Extracción a pequeña escala de ADN genómico de Caenorhabditis elegans

Aquí, se presentan dos protocolos relacionados para la lisis de Caenorhabditis elegans para hacer que el ADN sea accesible para aplicaciones basadas en PCR. La PCR es una técnica molecular de uso común utilizada para muchas aplicaciones, incluyendo el genotipado y la amplificación de fragmentos de ADN para clonación y secuenciación, entre otras. El pequeño (1 mm) gusano redondo de vida libre C. elegans es un sistema animal popular para la investigación biológica. La obtención de ADN genómico adecuado de un solo animal o de unos pocos animales es suficiente para amplificar la secuencia mediante PCR. Las larvas y adultos L4 tardíos contienen solo ~ 1,000 células somáticas (incluidas algunas células poliploides multinucleares), células germinales y (si el animal es un hermafrodita grávido) descendencia en el útero¹. Sin embargo, estos animales están protegidos por una cutícula que debe ser interrumpida para extraer el ADN genómico². Los métodos estándar para preparar la plantilla de ADN genómico de nematodos para PCR implican múltiples pasos y toman varias horas. Los animales se congelan primero en tampón de lisis de lombrices que contiene proteinasa K (-70 °C o menos) durante al menos 15-45 min (algunos protocolos recomiendan más tiempo)3,4,5,6. Este paso abre los animales.

Después de la congelación, los animales se incuban durante 1 h a 60-65 ° C para que la proteinasa K funcione, luego la enzima se inactiva durante 15-30 min a 95 ° C. La proteinasa K destruye las nucleasas que degradan el ADN. La inactivación de la proteinasa K antes de la PCR es importante para evitar que la proteinasa K degrade la ADN polimerasa. Los dos protocolos basados en kits descritos aquí son métodos rápidos, confiables y rentables para extraer ADN genómico de un solo animal o de unos pocos nematodos para aplicaciones diarias de laboratorio de investigación y enseñanza. El kit utilizado fue optimizado originalmente por el fabricante para extraer ADN de tejido animal, saliva y cabello⁷. Utiliza una solución patentada de preparación de tejidos y una solución de extracción para lisar las células y hacer que el ADN genómico sea accesible. Una solución de neutralización patentada neutraliza los componentes que pueden inhibir la PCR (por ejemplo, sales, iones y moléculas de unión a Mg²⁺).

Al genotipar, se puede probar un solo animal. Al determinar si una cepa es homocigota, la prueba de seis o más crías de un solo animal da una gran confianza en que una línea es homocigota o no (hay una probabilidad del 0,02% de elegir al azar seis progenies mutantes homocigotas de un padre heterocigoto [(1/4)⁶ × 100% = 0,02%]). Este método 1) es sencillo, con menos pasos que el método de la proteinasa K, y 2) disminuye el tiempo de preparación de la plantilla a 15 min. Los resultados de este trabajo demuestran que el protocolo desarrollado funciona de manera robusta en la extracción de ADN genómico de uno o varios gusanos, que se pueden usar de manera confiable para aplicaciones posteriores que no requieren ADN altamente purificado, incluida la PCR.

1. Mantenimiento de C. elegans

NOTA: Las cepas N2 (tipo salvaje) y blmp-1(tm548) C. elegans se mantuvieron en placas estándar de medios de crecimiento de nematodos (NGM) a 20 °C.

1. Preparar placas NGM disolviendo 23.005 g de polvo NGM en 973 mL de agua en un matraz de 2 L. Cubra la abertura del matraz con papel de aluminio (o tapa autoclavable que permite la ventilación) y asegure la cubierta con cinta de autoclave. Autoclave para disolver el polvo y esterilizar el contenido con un ciclo de esterilización de al menos 30 min.
2. Enfríe el medio a 60 °C en un baño de agua.
3. Al medio enfriado, agregue 25 ml de tampón estéril de fosfato de 1 M (KH₂PO₄), pH 6.0; 1 ml de solución de cloruro de calcio de 1 M; y 1 ml de solución de sulfato de magnesio de 1 M.
4. Revuelva el medio en una placa de agitación magnética para obtener una mezcla homogénea y evitar el enfriamiento y la solidificación desiguales (~ 5 min). Asegúrese de que la barra de agitación gire lo suficientemente rápido como para crear un vórtice, pero no tan rápido como para que se introduzcan burbujas (~ 250-300 rpm).
5. Vierta ~ 25 ml del medio en cada placa de Petri de 10 cm (~ 40 placas en total). Seque las placas a temperatura ambiente durante la noche (típicamente 16-25 ° C).
6. Cultive una colonia de Escherichia coli OP50 en 30-50 ml de caldo LB durante la noche a 37 ° C.
7. Sembrar cada placa con 500 μL de cultivo de E. coli OP50 y dejar secar a temperatura ambiente antes de su uso (típicamente 16-25 °C)⁸. Guarde las placas a 4 °C durante un máximo de 3 semanas.
8. Transfiera C. elegans a placas sembradas utilizando un pico de alambre u otro método y déjelos crecer a L4 o etapa adulta a la temperatura requerida para la cepa (típicamente 16-25 ° C, 1-2 días si los animales fueron chapados hambrientos como dauers, 3-4 días si los animales fueron chapados como embriones)⁸.

2. Extracción de ADN de un solo gusano

NOTA: Este método es útil para extraer ADN de un solo gusano (un gusano en 1,8 μL de volumen total). Se puede hacer una mezcla maestra si se lisan varios gusanos a la vez.

1. Programe un termociclador para un ciclo a 55 °C durante 10 min seguido de 95 °C durante 3 min (programa de lisis).
2. Alícuota 0,8 μL de la solución de extracción del kit en la pared interior de un tubo pcr de 0,2 ml sobre hielo. Agregue 0,2 μL de la solución de preparación de tejidos del kit a la gota de la solución de extracción. Mezclar por pipeteo.
3. Identificar un animal L4 o adulto bajo un microscopio de disección⁹. Para identificar hermafroditas L4, busque una vulva característica que sea visible como un semicírculo pálido en el medio del animal. Identifique hermafroditas adultos buscando los animales más grandes en la placa que puedan tener embriones ovalados visibles en su útero.
4. Usando una selección de alambre de platino, transfiera el animal seleccionado a la solución¹⁰.
5. Centrifugar el tubo brevemente (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g) a temperatura ambiente para recoger el contenido en la parte inferior del tubo.
6. Coloque el tubo en el termociclador y ejecute el programa de lisis establecido en el paso 2.1.
7. Cuando se complete el programa, centrífique brevemente el tubo y colóquelo sobre hielo. Agregue 0.8 μL de la solución de neutralización del kit a la mezcla. Mezclar por pipeteo.
8. Centrifugar el tubo brevemente a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).
9. Utilice directamente el lisado para PCR o guárdelo a 4 °C o -20 °C para su uso futuro.
   NOTA: El ADN extraído es estable a 4 °C o -20 °C durante al menos 6 meses⁷.

3. Extracción de ADN de unos pocos individuos

NOTA: Este método es útil para extraer ADN de algunos gusanos. Se puede preparar una mezcla maestra si se lisan varias cepas a la vez.

1. Programe el termociclador para un ciclo a 55 °C durante 10 min seguido de 95 °C durante 3 min (programa de lisis).
2. Alícuota 2,0 μL de la solución de extracción del kit en la pared interior de un tubo PCR de 0,2 ml sobre hielo. Agregue 0,5 μL de la solución de preparación de tejidos del kit a la gota de la solución de extracción. Mezclar por pipeteo.
3. Identificar L4 o animales adultos bajo un microscopio de disección⁹. Los hermafroditas L4 tienen una vulva característica que es visible como un semicírculo pálido en el medio del animal. Los hermafroditas adultos son los animales más grandes en la placa y pueden tener embriones ovalados visibles en su útero.
4. Usando una selección de alambre de platino, transfiera algunos animales a la solución: 9 animales producen 1 equivalente animal de ADN genómico por 0.5 μL de lisado, y 16 animales producen ~ 1 equivalente animal de ADN genómico en 0.25 μL (3.5 nematodos / μL)¹⁰.
   NOTA: Es difícil transferir más de 16 animales a este volumen.
5. Centrifugar el tubo brevemente a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).
6. Coloque el tubo en el termociclador y ejecute el programa de lisis establecido en el paso 3.1.
7. Cuando se complete el programa, centrífique brevemente el tubo y colóquelo sobre hielo. Agregue 2 μL de la solución de neutralización del kit a la mezcla. Mezclar por pipeteo.
8. Centrifugar el tubo brevemente a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).
9. Utilice directamente la lisis para PCR o guárdela a 4 °C o -20 °C para su uso futuro.
   NOTA: El ADN extraído es estable a 4 °C o -20 °C durante al menos 6 meses⁷.

4. Reacción de PCR

NOTA: Se describe una aplicación posterior de esta técnica de lisis de gusanos, detectando una mutación de deleción utilizando una polimerasa rápida. También se demuestra la efectividad de los dos protocolos de lisis de gusanos en la producción de ADN de plantilla genómica para PCR exitosa en diluciones a 1/^{50 de} un gusano por reacción.

1. Extraiga ADN de un solo gusano y 16 gusanos utilizando cepas mutantes y N2 de tipo salvaje, como se describe anteriormente en los Pasos 2 y 3.
2. Prepare diluciones de 2, 10, 20 y 50 veces de ADN de un solo gusano de animales N2 de tipo salvaje.
3. Configure las reacciones de PCR siguiendo el protocolo del fabricante utilizando cebadores específicos para la secuencia de interés y la mezcla maestra de PCR de arranque en caliente (Tabla 1 y Tabla 2). Utilice 1 μL de ADN sin diluir o 2 μL de ADN diluido como plantilla en cada reacción.
4. Confirme los productos de PCR mediante electroforesis en gel e imágenes¹¹.

El ADN genómico de uno o varios adultos de tipo salvaje se extrajo utilizando el kit comercial o el protocolo de lisis tradicional para comparar la eficacia de estos dos métodos. Estos lisados se utilizaron como plantillas para PCR para amplificar un objetivo más grande de ~ 2,100 bp (codificación blmp-1) o un objetivo más pequeño de ~ 500 bp (codificando una parte de sma-10). Ambos métodos produjeron con éxito productos de PCR apropiados (Figura 1A).

A continuación, se demostró la capacidad del ADN genómico extraído por el kit para servir como plantilla para una variedad de ADN polimerasas. El ADN genómico extraído se utilizó como plantilla para amplificar un producto de 0,5 kb utilizando cuatro polimerasas que poseen diferentes capacidades (incluida la velocidad, la fidelidad y el tamaño del producto). Los productos de tamaños esperados fueron generados por estas polimerasas utilizando una plantilla de una lisis de un solo adulto o una lisis de nueve adultos (Figura 1B). La secuencia de la plantilla y la fidelidad de las polimerasas pcr para amplificar correctamente la secuencia de la plantilla se pueden confirmar mediante secuenciación (Figura suplementaria S1). Este resultado demuestra que el ADN genómico extraído de los protocolos del kit proporciona una plantilla adecuada para una gama de polimerasas.

La eficacia de la PCR se probó utilizando diferentes concentraciones del ADN genómico extraído de un solo animal utilizando el kit comercial. El ADN se diluyó en 2, 10, 20 o 50 veces, y el equivalente a aproximadamente la mitad, una décima, una vigésima y una quincuagésima parte de un gusano por reacción se utilizó para las PCR. Estas concentraciones de plantillas de ADN admitían la amplificación de un objetivo más grande de ~2,1 kb o un objetivo más pequeño de ~0,5 kb (Figura 1C)12. Mientras que se observó un rendimiento dependiente de la concentración de ADN del producto de PCR de 0,5 kb, el rendimiento del producto de PCR de 2,1 kb parecía equivalente en todas las reacciones.

Para demostrar que estos protocolos producen ADN genómico a partir de C. elegans que es adecuado para el genotipado de PCR, se extrajo ADN genómico de mutantes de pérdida de función únicos y 16 de tipo salvaje y blmp-1 (blmp-1 (tm548)). El gen blmp-1 codifica un factor de transcripción con importantes funciones en la migración celular de la punta distal, el tamaño corporal y el desarrollo 12,13,14,15,16. El mutante blmp-1 tiene una deleción de 810 pb que elimina partes del exón 3 y el intrón 315. Se diseñaron cebadores que dan como resultado un producto de 2.134 pb cuando se utiliza la plantilla de ADN de tipo salvaje y un producto de 1.324 pb si se utiliza ADN blmp-1(-). Se detectaron productos de PCR de los tamaños apropiados utilizando 1 μL de lisis de un solo gusano (aproximadamente 0,5 gusanos por reacción) o 16-gusano de animales con etapas L4 (3,5 gusanos por reacción) (Figura 1D). Este resultado muestra que el ADN genómico extraído por kit utilizando cualquiera de los protocolos proporciona plantillas igualmente efectivas para la PCR y las líneas de genotipo.

Estos resultados muestran que las preparaciones de ADN genómico de C. elegans utilizando un kit comercial de extracción de ADN tisular de animales individuales y múltiples se pueden usar de manera confiable como plantillas para PCR.

Figura 1: Las preparaciones de ADN que utilizan un kit comercial de nematodos individuales y nematodos múltiples permiten una amplificación robusta por PCR. Los productos de PCR se cargaron en gel de agarosa al 1% en 1 tampón TAE (5 μL (A, B) o 10 μL (C, D) y funcionaron a 90-100 V durante 30 min a 2 h. Se utilizó una escalera de ADN de 2 troncos para todos los geles. (A) Comparación de la lisis de ADN por kit con los métodos tradicionales de proteinasa K para crear plantillas utilizando dos conjuntos de cebadores. Se lisaron adultos de tipo salvaje, y se utilizó el equivalente a un animal como plantilla para todas las reacciones. Carriles 1-4, producto de 2.1 kb. Lane 1, PCR de lisis de un solo gusano por proteinasa K. Lane 2, PCR de lisis de un solo gusano por el método del kit. Lane 3, PCR de lisis de gusano de nueve gusanos por proteinasa K. Lane 4, PCR de lisis de gusano de nueve gusanos por el método del kit. Carriles 5-8, 0.5 kb producto. Lane 5, PCR de lisis de un solo gusano por proteinasa K. Lane 6, PCR de lisis de un solo gusano por el método del kit. Lane 7, PCR de lisis de gusano de nueve gusanos por proteinasa K. Lane 8, PCR de lisis de gusano de nueve gusanos por el método del kit. (B) El método del kit para la lisis del ADN proporciona una plantilla adecuada para la PCR por polimerasas múltiples. Los adultos de tipo salvaje se lisaron utilizando el método del kit, y el equivalente a la mitad de un animal se utilizó como plantilla de PCR para un producto de 0,5 kb. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre la polimerasa. Carril 1, PCR de una lisis de un solo gusano con una polimerasa de alta velocidad. Lane 2, PCR de una lisis de nueve gusanos con una polimerasa de alta velocidad. Lane 3, PCR de una lisis de un solo gusano con una polimerasa Taq . Lane 4, PCR de una lisis de nueve gusanos con una polimerasa Taq . Lane 5, PCR a partir de una lisis de un solo gusano con una polimerasa de alta fidelidad. Lane 6, PCR de una lisis de nueve gusanos con una polimerasa de alta fidelidad. Lane 7, PCR a partir de una lisis de un solo gusano con una polimerasa de alta velocidad y alta fidelidad. Lane 8, PCR de una lisis de nueve gusanos con una polimerasa de alta velocidad y alta fidelidad. (C) Las diluciones de una lisis de gusano L4 de tipo salvaje proporcionan una plantilla para la PCR. Carriles 1-5, 2.1 kb producto. Carriles 6-10, objetivo de 0,5 kb. Carril 1 y carril 6, ADN sin diluir. Carril 2 y carril 7, ADN diluido 2 veces. Carril 3 y carril 8, ADN diluido 10 veces. Carril 4 y carril 9, ADN diluido 20 veces. Carril 5 y carril 10, ADN diluido 50 veces. (D) Genotipado del locus blmp-1 mediante PCR utilizando 1 μL de preparaciones de ADN de un solo gusano y 16 como plantilla. Carril 1, PCR de lisis de un solo gusano de tipo salvaje. Carril 2, PCR de lisis de un solo gusano blmp-1(- ). Carril 3, PCR de lisis de 16 gusanos salvajes. Carril 4, PCR de blmp-1(-) lisis de 16 gusanos. Abreviaturas: preparación = método de preparación; kb = kilobase; st. = etapa de nematodo; dil. = dilución del ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Lista de cebadores.

Tabla 2: Componentes de reacción de PCR.

Figura suplementaria S1: Secuenciación para la confirmación de la calidad del ADN genómico preparado con un kit comercial. Los resultados de dos reacciones de secuenciación coinciden completamente con la secuencia esperada de más de 1.600 nucleótidos de ADN amplificados por una polimerasa de alta velocidad y alta fidelidad (Pol E) de una lisis de 16 gusanos (Tabla 1, Tabla 2A y Tabla 2D). Los extremos de lectura de secuenciación se recortaron para eliminar las lecturas base de baja calidad. La alineación se realizó utilizando la herramienta de alineación de secuencias múltiples EMBL-EBI MUSCLE (MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation)17. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.