Tipo de fibra y análisis subcelular específico del contenido de gotas lipídicas en el músculo esquelético

Camille M. Selvais; Laura L. De Cock; Sonia M. Brichard; María A. Davis-López de Carrizosa

doi:10.3791/63718

Artículo de método

Tipo de fibra y análisis subcelular específico del contenido de gotas lipídicas en el músculo esquelético

DOI:

10.3791/63718

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8 de junio de 2022

Camille M. Selvais¹ , Laura L. De Cock¹ , Sonia M. Brichard¹ , María A. Davis-López de Carrizosa¹^,²

¹Endocrinology, Diabetes and Nutrition Unit, Institute of Experimental and Clinical Research, Medical Sector, Université Catholique de Louvain, ²Departamento de Fisiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla

En este artículo

Resumen

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La creciente evidencia indica que la infiltración excesiva de lípidos dentro del músculo esquelético resulta en lipotoxicidad y diabetes. Aquí, presentamos un protocolo completo, que incluye procesamiento de tejidos, tinción con Bodipy, adquisición de imágenes y análisis, para cuantificar el tamaño, la densidad y la distribución subcelular de las gotas lipídicas de una manera específica de tipo de fibra.

Resumen

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La infiltración de lípidos del músculo esquelético, conocida como miosteatosis, aumenta con la obesidad y el envejecimiento. La miosteatosis también se ha descubierto recientemente como un factor de pronóstico negativo para varios otros trastornos como las enfermedades cardiovasculares y el cáncer. La infiltración excesiva de lípidos disminuye la masa muscular y la fuerza. También resulta en lipotoxicidad y resistencia a la insulina dependiendo del contenido total de lípidos intramiocelulares, la morfología de las gotas lipídicas (LD) y la distribución subcelular. El tipo de fibra (oxidativa vs glucolítica) también es importante, ya que las fibras oxidativas tienen una mayor capacidad para utilizar lípidos. Debido a sus implicaciones cruciales en la fisiopatología, se justifican estudios en profundidad sobre la dinámica y la función de la DA de una manera específica del tipo de fibra.

Aquí, se presenta un protocolo completo para la cuantificación del contenido de lípidos intramiocelulares y el análisis de la morfología de LD y la distribución subcelular de una manera específica del tipo de fibra. Con este fin, las criosecciones musculares en serie se tiñeron con el tinte fluorescente Bodipy y anticuerpos contra las isoformas de cadena pesada de miosina. Este protocolo permite el procesamiento simultáneo de diferentes músculos, ahorrando tiempo y evitando posibles artefactos y, gracias a una macro personalizada creada en Fiji, también es posible la automatización del análisis LD.

Introducción

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La infiltración de lípidos del músculo esquelético, conocida como miosteatosis, aumenta con la obesidad y el envejecimiento. La miostetosis se correlaciona negativamente con la masa muscular y la fuerza y con la sensibilidad a la insulina¹. Además, estudios recientes indican que el grado de miosteatosis podría usarse como factor pronóstico para otras afecciones como la enfermedad cardiovascular², la enfermedad del hígado graso no alcohólico³ o el cáncer⁴. Los lípidos pueden acumularse en el músculo esquelético entre las fibras musculares como lípidos extramiocelulares o den....

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Protocolo

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Todos los procedimientos realizados en ratones fueron aprobados por el Comité Ético para la Experimentación Animal del Sector Médico de la Universidad Católica de Lovaina (2019/UCL/MD/013).

1. Disección y preparación de las muestras para su congelación

Etiquete un trozo de corcho de 3 mm de grosor para cada par de músculos.
A través de una pequeña incisión realizada con una cuchilla en el centro del corcho, insertar perpendicularmente una pieza rectangular de plástico rígido (0,5 cm W, 1 cm H) que servirá de soporte (Figura 2B).
NOTA: El tamaño de la pieza de plástico rec....

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Resultados

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El protocolo descrito en este documento proporciona un método eficiente para cuantificar fácilmente los LD de una manera específica de tipo de fibra y subcelular. Muestra cómo, al congelar juntos dos músculos de tamaño similar, como el EDL y el sóleo, el tiempo y los recursos gastados en los siguientes pasos se reducen a la mitad.

Se proporciona un protocolo completo para la inmunotinción, la adquisición de imágenes y el análisis de las diferentes isoformas MyHC expresadas en los músculos del .......

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Discusión

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El protocolo detallado aquí describe un método eficiente para cuantificar los LD etiquetados con Bodipy sobre una base específica de tipo de fibra y subcelular. En los últimos años, los colorantes lipídicos clásicos, como ORO o Sudan Black B, han sido sustituidos por una nueva gama de colorantes fluorescentes, lipofílicos y permeables a las células que se unen a lípidos neutros (por ejemplo, Bodipy). Disponible como diferentes conjugados, Bodipy ha demostrado ser muy eficaz en el etiquetado de LD para estudiar su morfolo.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) y la Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care).C.M.S. es el receptor de una beca de doctorado de la FRIA (FNRS). M.A.D.-L.d.C. recibió una beca del Programa de Excelencia Internacional Wallonie-Bruxelles.

Los autores agradecen a Alice Monnier por su contribución al desarrollo de este protocolo y a Caroline Bouzin por su experiencia y ayuda técnica en el proceso de adquisición de imágenes. También agradecemos a la plataforma de imágenes 2IP-IREC por el acceso al criostato y los micros....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Equipment
AxioCam 506 mono 6 Mpix	Cámara CCD Zeiss
AxioCam MRm 1.4MPix	Zeiss
Campana química	Potteau Labo	EN-14175
Microscopio confocal	Zeiss	LSM800
Discos de corcho (ø 20 mm, 3 mm de grosor)	Ciencias de la Microscopía Electrónica	63305
Cryo-Gloves	Tempshield	16072252
Cryostat	Thermo Scientific	Microm Cryo Star HM 560
Microscopio estereoscópico de disección SMZ745	Nikon
Pinza de hielo
Dumont	F.S.T	11295-10
Microscopio de epifluorescencia	Zeiss	AxioImage-Apotome Z1
Tijeras Bonn extrafinas	F.S.T	14084-08
FisherBrand Desechable Base Moldes (0,7 x 0,7 cm)	ThermoFisher	22-363-552	Se utiliza para cortar una pieza para sujetar el músculo en el corcho para congelar
Placa de Petri de vidrio (H 25 milímetros, ø 150 mm)	MARCA Placa de Petri, MERK	BR455751	Se utiliza para colocar los músculos en hielo durante la disección
ImmEdge Barrera hidrofóbica PAP Pen	Vector Labs	H-4000	Se utiliza para crear una barrera hidrofóbica alrededor de las secciones musculares
Incubadora	MMM Medcenter	Incucell 707
Cubreobjetos de microscopio (24x50 mm)	Assistent
Cajas de portaobjetos de microscopio	Kartell	278	Utilizados como cámaras húmedas para inmunohistoquímica
Soporte de cuello	Linie zwo	SB-035X-02	Se utiliza como correa para sujetar el vaso de acero inoxidable
No 15 Hoja de bisturí estéril de acero al carbono	Swann-Morton	0205
Pinceles	Van Bleiswijck	Amazon B07W7KJQ2X	Se utiliza para manejar criosecciones
Rotulador permanente Negro	Klinipath/VWR	98307-R	Se utiliza para etiquetar portaobjetos
Pinza de fijación para perforaciones	F.S.T	18155-13
Caja de poliestireno			Al 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, utilizado como contenedor de nitrógeno líquido y para transportar las muestras al criostato
Mango de bisturí, 125 mm (5"), No. 3	Aesculap	BB073R
Vaso de acero inoxidable 10oz	Eboxer	B07GFCBPFH	Vaso para rellenar con isopenteno para la congelación muscular
Portaobjetos Superfrost Ultra Plus Pinzas quirúrgicas	ThermoFisher	J1800AMNZ
1/2 dientes	Medische Vakhandel	1303152	También llamadas "Pinzas de dientes de rata"
Tijeras de resorte Vannas - 3 mm Filo de corte	F.S.T	15000-00
Barcos de pesaje	VWR internacional	611-2249
Escáner de portaobjetos enteros para fluorescencia	Zeiss	Axio Scan.Z1
Reagents
Alexa Fluor 405 Cabra Anti-Ratón IgG2b	Sigma-Aldrich	SAB4600477	Utilizado a una concentración final de 1:500
Alexa Fluor 488 Cabra Anti-Ratón IgG1	ThermoFisher	A-21121	Utilizado en un concentración final de 1:500
Alexa Fluor 568 IgM anti-ratón de cabra Abcam		ab175702	Utilizado a una concentración final de 1:1.000
Alexa Fluor 647 anticuerpo secundario anti rata anti-IgG (H+L)	de cabra ThermoFisher	A-21247	Utilizado a una concentración final de 1:500
BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno)	ThermoFisher	D3922	Se utiliza a una concentración final de 1 & micro; g/mL
BODIPY-558/568 C12 (Ácido 4,4-Difluoro-5-(2-Thienil)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoico)	ThermoFisher	D3835	Utilizado en una concentración final de 1 µ g/mL
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol)	ThermoFisher	D1306	Utilizado a una concentración final de 0,5 µ g/mL
de dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D-8418	Se utiliza para disolver Bodipy para la solución madre de 1 mg/mL. PRECAUCIÓN: Tóxico e inflamable. Los vapores pueden causar irritación. Manipule en una campana extractora. Evite el contacto directo con la piel. Use guantes de goma, gafas protectoras para los ojos.
Solución de formaldehído al 4%, tamponada, pH 6,9	Sigma-Aldrich	1004969011	PRECAUCIÓN: Puede provocar una reacción alérgica en la piel. Se sospecha que causa defectos genéticos. Puede causar cáncer. Manipule en una campana extractora. Evite el contacto directo con la piel. Use guantes de goma, gafas protectoras para los ojos.
Isopentano GPR RectaPur	VWR international	24872.298	ATENCIÓN: Líquidos y vapores extremadamente inflamables. Puede ser mortal si se ingiere y entra en las vías respiratorias. Puede causar somnolencia o mareos. La exposición repetida puede causar sequedad o agrietamiento de la piel. Use guantes protectores/ropa protectora/protección para los ojos/protección facial.
Nitrógeno			PRECAUCIÓN: Extremadamente frío. Usa guantes. Manipule lentamente para minimizar la ebullición y las salpicaduras y en áreas bien ventiladas. Utilice recipientes diseñados para líquidos a baja temperatura.
Ratón sobre ratón Reactivo de bloqueo	Vector Labs	MKB-2213-1	Utilizado a una concentración de 1:30
Cadena pesada de miosina tipo I (anticuerpo primario BA-D5-s) Gen: MYH7, monoclonal bovino anti ratón IgG2b	DSHB Universidad de Iowa	BA-D5-sobrenadante	Utilizado a una concentración final de 1:10
Cadena pesada de miosina Tipo IIA (anticuerpo primario SC-71-s) Gen: MYH2, Monoclonal bovino anti ratón IgG1	DSHB Universidad de Iowa	SC-71-sobrenadante	Utilizado a una concentración final de 1:10
Cadena pesada de miosina tipo IIX (anticuerpo primario 6H1-s), Gen: MYH1, Monoclonal de conejo anti ratón IgM	Estudios del desarrollo Banco de hibridomas, Universidad de Iowa	6H1-sobrenadante	Utilizado en una concentración final de 1:5
Suero normal de cabra (NGS)	Vector Labs	S-1000
PBS 0.1 M			Comúnmente utilizado en laboratorios de histología
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36930
Anticuerpo primario (monoclonal) anti-Laminina-2 para ratas-Laminina-2 (&alfa;-2 cadenas)	Sigma-Aldrich	L0663	Utilizado en una concentración final de 1:1.000
Tejido Tek O.C.T	compuesto Sakura	4583
Software
Adobe Illustrator CC	Adobe Inc.		Se utiliza para diseñar las figuras:
Adobe Photoshop	Adobe Inc.		Software confocal
BioRender	https://biorender.com/		Utilizado para diseñar las figuras
Fiji/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/		Utilizado para analizar las imágenes adquiridas
Microsoft PowerPoint	Microsoft		Utilizado para reconstruir la histología de todo el músculo después de escanear los tipos de fibra
Zen Blue 2.6	Zeiss		Se utiliza para reconstruir la histología de todo el músculo después de escanear los tipos de fibra

Cámara seco40990151 líquido,

Referencias

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Correa-de-Araujo, R., et al. Myosteatosis in the context of skeletal muscle function deficit: an interdisciplinary workshop at the National Institute on Aging. Frontiers in Physiology. 11, 963(2020).
Miljkovic, I., et al.

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Lipid Droplets Fiber Type Analysis Myosteatosis Intramyocellular Lipid Confocal Microscopy Bodipy Staining Subcellular Distribution Immunohistochemistry Muscle Cryosection

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