Tratamiento antirretroviral combinado oral en ratones humanizados infectados con VIH-1

La esperanza de vida de los individuos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana crónica (VIH) ha mejorado significativamente con el tratamiento antirretroviral combinado (TARV)^1,2. El cART reduce con éxito la replicación del VIH-1 y aumenta el recuento de células T CD4+ a la normalidad en la mayoría de los participantes infectados crónicamente por VIH-1³, lo que resulta en una mejor salud general y una reducción drástica de la progresión de la enfermedad⁴. Sin embargo, el reservorio latente del VIH-1 se establece incluso cuando el TAR se inicia durante la infección aguda ^5,6,7. Los reservorios persisten durante años durante el TAR y el rápido rebote viral después de la interrupción del TAR está bien documentado ^8,9. Las personas que viven con VIH en tratamiento antirretroviral también están predispuestas a un mayor riesgo de comorbilidades como enfermedades cardiovasculares, cáncer y trastornos neurológicos^10,11,12. Por lo tanto, se necesita una cura funcional para el VIH. Los modelos animales para la infección por VIH-1 ofrecen ventajas obvias en el desarrollo y validación de nuevas estrategias de curación del VIH^13,14,15. Los ratones humanizados, como modelo animal pequeño, pueden proporcionar la reconstitución de células inmunes humanas multilinaje en diferentes tejidos, lo que permite el estudio detallado de la infección por VIH^16,17,18,19. Entre los modelos humanizados, el modelo humanizado de médula ósea-hígado-timo (BLT) recapitula con éxito la infección crónica por VIH-1, así como las respuestas inmunes humanas funcionales a la infección por VIH-1 20,21,22,23,24. Por lo tanto, el modelo de ratón BLT humanizado se ha utilizado ampliamente para investigar diversos aspectos en el campo de la investigación del VIH. Los ratones BLT humanizados no solo son modelos bien establecidos para la recapitulación de la infección persistente por VIH-1 y la patogénesis, sino también herramientas consecuentes para la evaluación de estrategias de intervención basadas en la terapia celular. Los autores actuales y otros han demostrado que el modelo humanizado de ratones BLT recapitula la infección persistente por VIH-1 y la patogénesis 25,26,27 y proporciona herramientas para evaluar las estrategias de intervención basadas en la terapia celular 28,29,30,31,32,33.

Los regímenes de cART que consisten en combinaciones de medicamentos antirretrovirales que se toman diariamente suprimen la replicación del VIH-1 hasta el punto de que la carga viral en individuos tratados con éxito permanece indetectable a largo plazo³⁴. Los resultados del tratamiento de ratones humanizados infectados por el VIH con regímenes de TAR clínicamente relevantes se asemejan a los observados en individuos tratados con TAR infectados por VIH-1²²: los niveles de VIH-1 se suprimen por debajo de los límites de detección y la interrupción de los resultados de cART en un rebote de la replicación del VIH desde el reservorio latente³⁵. La inyección subcutánea (SC)27,36,37 o intraperitoneal (IP)^37,38,39 es la vía comúnmente utilizada para el tratamiento del TAR cART en ratones humanizados. Sin embargo, la inyección diaria intensiva induce estrés a los animales por restricción física⁴⁰. También requiere mucha mano de obra y es potencialmente inseguro para los investigadores debido a una mayor exposición al VIH mientras se usan objetos punzantes. La administración oral es ideal para imitar la absorción, distribución y excreción de los fármacos antirretrovirales que toman las personas infectadas por el VIH-1. La administración oral generalmente implica procedimientos personalizados y a menudo laboriosos para poner los medicamentos antirretrovirales en alimentos esterilizados (necesarios debido a la inmunodeficiencia de los ratones) 24,37,41 o agua 42,43,44,45,46 , que puede o no ser químicamente compatible con muchos medicamentos antirretrovirales, o resultar en algo que los ratones no comerían o beberían fácilmente (lo que afectaría la dosis y los niveles de medicamentos en el cuerpo). El novedoso método de administración de cART peroral propuesto aquí supera los intentos de administración anteriores debido a su compatibilidad con diferentes tipos de medicamentos antirretrovirales, seguridad y facilidad de preparación y administración, y reducción del estrés y la ansiedad de los animales como resultado de la inyección diaria.

Tenofovir disoproxil fumarato (TDF), Elvitegravir (ELV) y Raltegravir (RAL) son fármacos poco solubles en agua. Curiosamente, se observa una mayor biodisponibilidad de TDF con alimentos grasos, lo que sugiere que la inhibición competitiva de las lipasas por los alimentos grasos puede proporcionar cierta protección para TDF⁴⁷. Por lo tanto, las tazas DietGel Boost fueron seleccionadas para reemplazar la comida regular para roedores como método de administración en función de su modesto contenido de grasa (20,3 g por 100 g) en comparación con la comida regular para roedores (10 g por 100 g) y una dieta típica alta en grasas para ratones (40-60 g por 100 g)⁴⁸. El peso total de una taza es de 75 g; Por lo tanto, cada taza contendrá la cantidad de alimento y, por lo tanto, medicamento, suficiente para cinco ratones durante 3 días.

El tejido fetal humano anónimo fue adquirido comercialmente. La investigación con animales se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por la Universidad de California, Los Ángeles y el Comité de Investigación Animal (ARC) (UCLA) de acuerdo con todas las pautas federales, estatales y locales. Específicamente, todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones y pautas para el alojamiento y cuidado de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AALAC) Internacional bajo el Protocolo ARC de UCLA Número 2010-038-02B. Todas las cirugías se realizaron bajo ketamina (100 mg/kg)/xilazina (5 mg/kg) y anestesia con isoflurano (2-3 vol%) y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el dolor y las molestias de los animales.

1. Ratones humanizados infectados con VIH-1

NOTA: Los ratones humanizados se construyeron como se describió previamente en^30,31,49. El protocolo se describe brevemente a continuación.

1. Purificar las células progenitoras hematopoyéticas CD34+ del hígado fetal humano a través de microperlas anti-CD34 de acuerdo con el protocolo del fabricante.
2. Anestesiar ratones machos y hembras de 6-8 semanas de edad NOD/SCID/IL2Rγ−/− (NSG) y irradiar subletalmente (2.7 Gy) antes de la cirugía.
3. Implante el timo, derivado del mismo donante que el hígado fetal, debajo de la cápsula renal junto con el hígado.
4. Después de la implantación, inyecte ratones con 0,5 millones a un millón de células CD34 +, por vía intravenosa.
5. Después de 8-10 semanas, recoger 100 μL de sangre de ratón a través de sangrado retroorbitario⁵⁰ en tubos de microcentrífuga que contengan 5 μL de EDTA y centrifugar a 350 x g durante 3 min.
6. Almacene el plasma a -80 °C para controlar la carga viral después de que el ratón haya sido infectado con el VIH-1. Agregue 2 ml de solución de NH4C al 83% e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente para lisar los glóbulos rojos.
7. Agregue 10 ml de RPMI con 10% de suero fetal bovino (FBS) para detener la lisis. Girar a 300 x g durante 5 min.
8. Aspirar sobrenadante. Teñir las células con panel de anticuerpos (ver Tabla de materiales) y analizar por citometría de flujo para verificar el injerto de células inmunes humanas.
9. Infectar ratones que exhiben más del 50% de células CD45+ circulantes mediante inyección de vena retroorbitaria^51,52 con al menos 200 ng de p24 de una cepa de VIH-1 (es decir, NFNSXSL9 30,53,54) utilizando una jeringa de insulina. Recolectar sangre quincenalmente para el análisis de citometría de flujo y para medir la carga viral.

2. Preparación de medicamentos antirretrovirales

1. Pesar medicamentos individuales; por ejemplo, para hacer 10 tazas de comida con cART, use raspadores de células estériles para pesar 250 mg de FTC (emtricitabina), 375 mg de TDF y 500 mg de RAL o ELV en tubos centrífugos estériles individuales de 15 ml en un gabinete de bioseguridad.
2. Agregue 1 ml de DMSO en un tubo FTC de 250 mg (concentración final de 250 mg / ml), agregue 1.5 ml de DMSO en un tubo TDF de 375 mg (concentración final de 250 mg / ml) y agregue 1 ml de DMSO en un tubo RAL o ELV de 500 mg (concentración final de 500 mg / ml). Revuelva o pipete la mezcla del fármaco hasta que se disuelva completamente y se obtenga una solución transparente.
3. Utilice un filtro de membrana de PVDF hidrófilo de 0,22 μM de tamaño de poro para esterilizar soluciones con una jeringa estéril. Las soluciones farmacológicas individuales pueden conservarse a -20 °C durante 12 semanas.
4. Cuando esté listo para usar, descongelar una alícuota de cada solución farmacológica a 37 °C hasta que la solución se aclare. Mezclar bien con una pipeta.
5. Combine los medicamentos y mezcle bien para formar la mezcla maestra: 1 ml de FTC en DMSO, 1.5 ml de TDF en DMSO y 1 ml de ELV o RAL en DMSO.
   NOTA: Esta cantidad hará 10 tazas de comida.
6. Agregue 350 μL de solución de mezcla maestra cART en una taza para hacer una taza DietGel Boost cART.
7. Agregue 0.75 ml de trimetoprima-sulfametoxazol (concentración final de 0.48 mg/ml) en la taza.
8. Revuelva bien con puntas de pipeta estéril de 1 ml.
9. Alícuota la taza de comida que contiene cART de la taza original con una micro espátula en una placa de Petri de 60 mm según sea necesario. Pese la comida en una balanza para calcular la cantidad de taza de comida que contiene cART para cada jaula de acuerdo con el número de ratones.

3. Administración de medicamentos antirretrovirales a ratones infectados con VIH-1

1. Retire la comida regular de la jaula y reemplácela con una taza de comida que contenga cART.
   NOTA: En promedio, un ratón comerá hasta 5 g de comida por día. Se puede administrar aproximadamente una taza de alimento a cinco ratones durante 2 días.
2. Refresque los alimentos cART tres veces por semana.
3. Pese las tazas usadas para controlar la ingesta. Pesar los ratones semanalmente para confirmar el consumo.

4. Monitorizar la carga viral mediante PCR en tiempo real

1. Evaluar las células inmunes humanas (niveles de células T CD4 y CD8) y la replicación del VIH-1 en ratones BLT cada 2 semanas por sangrado retroorbitario. Recolecte plasma siguiendo las instrucciones de los pasos 1.5-1.8.
2. Monitorear las cargas virales plasmáticas de ratones infectados con VIH-1 antes y durante la administración oral de cART durante 8 semanas. Extraiga ARN viral plasmático del plasma utilizando un kit de extracción de ARN viral y cuantifíquelo por PCR en tiempo real utilizando los cebadores y sondas (ver Tabla de materiales) como se describió anteriormente 27,30,31. Utilice el siguiente protocolo de ciclismo: 48 °C (15 min), 95 °C (10 min), luego ciclismo 95 °C (15 s), 60 °C (1 min) durante 45 ciclos.

5. Evaluar las proporciones CD4/CD8 mediante citometría de flujo

1. Prepare suspensiones unicelulares de sangre periférica de hemorragias quincenales siguiendo los pasos 1.5-1.8.
2. Teñir células con marcadores de superficie y analizar por citometría de flujo. Utilice los siguientes marcadores de superficie anticuerpos 27,30,43,49 en citometría de flujo: CD45 (clon HI30), CD8 (clon SK1), CD3 (clon OKT3), CD4 (clon RPA-T4)^27,30,42,49.

Suponiendo que un ratón promedio que pesa 25 g consume 4 g de alimento por día, la dosis diaria del fármaco a través de la ingesta oral corresponde a 2,88 mg / kg TFV, 83 mg / kg FTC y 768 mg / kg RAL. Para probar si el régimen alimenticio optimizado es tóxico e influye en la salud general en comparación con la inyección diaria de cART, el peso de los ratones se controló semanalmente antes y durante el cART mediante inyección oral o subcutánea. No hubo diferencias significativas de peso antes de la administración de cART en cada grupo (Figura 1). Sin embargo, el peso del ratón disminuyó continuamente durante la inyección diaria de cART SC. Por el contrario, FTC/TDF/ELV o FTC/TDF/RAL en DietGel restauraron los pesos de ratón a los niveles de iniciación previos al TAR después de 5 semanas de administración oral de cART. Además, no se observaron cambios significativos de peso entre los grupos de Raltegravir o Elvitegravir.

Para probar si la administración oral de cART suprime la carga viral tan eficazmente como una inyección diaria, se evaluaron las cargas virales plasmáticas quincenales mediante RT-PCR. La Figura 2 muestra que el régimen alimenticio FTC / TDF / ELV ART suprimió 100% eficientemente la replicación viral a niveles indetectables dentro de las 4 semanas; El régimen alimenticio FTC / TDF / RAL ART puede suprimir el 80% de los ratones a niveles indetectables dentro de las 4 semanas, mientras que solo el 70% de los ratones que recibieron la inyección SC alcanzaron niveles indetectables después de 4 semanas de tratamiento. Los resultados demostraron que la administración oral suprime la replicación viral más rápida y eficientemente que la inyección SC. Además, el régimen alimenticio de cART evitó la disminución adicional de las proporciones CD4 / CD8 en la sangre periférica antes de la inyección diaria SC (Figura 3). Estos resultados sugirieron que el régimen de cART oral propuesto puede suprimir con éxito la viremia plasmática por debajo del nivel de detección, restaurar rápidamente los niveles de células T CD4 y mejorar la salud general de los animales en ratones humanizados infectados con VIH-1.

Figura 1: El peso corporal del ratón cambia antes y durante el tratamiento con cART después de la infección por VIH-1 en diferentes grupos. Los ratones humanizados fueron infectados con el VIHNFNSXSL9 después de la reconstitución inmune. Después de 4 semanas de infección por VIH-1, los ratones fueron tratados durante otras 7,5 semanas con régimen FTC/TDF/RAL mediante inyección subcutánea (SC), o mediante administración oral de FTC/TDF/RAL o FTC/TDF/ELV. El peso corporal del ratón se midió a partir de 1 semana antes de la infección por VIH. Todas las comparaciones estadísticas se realizaron mediante la prueba de Mann-Whitney, media del grupo informante (± E.E.). Las estrellas de asterisco verde muestran diferencias estadísticas entre el grupo oral alimentario FTC/TDF/ELV y el grupo de inyección FTC/TDF/RAL SC. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. n=6-7 en cada grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: La administración oral de cART en alimentos muestra una supresión viral más rápida. Como se describe en la Figura 1, los ratones no fueron tratados o tratados con régimen FTC/TDF/RAL mediante inyección subcutánea y mediante la administración oral de regímenes alimenticios simulados, FTC/TDF/RAL o FTC/TDF/ELV durante otras 7,5 semanas. (A) Carga viral plasmática a lo largo del tiempo después de la infección por VIH-1 en diferentes grupos. (B) Resumen de la carga viral a lo largo del tiempo después de la infección por VIH-1 en diferentes grupos, informando la media geométrica del grupo con un intervalo de confianza (IC) del 95%. Las flechas negras indican el momento del inicio del TAR cART para los grupos tratados con cART. (C) Análisis de supervivencia del tiempo posterior al tratamiento con TAR cT a carga viral indetectable para cada grupo. n= 6-7 en cada grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Las administraciones orales de alimentos antirretrovirales muestran una restauración más rápida de la relación CD4/CD8. Relación CD4/CD8 en sangre periférica a lo largo del tiempo después de la infección por VIH-1 para cada grupo. Todas las comparaciones estadísticas se realizaron mediante la prueba de Mann-Whitney, que informaba la media del grupo (± S.E.). Las estrellas de asterisco rojo muestran diferencias estadísticas entre el grupo oral alimentario FTC/TDF/RAL y el grupo de inyección FTC/TDF/RAL SC. *P < 0,05. n=6-7 en cada grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

SK es fundador de CDR3 Inc. Los autores restantes declaran que la investigación se realizó en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.