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Artículo de método

Combinación de organoides humanos y tecnología organ-on-a-chip para modelar la funcionalidad específica de la región intestinal

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DOI:

10.3791/63724

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5 de mayo de 2022

 ,  ,  ,  , 
1Emulate Inc. Boston, 2Center for Stem Cell and Organoid Medicine, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 3Division of Pediatric General and Thoracic Surgery, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Los organoides intestinales derivados de biopsias y las tecnologías de organ-on-a-chips se combinan en una plataforma microfisiológica para recapitular la funcionalidad intestinal específica de la región.

Resumen

La mucosa intestinal es una barrera física y bioquímica compleja que cumple una miríada de funciones importantes. Permite el transporte, la absorción y el metabolismo de nutrientes y xenobióticos, al tiempo que facilita una relación simbiótica con la microbiota y restringe la invasión de microorganismos. La interacción funcional entre varios tipos de células y su entorno físico y bioquímico es vital para establecer y mantener la homeostasis del tejido intestinal. Modelar estas interacciones complejas y la fisiología intestinal integrada in vitro es un objetivo formidable con el potencial de transformar la forma en que se descubren y desarrollan nuevas dianas terapéuticas y candidatos a fármacos.

Los organoides y las tecnologías Organ-on-a-Chip se han combinado recientemente para generar chips intestinales relevantes para el ser humano adecuados para estudiar los aspectos funcionales de la fisiología intestinal y la fisiopatología in vitro. Los organoides derivados de las biopsias del intestino delgado (duodeno) y grueso se siembran en el compartimento superior de un chip de órgano y luego se expanden con éxito como monocapas mientras preservan las características celulares, moleculares y funcionales distintivas de cada región intestinal. Las células endoteliales microvasculares específicas del tejido del intestino humano se incorporan en el compartimento inferior del chip del órgano para recrear la interfaz epitelial-endotelial. Esta novedosa plataforma facilita la exposición luminal a nutrientes, fármacos y microorganismos, lo que permite estudios de transporte intestinal, permeabilidad e interacciones huésped-microbio.

Aquí, se proporciona un protocolo detallado para el establecimiento de chips intestinales que representan el duodeno humano (chip de duodeno) y el colon (chip de colon), y su posterior cultivo bajo flujo continuo y deformaciones similares a la peristalsis. Demostramos métodos para evaluar el metabolismo de fármacos y la inducción de CYP3A4 en chip duodeno utilizando inductores y sustratos prototípicos. Por último, proporcionamos un procedimiento paso a paso para el modelado in vitro de la interrupción de la barrera mediada por interferón gamma (IFNγ) (síndrome del intestino permeable) en un chip de colon, incluidos los métodos para evaluar la alteración de la permeabilidad paracelular, los cambios en la secreción de citoquinas y el perfil transcriptómico de las células dentro del chip.

Introducción

El intestino humano es un órgano complejo y multitarea capaz de autorregenerarse. Se divide en el intestino delgado y grueso. La función principal del intestino delgado es digerir aún más los alimentos que provienen del estómago, absorber todos los nutrientes y pasar el residuo al intestino grueso, que recupera el agua y los electrolitos. El intestino delgado se divide en múltiples regiones anatómicamente distintas: el duodeno, el yeyuno y el íleon, cada uno de los cuales está adaptado para realizar funciones específicas. Por ejemplo, el duodeno ayuda a descomponer el quimo (contenido del estómago) para permitir la absorción adecuada de nutrientes que involucran proteínas, carbohidratos, vitaminas y minerales en el yeyuno. Esta parte proximal del intestino delgado es también el sitio principal de absorción y metabolismo intestinal de fármacos, y se caracteriza por la mayor expresión de enzimas metabolizadoras de fármacos (por ejemplo, CYP3A4) en comparación con su expresión en el íleon y el colon1. Además de su papel principal en la digestión y absorción de nutrientes, el intestino también es una barrera eficaz contra los contenidos luminales potencialmente dañinos, como microorganismos patógenos, metabolitos microbianos, antígenos dietéticos y toxinas 2,3. Cabe destacar que el colon humano está habitado por una gran cantidad de microorganismos, muy superiores a los del total de células en el cuerpo humano, que proporcionan muchos beneficios a la nutrición, el metabolismo y la inmunidad. Por lo tanto, el mantenimiento de la integridad de la barrera mucosa formada por las células epiteliales intestinales es fundamental para permitir la relación simbiótica entre la microbiota intestinal y las células huésped separándolas físicamente para evitar la activación innecesaria de las células inmunes2. Además, la muerte celular intestinal programada juega un papel esencial como mecanismo de autoprotección que evita que las células infectadas persistan o proliferen, diseminando así patógenos potenciales3, mientras que la autorrenovación continua del epitelio intestinal cada cuatro a siete días compensa la pérdida celular asegurando la integridad de la barrera y la homeostasis tisular. Las alteraciones de las funciones intestinales descritas, incluida la absorción de nutrientes, la integridad de la barrera o el desequilibrio en la muerte celular intestinal y la autorrenovación, pueden dar lugar al desarrollo de una variedad de trastornos gastrointestinales, incluida la desnutrición y la enfermedad inflamatoria intestinal (EII)2,3.

Anteriormente, se han utilizado modelos animales y líneas celulares intestinales transformadas derivadas del cáncer para estudiar las funciones fisiológicas y fisiopatológicas del tejido intestinal humano. Sin embargo, las preocupaciones cada vez más prominentes sobre la traducibilidad de la investigación con animales a los seres humanos, causadas por la presencia de disparidades significativas entre las dos especies, destacaron la necesidad de métodos alternativos relevantes para los humanos4. Las líneas celulares intestinales in vitro comúnmente utilizadas incluyen células T84, Caco-2 y HT29. Si bien imitan ciertos aspectos de la función de barrera intestinal y el transporte de membrana, se caracterizan por una expresión alterada de las enzimas metabolizadoras de fármacos5, receptores de superficie y transportadores4. Además, carecen de especificidad del segmento intestinal y no logran recapitular la complejidad del epitelio intestinal, ya que cada modelo contiene solo uno de los cinco tipos de células epiteliales presentes en el intestino6.

Recientemente, los cultivos de organoides intestinales humanos establecidos a partir de biopsias frescas del intestino delgado y el colon 7,8 o células madre pluripotentes inducidas (iPSC)9 se introdujeron como modelos experimentales alternativos con potencial para complementar, reducir y tal vez reemplazar la experimentación con animales en el futuro. Si bien las iPSC se pueden obtener de manera no invasiva, el establecimiento de organoides a partir de iPSC requiere el uso de protocolos complejos y largos (con varios pasos experimentales) y genera cultivos que se asemejan al tejido fetal humano. Por el contrario, los organoides derivados de biopsias son altamente escalables, ya que pueden aprovechar la capacidad de renovación inherente del tejido intestinal y pueden pasarse y propagarse indefinidamente in vitro. Es importante destacar que los organoides derivados de biopsias mantienen las características específicas de la enfermedad y la región intestinal del tejido primario a partir del cual se desarrollaron y emulan la diversidad celular del epitelio intestinal. Los organoides se pueden utilizar como avatares específicos del paciente in vitro para desentrañar la biología y la patogénesis de diversos trastornos gastrointestinales y mejorar su manejo terapéutico. Aunque los organoides intestinales han alcanzado un grado impresionante de funcionalidad fisiológica, todavía no logran reproducir la complejidad de los órganos nativos debido a su falta de componentes estromales críticos, incluidos los vasos sanguíneos, el tejido conectivo, los nervios periféricos y las células inmunes, así como la estimulación mecánica. Se sabe que los parámetros mecánicos, como el flujo, la tensión cortante, el estiramiento y la presión, influyen en la morfogénesis tisular y la homeostasis in vivo y anteriormente se demostró que mejoran la maduración de las células in vitro 10,11,12,13. Un inconveniente importante adicional de los sistemas organoides es la inaccesibilidad de la luz y, por lo tanto, del lado apical del epitelio. Esto presenta un desafío para investigar varios mecanismos asociados con la expresión polarizada de los transportadores de iones y medicamentos, las interacciones huésped-microbioma y las pruebas de toxicidad farmacéutica. Por último, los cultivos de organoides sufren de una variabilidad considerable en tamaño, morfología y función, debido a la naturaleza estocástica del proceso de autoorganización in vitro y las elecciones de destino celular. Por lo tanto, para aprovechar todo el potencial de los organoides intestinales en el modelado de enfermedades, la detección de medicamentos y la medicina regenerativa, es necesario explorar nuevas estrategias que reduzcan la variabilidad en el desarrollo de organoides, mejoren el acceso al compartimiento luminal e incorporen las interacciones célula-célula faltantes.

La tecnología Organ-on-a-Chip ha introducido muchas técnicas para la incorporación de fuerzas mecánicas y flujo de fluidos a cultivos celulares intestinales in vitro. Sin embargo, dado que la mayoría de los estudios iniciales de prueba de concepto han utilizado líneas celulares derivadas del cáncer que no exhibieron suficiente diversidad celular, la relevancia de estos sistemas ha sido cuestionada. Recientemente, hemos combinado sinérgicamente organoides intestinales y tecnología organ-on-a-chip para incorporar las mejores características de cada enfoque en un sistema in vitro 14,15,16. El chip intestinal resultante recapitula la arquitectura multicelular del epitelio intestinal, la presencia de la interfaz del tejido epitelial-endotelial y las fuerzas mecánicas del flujo y estiramiento del fluido, lo que permite la emulación de las funciones a nivel de órganos in vitro. Además, el uso de organoides derivados de tejidos primarios (que se pueden muestrear de diferentes regiones del intestino humano) como material de partida aumenta la versatilidad de este modelo, ya que se pueden establecer chips que representan duodeno humano, yeyuno, íleon y colon siguiendo procedimientos similares de siembra y cultivo. Es importante destacar que los Chips Intestinales permiten la evaluación en tiempo real de: la integridad de la barrera intestinal; actividad del borde del cepillo y las enzimas del metabolismo de los medicamentos; producción de mucinas; secreción de citoquinas; e interacción de las células intestinales con microorganismos patógenos y comensales, como se demuestra en los informes publicados anteriormente. En particular, cuando se establecieron chips intestinales utilizando organoides generados a partir de tejido de diferentes individuos, estos modelos capturaron la variabilidad esperada entre donantes en las respuestas funcionales a diversos medicamentos y tratamientos. En conjunto, la fusión de organoides con la tecnología Organ-on-a-Chip abre la puerta a modelos más avanzados, personalizados e in vivo relevantes que podrían mejorar la relevancia fisiológica y la precisión de los hallazgos in vitro, así como su extrapolación a los humanos. Aquí, se presenta un protocolo detallado para establecer el chip intestinal y su aplicación en los estudios de funciones fisiológicas de los dos segmentos intestinales: duodeno y colon. En primer lugar, se describen los métodos para evaluar la actividad de la enzima metabolizadora de fármacos CYP3A4 en el chip duodeno, así como su inducción por compuestos prototípicos como la rifampicina y la vitamina D3. En segundo lugar, los pasos necesarios para modelar el "intestino permeable" en el chip de colon se describen en el protocolo, con la interrupción de la barrera epitelial que se realiza utilizando citoquinas distintivas implicadas en la patogénesis de la EII. Brevemente, los organoides derivados de biopsias humanas se propagan in vitro, se someten a digestión enzimática y se introducen en el canal superior del chip. En presencia de perfusión continua con medios enriquecidos con factor de crecimiento, se convierten en una monocapa epitelial confluente con arquitectura 3D y una superficie celular apical de fácil acceso. El compartimento inferior del chip "vascular" está sembrado con células endoteliales microvasculares aisladas del intestino delgado o grueso. El epitelio y el endotelio están separados por una membrana estirable porosa, que facilita las interacciones paracrinas entre los dos tejidos y, cuando se somete a deformaciones cíclicas, emula los movimientos similares a la peristalsis del intestino humano. El cocultivo se mantiene bajo las condiciones de flujo dinámico generado por la perfusión luminal y vascular con medios de cultivo celular apropiados. Finalmente, describimos numerosos tipos de ensayos y análisis de punto final que se pueden realizar directamente en chip o a partir de efluentes de cultivo celular muestreados.

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Protocolo

NOTA: Todos los cultivos celulares deben manejarse utilizando una técnica aséptica adecuada.

Los organoides intestinales humanos empleados en este estudio se obtuvieron de la Universidad Johns Hopkins y todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas y regulaciones aprobadas. Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Johns Hopkins (IRB #NA 00038329).

1. Preparación de los reactivos de cultivo celular

  1. Prepare el medio de crecimiento de organoides humanos siguiendo las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales) y suplementarlo con 100 μg / ml de primocina.
  2. Preparar el medio de crecimiento de células endoteliales microvasculares humanas siguiendo las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales) y complementar con 1:20 vol/vol FBS y 50 μg/ml en lugar de 100 μg/ml de primocina.
  3. Resuspend Y-27632 (Rho-kinase Inhibitor) en BSA estéril al 0,1% en DPBS para preparar una solución madre de 10 mM. Alícuota en microtubos estériles y guárdela a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
  4. Resuspend CHIR99021 (inhibidor de GSK-3) en dimetilsulfóxido estéril (DMSO) para preparar una solución madre de 5 mM. Alícuota en microtubos estériles y guárdela a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
  5. Prepare la solución de digestión organoide humana mezclando una solución de disociación de organoides 1:1 vol/vol (Tabla de Materiales) con solución DPBS (Tabla de Materiales) y complementándola con una solución madre de 10 μM de Y-27632. Este reactivo debe hacerse fresco para cada uso.

2. Cultivo de células endoteliales microvasculares intestinales humanas (HIMEC)

  1. Iniciar el cultivo HIMEC (Tabla de Materiales) 7 días antes de sembrarlo en el chip. Solo los HIMEC en el pasaje 1-6 se pueden usar para la siembra de chips.
  2. Añadir 5 ml de la solución de factor de fijación (tabla de materiales) a un matraz T150; incubar a 37 °C durante 1 min y desechar la solución.
  3. Añadir al matraz 19 ml de medio de crecimiento de células endoteliales precalentado a temperatura ambiente (ver paso 1.2).
  4. Descongele un vial congelado de HIMEC (2 millones de células/vial) en un baño de agua a 37 °C.
  5. Transfiera el contenido del vial al matraz y meca suavemente el matraz para distribuir las células de manera uniforme. Coloque el matraz en una incubadora de 37 °C durante la noche para permitir que las células endoteliales se adhieran.
  6. Reemplace el medio con 20 ml de medio de crecimiento de células endoteliales precalentado a temperatura ambiente al día siguiente y cada 3 días a partir de entonces. Los cultivos deben alcanzar el 90% de la confluencia el día de la cosecha celular para los experimentos con chips.

3. Microfabricación y preparación del chip

  1. Obtener chips de un proveedor comercial (Tabla de Materiales). Desembala las virutas y colócalas en la cuna de las virutas colocada en una placa de Petri cuadrada (Tabla de Materiales). Etiquete la parte frontal de cada portador de chip con las condiciones experimentales (Figura 1A).
    NOTA: Si bien el protocolo presentado se basa en el uso de un chip e instrumentación específicos disponibles comercialmente, hay varios dispositivos microfluídicos ofrecidos a través de diferentes proveedores, que pueden ofrecer ventajas alternativas pero carecen de la capacidad de incorporar estiramiento. Además, la microfabricación de los Órganos-en-Chips se puede realizar "in house" siguiendo los procedimientos descritos en Huh et al.21.

4. Activación y recubrimiento ECM de la membrana

  1. Preparación de la solución de activación
    1. Lleve los reactivos ER-1 y ER-2 (Tabla de Materiales) a temperatura ambiente para equilibrarlos antes de su uso. ER-1 es sensible a la luz y debe manejarse en la oscuridad.
    2. Reconstituir ER-1 en 10 ml de reactivo ER-2 para hacer una concentración final de 0,5 mg/ml y confirmar que el ER-1 está completamente disuelto.
  2. Activación de la superficie
    1. Empuje suavemente 50 μL de la solución ER-1 a través de ambos canales del chip (Figura 1A).
    2. Retire cualquier exceso de solución ER-1 de la superficie del chip con un aspirador.
    3. Inspeccione los chips para asegurarse de que todos los chips hayan recibido la solución ER-1. En caso de burbujas de aire, introduzca más solución ER-1 hasta que las burbujas se eliminen por completo.
    4. Incubar los chips dentro de la cámara de la lámpara UV (Tabla de Materiales) durante 15 min. Confirme que la lámpara UV está configurada en el ajuste Consistente.
    5. Lleve los chips activados por ER-1 de vuelta al gabinete de bioseguridad (BSC). Aspire la solución ER-1 desde ambos canales. Lavar cualquier residuo de la solución ER-1 con 200 μL de ER-2.
    6. Empuje 200 μL de solución salina tamponada con fosfato (DBPS) estéril de Dulbecco a través de los canales (Tabla de Materiales) y deje DBPS en los canales hasta el siguiente paso.
  3. Preparación de matriz extracelular (ECM) y recubrimiento de membrana
    1. Preparación de soluciones de stock de componentes ECM
      1. Reconstituir colágeno IV (Tabla de Materiales) y fibronectina (Tabla de Materiales) utilizando agua estéril de grado de cultivo celular (Tabla de Materiales) a una concentración final de 1 mg/ml. Preparar alícuotas y conservarlas a -20°C hasta su uso.
    2. Preparación de la solución de trabajo ECM para el recubrimiento de membranas
      1. Prepare 1,5 ml de cada solución de ECM para el canal superior e inferior por cada 12 chips que se recubrirán. La solución ECM siempre debe prepararse justo antes de su uso.
      2. Para el canal superior, mezcle colágeno IV y matriz de membrana basal solubilizada (BMM) (Tabla de Materiales) en DBPS frío estéril a 200 μg / ml y 100 μg / ml, respectivamente. Para el canal inferior, mezcle colágeno IV y fibronectina en DPBS frío estéril a 200 μg/mL y 30 μg/mL, respectivamente.
    3. Recubrimiento ECM de los chips
      1. Aspire el DBPS de ambos canales de los chips y reemplácelo con la solución de trabajo ECM adecuada para cada canal (Figura 1A).
      2. Inspeccione cada chip para asegurarse de que ha recibido la solución de recubrimiento. En caso de burbujas de aire, empuje a través de más solución de recubrimiento hasta que todas las burbujas se eliminen por completo.
      3. Agregue DPBS estériles a la base de virutas y coloque la placa de Petri que contiene las virutas en una incubadora de 37 °C. Incubar durante la noche para permitir que las proteínas ECM formen enlaces iónicos con la membrana PDMS activada. Si se desea, las células se pueden sembrar en cualquier momento entre 2 h y 1 día después del recubrimiento de las virutas. Alternativamente, los chips recubiertos se pueden almacenar a 4 ° C durante la noche, seguidos de la incubación durante la noche a 37 ° C y la siembra de chips.

5. Siembra de células endoteliales microvasculares intestinales (HIMEC) en el canal inferior del chip

NOTA: Los HIMEC del intestino delgado y el colon se siembran en el canal inferior del duodeno y el chip de colon, respectivamente.

  1. Preparar fichas
    1. Transfiera los chips recubiertos de ECM al BSC. Aspire suavemente el recubrimiento ECM de ambos canales de los chips, y luego lave ambos canales con 200 μL de medio de crecimiento organoide y medio de crecimiento de células endoteliales, respectivamente.
    2. Guarde las virutas lavadas en una incubadora de 37 ° C hasta proceder con la siembra de células endoteliales.
  2. Cosechar las células endoteliales
    1. Lleve el matraz de cultivo HIMEC al BSC y lávelo con DPBS estéril.
    2. Agregue 3 ml de solución de disociación al matraz y colóquelo en la incubadora de 37 ° C durante 2 minutos para permitir el desprendimiento completo de la célula.
    3. Recolecte las células en un tubo cónico de 15 ml y agregue medios de crecimiento de células endoteliales hasta que alcance los 10 ml. Muestra 15-20 μL de la suspensión celular para el conteo celular. Centrifugadora a 150 x g durante 5 min.
    4. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender los HIMEC a una densidad de 8-10 x 106 células / ml en medios de crecimiento de células endoteliales.
  3. Sembrar células endoteliales en el canal inferior del chip
    1. Lleve la placa de Petri que contiene los chips al BSC y retire suavemente todos los medios del canal inferior con una pipeta de 1.000 μL.
    2. Introducir 10-15 μL de la suspensión HIMEC en el canal inferior del chip. Inspeccione el chip inmediatamente después de la siembra para garantizar una densidad de siembra óptima (80% -90% de cobertura) y una distribución celular homogénea dentro del canal (Figura 1D). Si la densidad de siembra es mayor o menor de lo esperado o desigual, lave el canal 2x con 200 μL de medios de crecimiento de células endoteliales y repita el procedimiento de siembra.
    3. Invierta la placa de Petri inmediatamente después de sembrar cada lote de seis chips para permitir la unión de células endoteliales a la parte inferior de la membrana PDMS. Coloque las placas de Petri en la incubadora de 37 °C durante 30 minutos a 1 h, o hasta que los HIMEC en el canal inferior se hayan unido a la membrana (Figura 1D).
  4. Lavar las patatas fritas
    1. Empuje suavemente 200 μL de medios de crecimiento de células endoteliales a través de la entrada del canal inferior para eliminar las células no unidas y reponer los nutrientes en los medios.
    2. Lave las células que no se unieron en el canal superior con 200 μL de medio de crecimiento organoide suplementado con 5 μM CHIR99021 y 10 μM Y-27632.
    3. Coloque las virutas en la incubadora de 37 ° C hasta proceder a la siembra de células epiteliales.

6. Siembra de fragmentos organoides en el canal superior del chip

NOTA: Los organoides aislados de biopsias de varias regiones intestinales se pueden cultivar en el chip intestinal7. Seguir los procedimientos descritos en Fujii et al. para el aislamiento de criptas intestinales humanas y el establecimiento de cultivos de organoides22. Aquí, los organoides duodenales y colónicos se utilizan para generar los chips de duodeno y colon, respectivamente. Dada la alta variabilidad de lote a lote y de donante a donante en la formación y el crecimiento de organoides, se sugiere realizar una evaluación piloto de la densidad celular en el cultivo de suspensión de organoides (formato de placa de 24 pocillos) para lograr la densidad de siembra óptima de 8 millones de células / ml.

  1. Evaluación piloto del número de células/pozo del cultivo de organoides estáticos.
    NOTA: El siguiente procedimiento es únicamente para determinar el número de pocillos de cultivo de suspensión de organoides requeridos para la siembra de virutas. Las células individuales resultantes no deben usarse para la siembra de chips.
    1. Aspire cuidadosamente el sobrenadante de tres pocillos de la placa de cultivo de organoides. Agregue 500 μL de solución de disociación de BMM helada (Tabla de materiales) a cada pozo y use un raspador de plástico para separar el BMM solubilizado del plástico.
    2. Recoger la suspensión organoide en un tubo cónico estéril de baja unión a proteínas utilizando una pipeta helada de 1.000 μL. Incubar en hielo durante 60 min, mezclando cada 15 min agitando suavemente el tubo. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4°C.
    3. Aspire el sobrenadante y agregue 2 ml de tripsina. Incubar a 37°C durante 30 min para digerir los organoides al nivel unicelular y añadir 10 mL de medio de crecimiento organoide completo para detener la reacción enzimática. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4°C.
    4. Resuspender el pellet celular en 1 ml de medio de crecimiento organoide completo y contar el número total de células utilizando un hematocitómetro de acuerdo con los métodos estándar.
  2. Preparación de fragmentos organoides y su siembra en el chip
    NOTA: Los siguientes procedimientos se pueden utilizar para sembrar organoides duodenales o colónicos en el canal superior del chip. El establecimiento de una monocapa epitelial con una citoarquitectura 3D relevante in vivo está supeditado a la presencia de flujo15,23 y a la siembra exitosa de fragmentos organoides.
    1. Aspire cuidadosamente el medio a partir del número de pocillos del cultivo de organoides estáticos, que es suficiente, según lo determinado en el paso 6.1, para lograr una densidad de siembra final de 8 millones de células / ml. Agregue 500 μL de solución de disociación BMM helada a cada pozo.
    2. Separe el BMM solubilizado de la superficie de los pozos utilizando un raspador de plástico o una pipeta de 1.000 μL. Recoja la suspensión en un tubo cónico de baja unión a proteínas de 15 ml.
    3. Guarde la suspensión en hielo durante 60 minutos, mezclando cada 15 minutos agitando suavemente el tubo. Proceder a la centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4°C. Un gránulo organoide bien definido debe ser visible después de la centrifugación. Si se observa una capa de gel transparente por encima del gránulo celular (residuos de BMM solubilizado) (Figura 1B), continúe con los siguientes pasos.
      1. Mezcle el sobrenadante y el gránulo celular y agregue un volumen igual de solución de disociación BMM en el tubo. Mezcle suavemente y almacene en hielo durante 10 minutos adicionales, y proceda a la centrifugación a 300 x g durante 5 minutos a 4 ° C.
      2. Si es necesario, repita el paso 6.2.3.1 hasta que no haya residuos de BMM solubilizados.
    4. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo organoide con una solución de digestión organoide (ver paso 1.5). Utilice un volumen suficiente de solución de digestión organoide para asegurar la inmersión completa del pellet. 2 ml de solución es apropiado para aproximadamente 2.400-12.000 organoides de tamaño mediano (Figura 1D, Post-Siembra). Incubar a 37°C durante 1-3 min.
    5. Agregue DMEM/F-12 avanzado al tubo para detener la reacción enzimática. Use cuatro veces el volumen de la solución de digestión utilizada. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4°C.
    6. Aspirar el sobrenadante y resuspendir los fragmentos organoides en un medio de crecimiento organoide completo suplementado con 5 μM CHIR99021 y 10 μM Y-27632 para lograr 8 millones de células/ml. Preparar alícuotas de 360 μL de la suspensión en tubos estériles de baja unión a proteínas de 1,5 ml para evitar la reducción de la densidad celular debido a la unión en las paredes.
    7. Retire el medio del canal superior de las virutas recubiertas. Añadir 30 μL de suspensión celular en el canal superior de cada chip. Incubar los chips durante la noche en una incubadora de 37 ° C para permitir que los fragmentos organoides se adhieran a la membrana recubierta de ECM (Figura 1D).

7. Cultivo dinámico de chip intestinal - iniciación y mantenimiento del flujo y movimientos similares a la peristalsis

  1. Preparación de medios y desgasificación
    1. Para mantener un flujo laminar constante a través del chip, permita que la temperatura del medio se equilibre a temperatura ambiente y luego sumérjala a filtración impulsada por vacío durante 10 minutos utilizando una bomba de vacío y tubos cónicos de filtro de PVDF (desgasificación de medios).
  2. Cebado de módulos portátiles
    NOTA: Los módulos portátiles son reservorios que actúan como una interfaz entre los chips y el módulo de cultivo que permite repetir el muestreo y la dosificación de los medios.
    1. Abra los módulos portátiles, en el BSC, y colóquelos en las bandejas de módulos de cultivo, que son contenedores especializados para la alineación de los módulos portátiles.
    2. Agregue 3 ml de medio de crecimiento organoide completo preequilibrado complementado con 5 μM CHIR99021 y 10 μM Y-27632 al reservorio de entrada superior y 3 ml de medio de crecimiento de células endoteliales preequilibrado en el reservorio de entrada inferior (Figura 1C). Añadir 300 μL del mismo medio en los respectivos depósitos de salida.
    3. Lleve las bandejas a la incubadora de 37°C y deslícelas en el módulo de cultivo (Figura 1C). Utilice los controles en la pantalla del módulo de cultivo para ejecutar el "Prime Cycle" (1 minuto de duración). Cuando la barra de estado indica "Listo", se completa el ciclo Prime. Repita el ciclo Prime para asegurarse de que se hayan formado suficientes gotas para conectar con éxito los chips.
    4. Asegúrese de que todos los módulos portátiles estén cebados y tengan gotas de medios visibles.
  3. Introducción del flujo
    NOTA: El flujo generalmente se inicia 24 h después de sembrar fragmentos organoides para permitir que las células epiteliales intestinales se adhieran firmemente a la membrana.
    1. Lave ambos canales de las virutas sembradas con 200 μL de los medios respectivos para eliminar cualquier burbuja o residuo celular. Deje pequeñas gotas de medios en los puertos después del lavado. Deslice el portador del chip en el módulo portátil (Figura 1C).
    2. Coloque los módulos portátiles en las bandejas y, a continuación, en el módulo de cultivo. Utilice los controles en la pantalla del módulo de cultivo para programar las condiciones de cultivo de chip de órganos apropiadas (caudal y estiramiento).
      NOTA: Para condiciones estándar de cultivo de chip de duodeno y colon, establezca el caudal en 30 μL/h15 y 60 μL/h16 respectivamente, tanto para los canales superior como inferior. Sin embargo, los caudales de cada canal se controlan de forma independiente y se pueden ajustar entre 0-1.000 μL/h. Se pueden utilizar jeringas o bombas peristálticas, en lugar de los módulos de cultivo presentados aquí, para introducir el flujo laminar a los chips microfluídicos. Sin embargo, el establecimiento de conexiones fluidas confiables entre chips y bombas utilizando tubos y conectores puede ser técnicamente un desafío cuando se requiere la perfusión simultánea de múltiples chips.
    3. Inicie el "Ciclo de Regulación" (2 h de duración) que presuriza los medios de cultivo en módulo portátil y chip para evitar la nucleación de las burbujas de aire. Las condiciones programadas se reanudarán después de la finalización del Ciclo de Regulación.
  4. Cambio de medios
    1. Prepare medios frescos para ambos canales y reponga cada 48 h agregando 2 ml de medio fresco a los depósitos de entrada (Figura 1C).
    2. Pausar los módulos de cultivo y llevar las bandejas a BSC. Aspirar medios en todos los reservorios y reponer con medios frescos. Vuelva a traer las bandejas y reinicie el flujo.
  5. Introducción del estiramiento
    NOTA: Permita que las células crezcan hasta el 100% de confluencia antes de la aplicación de la cepa cíclica. El estiramiento se introduce típicamente 3 días después de la siembra o 48 h después del inicio del cultivo fluídico. La tensión cíclica al 2% a la frecuencia de 0.2 o 0.15 Hz, para el chip intestinal duodeno11 y colon24 , respectivamente, se aplica durante las 24 h iniciales. Luego se aumenta aún más al 10% durante la duración restante del cultivo de chips intestinales para parecerse mucho a la cepa cíclica experimentada por las células epiteliales intestinales in vivo (Figura 1D)25. El módulo de cultivo puede admitir la aplicación de una cepa cíclica del 2% al 12% y una frecuencia de hasta 0,4 Hz.
    1. Para introducir el estiramiento en el cultivo fluídico en curso, detenga el módulo de cultivo. Con los controles de la pantalla, cambie la configuración de estiramiento al 2% de estiramiento, frecuencia de 0,2 o 0,15 Hz y reinicie el módulo de referencia cultural.
    2. Después de 24 h, repita el paso 7.5.1 para aplicar un estiramiento del 10%, 0.2 o 0.15 Hz de frecuencia.

8. Inducción de CYP450 utilizando inductores prototípicos de CYP en el chip de duodeno

NOTA: El ensayo de inducción del citocromo P450 (CYP450) permite evaluar si el compuesto de prueba aumenta los niveles de ARNm y/o la actividad catalítica de enzimas específicas del CYP450. Aquí, describimos el protocolo para la evaluación de la inducción de CYP3A4 por el estándar de la industria y el regulador recomendado in vitro inductores de CYP, rifampicina (RIF) y 1,2-dihidroxi vitamina D3 (VD3). El método presentado se puede utilizar para identificar el potencial de varios compuestos de prueba para inducir diferentes isoformas de CYP450 en el tejido intestinal humano. Se deberán seleccionar conjuntos específicos de cebadores y sustrato de sonda para cada isoforma enzimática que se evaluará.

  1. Exposición a inductores de CYP
    1. Prepare soluciones de stock de 20 mM RIF, 100 mM VD3 y 200 mM de testosterona (Tabla de materiales) utilizando DMSO estéril.
      PRECAUCIÓN: La testosterona es una sustancia controlada de la Lista III. Siga los procedimientos reglamentarios durante el manejo.
    2. Preparar medios dosificadores con inductores de CYP diluyendo las soluciones madre en medio de crecimiento organoide completo y medio de crecimiento de células endoteliales para lograr 20 μM RIF, 100 nmol/L de VD3. Preparar el control del vehículo diluyendo DMSO en los medios respectivos para lograr el 0.1% de DMSO.
    3. Pausa el módulo de cultivo y lleva las bandejas al BSC. Reemplace el medio en todos los depósitos de entrada con 2 ml de medios de dosificación con inductores o control del vehículo. Devuelva los módulos portátiles al módulo de cultivo y reinicie el flujo a 30 μL/h.
    4. Después de 24 h, reemplace el medio con solución inductora y repita los pasos 8.1.2-8.1.3. Las soluciones inductoras deben prepararse frescas diariamente y reponerse cada 24 h en el transcurso del experimento, que generalmente dura 48-72 h.
  2. Incubación con un sustrato prototípico (testosterona)
    1. El día de la cosecha, prepare la solución de sustrato de sonda de testosterona junto con los inductores correspondientes en ADVANCED DMEM / F12 para obtener una concentración final de 200 μM. Omita la adición del suero al medio, ya que esto puede interferir con el análisis LCMS.
    2. Lleve las bandejas al BSC y aspire el medio de dosificación de todos los depósitos. Lave y reemplace los depósitos de entrada superior e inferior con medio avanzado AVANZADO /F12 caliente y medio de crecimiento de células endoteliales, respectivamente.
    3. Retire el medio de lavado de los depósitos y reemplácelo con 1 ml de solución de sustrato de sonda, preparada en la etapa 8.2.1. Perfundir las virutas a un alto caudal de 1.000 μL/h durante 5 min y aspirar los depósitos de salida superior e inferior. Devolver las virutas al módulo de cultivo e incubar durante 1 h bajo el flujo constante de 300 μL/h.
  3. Análisis de datos
    1. Recogida de muestras para análisis LCMS
      1. Alícuota 200 μL de solución de parada que contenga acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1% en tubos de 1,5 ml premarcados y colóquelos sobre hielo. La composición de la solución de parada de LCMS puede variar según el sustrato que deba analizarse.
      2. Después de completar 1 h de tratamiento, detenga el flujo y lleve las bandejas de vuelta a BSC. Recoger 100 μL de efluente del depósito de salida superior y añadirlo al tubo correspondiente que contiene la solución de parada (Figura 2A). Coloque los tubos inmediatamente sobre hielo seco. Almacene las muestras a -80 °C antes de proceder al análisis.
      3. Extraiga y analice muestras mediante el uso de técnicas HPLC o LC-MS / MS, monitoreando la formación del metabolito-6β-hidroxitestosterona (6β-OH-T). La actividad de la enzima CYP se puede expresar como proteína pmol/min/mg donde pmol se refiere a la cantidad de metabolito (6β-OH-T) formado durante la reacción. El contenido total de proteína por chip (proteína; mg) se determina mediante la realización de un ensayo de Bradford descrito en el paso 8.3.2.
        figure-protocol-1
        La actividad de plegado-inducción se calcula por: actividad CYP (inducida) / actividad CYP (vehículo).
      4. Si se recogen muestras para el análisis de ARNm, consulte el paso 8.3.3.
    2. Lisis de las células para el análisis de la expresión de proteínas
      NOTA: La extracción de proteínas de las células en chip se realiza utilizando un tampón de lisis de proteínas, complementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa (Tabla de Materiales). La proteína extraída se cuantifica utilizando el ensayo de Bradford y se utiliza en el análisis aguas abajo.
      1. Separe los chips de los módulos portátiles y colóquelos en una placa de Petri. Lave ambos canales con 200 μL de DPBS estéril.
      2. Bloquee la salida del canal inferior con una punta de pipeta de filtro de 200 μL. Perfundir 50 μL de la solución de disociación a través del canal inferior e incubar durante 2 min a temperatura ambiente.
      3. Inspeccione para confirmar el desprendimiento completo de las células endoteliales. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 1-2 veces y retire la solución de disociación del canal. Repetir el lavado.
      4. Bloquee la salida del canal superior con una punta de pipeta de filtro de 200 μL. Perfuse 75 μL de tampón de lisis proteica a través del canal superior. Deje la punta de la pipeta insertada, para bloquear la entrada del canal superior e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Pipetee hacia arriba y hacia abajo 5-10 veces y recoja los lisados celulares en un tubo de 1.5 ml preetiquetado.
      5. Repita el paso 8.3.2.4. hasta que se observe el desprendimiento completo de las células. Recoger los lisados celulares en el mismo tubo de 1,5 ml y almacenarlos a -80 °C hasta su análisis.
      6. Extraiga la fracción de proteína de acuerdo con los métodos estándar y cuantifique la proteína total utilizando el ensayo bradford (Tabla de materiales).
    3. Lisis de las células para el análisis de expresión génica
      NOTA: La lisis celular en chip para la extracción de ARN se puede lograr utilizando un tampón de lisis de ARN, complementado con 0.1% de 2-mercaptoetanol (Tabla de Materiales). Alternativamente, se puede utilizar un tampón de lisis de ARN a base de fenol si se requieren altos rendimientos de ARN de alta calidad adecuados para el análisis de NGS y microarrays.
      1. Siga los pasos 8.3.2.1 a 8.3.2.2 para preparar el chip intestinal para la lisis.
      2. Bloquee la salida del canal superior con una punta de pipeta de filtro de 200 μL. Perfusa 150 μL de tampón de lisis de ARN a través del canal superior. Deje la punta de la pipeta insertada para bloquear la entrada del canal superior. Incubar durante 2 min a temperatura ambiente. Para la lisis utilizando un tampón de lisis de ARN basado en fenol, use 350 μL del reactivo.
      3. Pipete hacia arriba y hacia abajo 5-10 veces y recoja los lisados celulares en un tubo preetiquetado de 1.5 ml. Repita el paso con otros 150 μL de tampón de lisis de ARN y recoja. Conservar los lisados celulares a -80 °C hasta su análisis. En caso de análisis posterior de secuenciación de ARN, proceda con el análisis dentro de 1 mes después del lisado.
      4. Extraiga el ARN total de los lisados celulares utilizando un kit de purificación de ARN.
      5. Transcribir inversamente en ADNc utilizando un kit de transcriptasa inversa y realizar PCR en tiempo real utilizando un ciclador de PCR en tiempo real y los cebadores y búfer adecuados. Cuantificar los resultados utilizando el método 2-ΔΔCt .

9. Interrupción de la barrera epitelial usando citoquinas proinflamatorias en chip de colon

NOTA: Este protocolo describe la alteración de la barrera epitelial intestinal por la citoquina interferón gamma (IFNγ)26,27,28,29. La citoquina se dosifica en el canal inferior del chip de colon dada la expresión basolateral del receptor IFNγ en las células epiteliales intestinales.  El estímulo proinflamatorio se introduce en el chip el día 5 del cultivo, tan pronto como laaplicación P se ha estabilizado por debajo de 0,5 x 10-6 cm / s. Se puede usar un régimen de dosificación similar para otras citoquinas proinflamatorias y agentes disruptivos de barrera.

  1. Estimulación con IFNγ
    1. Preparar una solución madre de 100 μg/ml de IFNγ (Tabla de Materiales) en agua de cultivo celular estéril. Almacene la solución madre a -80 °C en el transcurso del experimento. Para cada experimento, utilice siempre un caldo fresco de IFNγ y evite más de tres ciclos de congelación y descongelación.
    2. Preparar la solución dosificadora de IFNγ diluyendo la solución madre en medio de crecimiento de células endoteliales desgasificadas para lograr una concentración final de 10-100 ng/mL.
    3. Lleve las bandejas al BSC y retire el medio de los depósitos de entrada del canal inferior y reemplácelo con 3 ml del medio que contiene IFNγ. Actualice el medio de dosificación ifnγ diariamente.
    4. Coloque las bandejas en el módulo de cultivo y perfunda las virutas a un alto caudal de 1.000 μL/h durante 5 min para iniciar el tratamiento con IFNγ. Vuelva a cambiar el caudal a 60 μL/h y continúe con el cultivo fluídico.
  2. Análisis de datos
    1. Evaluación de la función de barrera epitelial. La permeabilidad aparente epitelial (Papp), o función de barrera, se puede medir en varios puntos temporales del cultivo después del tratamiento con IFNγ, en los medios de efluentes de los depósitos de entrada y salida de ambos canales. El trazador fluorescente debe agregarse al medio de crecimiento organoide del canal superior 4 h antes de la evaluación de laaplicación P. Por lo general, 3 kDa Dextran Cascade Blue se utiliza como trazador fluorescente y se agrega en el medio 24 h antes.
      1. Pausa el módulo de cultivo y lleva las bandejas al BSC.
      2. Etiquete y prepare una placa de paredes negras de 96 pocillos con 100 μL de DPBS por pozo. Utilizando una pipeta multicanal de 200 μL, recoger y añadir 50 μL de efluente de todos los embalses a los pozos respectivos (Figura 2B).
      3. Para preparar la curva estándar, diluya el medio que contiene 100 μg/mL de dextrano Cascade Blue 1:3 de 3 kDa en DPBS. Posteriormente realizar diluciones seriadas utilizando una dilución triple del medio de crecimiento de células endoteliales en DPBS.
      4. Lea la fluorescencia a 375 nm de excitación y 420 nm de emisión utilizando un lector de placas. Utilice los valores de OD medidos para calcular la permeabilidad aparente (aplicación P) de la siguiente manera:
        figure-protocol-2
    2. Tinción de inmunofluorescencia de células en chip
      1. Lavar con 200 μL de DPBS para cada canal, tres veces.
      2. Perfundir 200 μL de la solución fijadora (4% PFA en DPBS) en cada canal. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
      3. Repita el paso de lavado 9.2.2.1. En esta etapa, las virutas lavadas se pueden almacenar hasta por 7 días a 4 ° C.
      4. Permeabilizar las células utilizando 200 μL de solución de permeabilización (0,1% Triton-X 100 en suero de burro normal al 10% en DPBS) para cada canal. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Repita el paso de lavado 9.2.2.1.
      5. Bloquee las células en el chip utilizando 200 μL de solución de bloqueo (10% NDS en DPBS) para cada canal. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
      6. Diluir los anticuerpos primarios en solución de anticuerpos (5% NDS en DPBS) de la siguiente manera: anti-Zonula Occludens 1 (ZO-1) (1:100, marcador de unión estrecha epitelial), anti-Ocludina (1:100, marcador de unión estrecha epitelial), anti-Claudina 4 (1:100, marcador de unión estrecha epitelial), anti-E-cadherina (1:100, marcador de uniones adherentes epiteliales (Tabla de Materiales). Perfundir 200 μL de la solución primaria de anticuerpos a través de cada canal e incubar durante la noche a 4 °C. Repita el paso de lavado 9.2.2.1.
      7. Diluir los anticuerpos secundarios en solución de anticuerpos (1:300, NDS al 5% en DPBS). Perfundir 200 μL de esta solución a través de cada canal e incubar durante 2 h a temperatura ambiente. Repita el paso de lavado 9.2.2.1. Si se desea, se puede agregar faloidina, un marcador citoesquelético, a la solución secundaria de anticuerpos.
      8. Preparar una solución de 50 μg/ml de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en DPBS y utilizarla para perfundir 200 μL a través de cada canal. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min. Repita el paso de lavado. En este punto, las virutas teñidas se pueden almacenar hasta 14 días a 4 ° C.
    3. Evaluación de la escisión de Caspasa 3
      1. Aislar y cuantificar la cantidad total de proteína de las células epiteliales como se describe en el paso 8.3.2. Omita el paso de lavado 8.3.2.1. Diluir las muestras con DPBS a una concentración final de 400 μg/ml.
      2. Cuantificar los niveles de caspasa 3 total y escindida utilizando el kit de detección de caspasa 3 siguiendo el protocolo del fabricante.
    4. Evaluación de la secreción de citoquinas proinflamatorias
      1. Utilice los efluentes recogidos de la salida de ambos canales del chip de colon para cuantificar las citoquinas proinflamatorias de fase aguda secretadas, siguiendo los protocolos proporcionados por el fabricante. Realice una dilución de 5 veces para V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit y una dilución doble para V-PLEX Human Proinflammatory Panel II.

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Resultados

La Figura 1D resume la línea de tiempo del cultivo de chips intestinales e ilustra las células endoteliales intestinales y los organoides antes y después de la siembra en el chip. Además, demuestra las diferencias morfológicas distintivas entre las virutas de duodeno y colon, destacadas por la presencia de formaciones similares a vellosidades en la vilipruta de duodeno y representativas de la arquitectura del intestino delgado.

La Figura 3A

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Discusión

La combinación de la tecnología de órganos en un chip y los organoides intestinales es prometedora para el modelado preciso de la fisiología intestinal humana y la fisiopatología. Aquí, proporcionamos un protocolo paso a paso simple y robusto (descrito en la Figura 1) para el establecimiento del chip intestinal que contiene epitelio intestinal delgado o colónico derivado de la biopsia y células endoteliales microvasculares intestinales cocultivadas en un dispositivo microfluídico. Esta simul...

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Divulgaciones

Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi y Magdalena Kasendra son empleadas actuales o anteriores de Emulate Inc. y pueden tener acciones. Emulate Inc. es la compañía que fabrica los dispositivos de chips de órganos y ha publicado patentes relevantes para el trabajo establecido en este artículo.

Agradecimientos

Agradecemos al profesor Mark Donowitz por proporcionar los organoides derivados de la biopsia intestinal y a Brett Clair por diseñar las ilustraciones científicas del chip, el módulo portátil y de cultivo. Todo el resto de las ilustraciones científicas se generaron utilizando el BioRender.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
intestino delgado Células endoteliales microvasculares del intestino humanoAlphaBioRegenALHE150,5 células M/ml ; colon criopreservado
Células endoteliales microvasculares intestinales humanasAlphaBioRegenALHE160,5 células M/ml ;
Organoides duodenales humanos derivados de biopsiasde John Hopkin-Los organoides fueron proporcionados por el profesor Mark Donowitz (número de la Junta de Revisión Institucional: NA_00038329).
Organoides de colon humano derivadosde biopsia John Hopkin's University:los organoides fueron proporcionados por el profesor Mark Donowitz (número de la Junta de Revisión Institucional: NA_00038329).
Zoë CM-1 y comercio;   Módulo de CulturaEmulate Inc.-Módulo de cultura
Orb-HM1™   Emular módulo deconcentrador Inc.-5% de CO2, estiramiento al vacío y fuente
de alimentación Chip-S1™ Emular chip estirable Inc.-Pod de chips de órgano
; Módulos PortátilesEmulate Inc.-Módulo portátil
Caja de luz ultravioletaEmulate Inc.--
Emular cuna de chips Inc.-1 por plato de cultivo cuadrado
Steriflip®-HV FiltrosEMD MilliporeSE1M003M000.45  μ m  Plato
cultivo de célula cuadrada con filtro de PVDF (120 x 120 mm)VWR82051-068-Handheld
  vacío  aspiradorCorning4930 -
Aspirante  pipetasCorning / Falcon3575582 mL,  poliestireno, individualmente 
envuelto Puntas de aspiración -Estéril (esterilizado en autoclave)
Serológico  pipetas -2 mL, 5 mL,  10 mL,  y  25 mL  baja endotoxina, estéril
PipetaP20, P200,  P1000  y pipeta multicanal estándar
  Consejos P20, P200,  y  P1000.
Tubos cónicos ( Proteína  LoBind® Tubos)Eppendorf0030122216;   0030122240tubos de 15 mL, 50 mL
Eppendorf  Tubos®   lo-bindEppendorf022431081tubos de 1,5 mL placa
pared negra de 96 pocillos--para análisis de permeabilidad epitelial
Microscopio (con cámara)--Para campo claro 
Baño de agua (o cuentas)de imagen:ajuste a 37 grados; C
Configuración de vacío --Mínimo  presión: -70 kPa
Raspadores de célulasMatraces Biotium220033
T75BD Falcon353136Matraz de cultivo celular
Emular reactivo-1 ( ER-1)Emular Inc.-Solución de recubrimiento de virutas
Emular reactivo-2 ( ER-2)Emular Inc.-Solución de recubrimiento de virutas
Dulbecco' s PBS  (DPBS)Corning21-031-CV1X
Agua de grado de cultivo celularCorningMT25055CV
Trypan blueSigma93595Para el recuento de células
TryplE  Expreso ThermoFisher  Organoides de12604013Científicos  disociación  y células endoteliales  desapego  solución
Advanced DMEM/F12ThermoFisher  Ciencia12634028Medio
IntestiCult™ Medio de crecimiento de organoides (humano)Tecnologías de células madre06010Medio de crecimiento de organoides
Medio de crecimiento de células endoteliales MV 2PromocellC-22121Medio endotelial
Suero fetal bovino (FBS)SigmaF4135Serum
Primocin™  Agente antimicrobianoInvivoGenANT-PM-1
Attachment Factor™Cell Systems4Z0-210 solución derecubrimiento para
matraz Matrigel - Factor de crecimiento reducidoCorning356231Matriz de membrana basal solubilizada
Colágeno IVSigmaC5533Componente ECM
FibronectinaCorning356008componente ECM
Y-27632Tecnologías de células madre72304suplemento de medios organoides
CHIR99021Reprocell04-0004-10suplemento de medios de organoide
Solución de recuperaciónCorning354253Solución de disociación de matriz de mebrana basacional
bovina (BSA)SigmaA957630%, Agua estéril
de grado de cultivocelular CorningMT25055CVestéril,
agua DMSOSigmaD2650disolvente
3KDa Dextran Cascade BlueInvitrogenD713210 mg polvo
Rifampicina (RIF)SigmaCat# R3501Inductor CYP
Hidrato de testosteronaSigmaT1500CYP sustrato
1,25-dihyroxy Vitamina D3 (VD3)SigmaCat# D1530Inductor CYP
Acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1% (v/v)Sigma159002Solución de parada LCMS
IFNγPeprotech300-02
4% Paraformaldehído (PFA)EMS157-4Fijador
Triton-X 100SigmaT8787
Suero de burro normal (NDS)Sigma566460
anti-ocludinaThermoFisher  Scientific33-1500marcador de uniones estrechas
anti-Claudin 4ThermoFisher  Scientific36-4800marcador de uniones estrechas
anti-E-cadherinaAbcamab1416marcador de uniones epiteliales adherentes
anti-VE-cadherinaAbcamab33168marcador de uniones adherentes endoteliales
anti-Zonula Occludens 1 (ZO-1)Thermo Fischer339194marcador de uniones estrechas
DAPIThermoFisher  Scientific62248tinción nuclear
2-mercaptoetanolSigmaM6250
PureLink RNA Mini KitInvitrogen12183020kit de lisis, aislamiento y purificación de ARN
SuperScript™ IV VILO&comercio; Master MixInvitrogen11756050kit de transcriptasa inversa
TaqMan™ Mezcla maestra avanzada rápida4444557qPCRApplied Biosystems
QuantStudio™ 5 Sistema de PCR en tiempo realApplied BiosystemsA28573Ciclo de PCR en tiempo real
18S cebadorThermoFisher ScientificHs99999901_s1Eucariota 18S rRNA
CYP3A4 cebadorThermoFisher ScientificHs00604506_m1Citocromo  familia 3 subfamilia A miembro 4
Pierce™ Kit de ensayo Coomassie Plus (Bradford)ThermoFisher Scientific23236Kit de cuantificación de proteínas
Tampón de lisis MSD TrisMeso Scale DiagnosticsR60TX-3Tampón de lisis de
proteínas Caspasa-3 escindida/total Kit de lisado de células enterasDiagnóstico a mesoescalaK15140DKit de detección de caspasa 3
V-PLEX Panel de lesiones vasculares 2 Kit humanoDiagnóstico a escala mesográficaK15198D
V-PLEX Panel Proinflamatorio Humano II (4-Plex)Diagnóstico a escala mesográficaK15053D
Zeiss LSM 880Microscopio Zeiss-Confocal
Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27Zeiss-20Xlentes de objetivo de larga distancia
Zeiss AXIOvert.A1Zeiss-Microscopiocampo claro
Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1Lentes de objetivo Zeiss-10X
criopreservados Universidad de de celular Reactivo de de de

Referencias

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