Aquí se presenta una descripción del aislamiento directo y relativamente rápido del ADN genómico de Caenorhabditis elegans de uno o unos pocos animales utilizando un kit de tejido disponible comercialmente. La preparación de gDNA resultante es una plantilla adecuada para PCR.
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Artículo de método
Extracción a pequeña escala de ADN genómico de Caenorhabditis elegans
En este artículo
Resumen
Resumen
La extracción de ADN genómico de uno o unos pocos Caenorhabditis elegans tiene muchas aplicaciones posteriores, incluida la PCR para líneas de genotipado, clonación y secuenciación. Los métodos tradicionales basados en la proteinasa K para la extracción de ADN genómico de C. elegans tardan varias horas. Los kits de extracción comerciales que rompen efectivamente la cutícula de C. elegans y extraen ADN genómico son limitados. Aquí se informa un método fácil, más rápido (~ 15 min) y rentable de extracción de ADN genómico de C. elegans que funciona bien para aplicaciones en el aula y la investigación. Este método de extracción de ADN está optimizado para utilizar nematodos monolarvales tardíos (L4) o adultos como material de partida para obtener una plantilla confiable para realizar PCR. Los resultados indican que la calidad del ADN es adecuada para amplificar objetivos genéticos de diferentes tamaños mediante PCR, lo que permite el genotipado de uno o varios animales incluso en diluciones a una quincuagésima parte del ADN genómico de un solo adulto por reacción. Los protocolos informados se pueden utilizar de manera confiable para producir rápidamente una plantilla de ADN a partir de una sola o una pequeña muestra de C. elegans para aplicaciones basadas en PCR.
Introducción
Aquí, se presentan dos protocolos relacionados para la lisis de Caenorhabditis elegans para hacer que el ADN sea accesible para aplicaciones basadas en PCR. La PCR es una técnica molecular de uso común utilizada para muchas aplicaciones, incluyendo el genotipado y la amplificación de fragmentos de ADN para clonación y secuenciación, entre otras. El pequeño (1 mm) gusano redondo de vida libre C. elegans es un sistema animal popular para la investigación biológica. La obtención de ADN genómico adecuado de un solo animal o de unos pocos animales es suficiente para amplificar la secuencia mediante PCR. Las larvas y adultos L4 tardío....
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Protocolo
1. Mantenimiento de C. elegans
NOTA: Las cepas N2 (tipo salvaje) y blmp-1(tm548) C. elegans se mantuvieron en placas estándar de medios de crecimiento de nematodos (NGM) a 20 °C.
- Preparar placas NGM disolviendo 23.005 g de polvo NGM en 973 mL de agua en un matraz de 2 L. Cubra la abertura del matraz con papel de aluminio (o tapa autoclavable que permite la ventilación) y asegure la cubierta con cinta de autoclave. Autoclave para disolver el polvo y esterilizar el contenido con un ciclo de esterilización de al menos 30 min.
- Enfríe el medio a 60 °C en un baño de agua.
- Al medio e....
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Resultados
El ADN genómico de uno o varios adultos de tipo salvaje se extrajo utilizando el kit comercial o el protocolo de lisis tradicional para comparar la eficacia de estos dos métodos. Estos lisados se utilizaron como plantillas para PCR para amplificar un objetivo más grande de ~ 2,100 bp (codificación blmp-1) o un objetivo más pequeño de ~ 500 bp (codificando una parte de sma-10). Ambos métodos produjeron con éxito productos de PCR apropiados (Figura 1A).
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Discusión
Determinar los genotipos de C. elegans es un paso importante al realizar cruces genéticos para crear nuevas cepas de C. elegans . La extracción de ADN genómico utilizando uno o pocos C. elegans es un paso crucial en el genotipado de C. elegans. Este protocolo describe la extracción de ADN genómico de C. elegans utilizando un kit comercial. Este método es rápido y funciona de manera robusta. El ADN genómico extraído utilizando este método se puede utilizar para aplicaciones pos.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
La cepa N2 y la bacteria E. coli OP50 se obtuvieron del Centro de Genética Caenorhabditis (CGC), que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). La cepa blmp-1(tm548) se obtuvo del National Bioresource Project, Japón. Los autores agradecen a WormBase. Este trabajo fue apoyado por NIH R01GM097591 a T.L.G., financiamiento interno de Texas Woman's University a T.L.G, y el Centro de Investigación Estudiantil de TWU a M.F.L.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| cinta de autoclave | Defend | 43237-2 | |
| papel de aluminio, | envoltura Reynolds | 2182934 | |
| cloruro de calcio | Millipore Sigma 102382 | (CAS 10035-04-8) | |
| Kit Extract-N-Amp (incluye solución de preparación de tejidos, solución de extracción y solución de neutralización) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Placa calefactora/agitador Fisher | Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, cápsulas | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| sulfato de magnesio, 97% puro, anhidro | Microcentrífuga Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| Microcentrífuga | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Arranque en caliente ADN polimerasa de alta fidelidad | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" utilizado en la Figura Suplementaria S1, una polimerasa de alta velocidad y alta fidelidad (20– 30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" en la Figura 1B, una polimerasa de alta velocidad y alta fidelidad (15– 30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | ADN personalizado, oligo | |
| , polimerasa PrimeSTAR, GXL | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" en la Figura 1B, una polimerasa de alta fidelidad (1 min/kb) para plantillas ricas en GC y plantillas de hasta 30 kb |
| Escalera de ADN de 2 logaritmos púrpura de carga rápida (0.1– 10.0 kb) | Nueva Inglaterra Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix Takara | Bio Inc. | RR350A | "Pol A" en la Figura 1B, polimerasa utilizada en la Figura 1A, C, D, una polimerasa de alta velocidad (10 s/kb) para objetivos de hasta 5 kb |
| Mezcla de reacción de PCR Sigma ReadyMix Taq | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" en la Figura 1B, una polimerasa (1 min/kb) para objetivos de hasta 7 kb |
| Termociclador SimpliAmp Barra agitadora | A24812 | Applied Biosystems | |
| Fisher Scientific | 14-512-126 | ||
| mezclador de vórtice | Fisher Scientific | 2215365 | |
| pico de gusano | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
Referencias
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H.
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Reimpresiones y permisos
