestación puede persistir durante 24 horas o más.

Por otro lado, si los productos se aplican después de que los insectos comienzan a dar los frutos (postinfestación), los productos pueden penetrar en la cutícula del insecto, causando la mortalidad de insectos (Tabla 2 y Figura 5). La mayor mortalidad ocurrió con insecticida 2 (P < 0,01). Si la mortalidad ocurre rápidamente, el insecto morirá antes de que entre en la semilla, y no se encontrarán huevos o población de insectos dentro de las semillas.

Figura 5: Efectos postinfestación de los insecticidas. Porcentaje de mortalidad de H. hampei adulto evaluado en los días 1, 7, 15 y 21 después de la infestación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 2: Efectos del tratamiento postinfestación sobre el CBB. Porcentaje de mortalidad y porcentaje de semillas sanas después de 20 días. * Para cada variable, las diferencias con respecto al control (agua) según la prueba de Dunnett al 5%. Para cada variable, diferentes letras indican diferencias según el LSD 5%.

Los efectos de los insecticidas se reflejan como el porcentaje de semillas sanas no infestadas en el día 20 de evaluación (Tabla 2). Debido a la alta mortalidad de insectos, el insecto no penetró en las semillas de café y las dañó. La aplicación de los productos protegió entre el 79%-90% de las semillas de café, mostrando diferencias con respecto al control, en el que se encontró que el 57% de las semillas estaban sanas (P < 0,01). También se observaron diferencias significativas entre los dos insecticidas (P < 0,01).

En algunos casos, los insectos murieron muy rápidamente, incluso antes de causar daños a la semilla. Sin embargo, si la muerte del insecto tomó más tiempo, el insecto podría alcanzar la semilla y depositar algunos huevos, y más tarde, el adulto morirá. En este caso, se encontró una población reducida de insectos dentro de las semillas de café en comparación con la población de insectos encontrada en el grupo de control rociado con agua (Tabla 3).

Tabla 3: Efectos postinfestación después del tratamiento con un hongo entomopatógeno y una sustancia repelente. Población de insectos dentro de las semillas. Los GF se diseccionaron a los 15 días. * Para cada variable, las diferencias con respecto al control (agua) según la prueba de Dunnett al 5%. Para cada variable, diferentes letras indican diferencias según el LSD 5%.

La Figura 6 muestra el efecto de un producto con efectos postinfestación, un entomopatógeno y el de una sustancia repelente, así como su acción combinada.

Figura 6: Efectos postinfestación de un hongo entomopatógeno y una sustancia repelente. Porcentaje de mortalidad de H. hampei adulto y daño a las semillas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Estas metodologías permiten la rápida determinación de diferentes efectos de productos tóxicos sobre el CBB.

Ninguno de los autores tiene conflictos de intereses que declarar.