Los organoides intestinales derivados de biopsias y las tecnologías de organ-on-a-chips se combinan en una plataforma microfisiológica para recapitular la funcionalidad intestinal específica de la región.
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Artículo de método
Combinación de organoides humanos y tecnología organ-on-a-chip para modelar la funcionalidad específica de la región intestinal
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La mucosa intestinal es una barrera física y bioquímica compleja que cumple una miríada de funciones importantes. Permite el transporte, la absorción y el metabolismo de nutrientes y xenobióticos, al tiempo que facilita una relación simbiótica con la microbiota y restringe la invasión de microorganismos. La interacción funcional entre varios tipos de células y su entorno físico y bioquímico es vital para establecer y mantener la homeostasis del tejido intestinal. Modelar estas interacciones complejas y la fisiología intestinal integrada in vitro es un objetivo formidable con el potencial de transformar la forma en que se descubren y desarrollan nuevas dianas terapéuticas y candidatos a fármacos.
Los organoides y las tecnologías Organ-on-a-Chip se han combinado recientemente para generar chips intestinales relevantes para el ser humano adecuados para estudiar los aspectos funcionales de la fisiología intestinal y la fisiopatología in vitro. Los organoides derivados de las biopsias del intestino delgado (duodeno) y grueso se siembran en el compartimento superior de un chip de órgano y luego se expanden con éxito como monocapas mientras preservan las características celulares, moleculares y funcionales distintivas de cada región intestinal. Las células endoteliales microvasculares específicas del tejido del intestino humano se incorporan en el compartimento inferior del chip del órgano para recrear la interfaz epitelial-endotelial. Esta novedosa plataforma facilita la exposición luminal a nutrientes, fármacos y microorganismos, lo que permite estudios de transporte intestinal, permeabilidad e interacciones huésped-microbio.
Aquí, se proporciona un protocolo detallado para el establecimiento de chips intestinales que representan el duodeno humano (chip de duodeno) y el colon (chip de colon), y su posterior cultivo bajo flujo continuo y deformaciones similares a la peristalsis. Demostramos métodos para evaluar el metabolismo de fármacos y la inducción de CYP3A4 en chip duodeno utilizando inductores y sustratos prototípicos. Por último, proporcionamos un procedimiento paso a paso para el modelado in vitro de la interrupción de la barrera mediada por interferón gamma (IFNγ) (síndrome del intestino permeable) en un chip de colon, incluidos los métodos para evaluar la alteración de la permeabilidad paracelular, los cambios en la secreción de citoquinas y el perfil transcriptómico de las células dentro del chip.
Introducción
El intestino humano es un órgano complejo y multitarea capaz de autorregenerarse. Se divide en el intestino delgado y grueso. La función principal del intestino delgado es digerir aún más los alimentos que provienen del estómago, absorber todos los nutrientes y pasar el residuo al intestino grueso, que recupera el agua y los electrolitos. El intestino delgado se divide en múltiples regiones anatómicamente distintas: el duodeno, el yeyuno y el íleon, cada uno de los cuales está adaptado para realizar funciones específicas. Por ejemplo, el duodeno ayuda a descomponer el quimo (contenido del estómago) para permitir la absorción adecuada de nutrientes que involucran prote....
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Protocolo
NOTA: Todos los cultivos celulares deben manejarse utilizando una técnica aséptica adecuada.
Los organoides intestinales humanos empleados en este estudio se obtuvieron de la Universidad Johns Hopkins y todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas y regulaciones aprobadas. Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Johns Hopkins (IRB #NA 00038329).
1. Preparación de los reactivos de cultivo celular
- Prepare el medio de crecimiento de organoides humanos siguiendo las instrucciones del fabricante (....
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Resultados
La Figura 1D resume la línea de tiempo del cultivo de chips intestinales e ilustra las células endoteliales intestinales y los organoides antes y después de la siembra en el chip. Además, demuestra las diferencias morfológicas distintivas entre las virutas de duodeno y colon, destacadas por la presencia de formaciones similares a vellosidades en la vilipruta de duodeno y representativas de la arquitectura del intestino delgado.
La Figura 3A
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Discusión
La combinación de la tecnología de órganos en un chip y los organoides intestinales es prometedora para el modelado preciso de la fisiología intestinal humana y la fisiopatología. Aquí, proporcionamos un protocolo paso a paso simple y robusto (descrito en la Figura 1) para el establecimiento del chip intestinal que contiene epitelio intestinal delgado o colónico derivado de la biopsia y células endoteliales microvasculares intestinales cocultivadas en un dispositivo microfluídico. Esta simul.......
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Divulgaciones
Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi y Magdalena Kasendra son empleadas actuales o anteriores de Emulate Inc. y pueden tener acciones. Emulate Inc. es la compañía que fabrica los dispositivos de chips de órganos y ha publicado patentes relevantes para el trabajo establecido en este artículo.
Agradecimientos
Agradecemos al profesor Mark Donowitz por proporcionar los organoides derivados de la biopsia intestinal y a Brett Clair por diseñar las ilustraciones científicas del chip, el módulo portátil y de cultivo. Todo el resto de las ilustraciones científicas se generaron utilizando el BioRender.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| intestino delgado Células endoteliales microvasculares del intestino humano | AlphaBioRegen | ALHE15 | 0,5 células M/ml ; colon criopreservado |
| Células endoteliales microvasculares intestinales humanas | AlphaBioRegen | ALHE16 | 0,5 células M/ml ; |
| Organoides duodenales humanos derivados de biopsias | de John Hopkin | - | Los organoides fueron proporcionados por el profesor Mark Donowitz (número de la Junta de Revisión Institucional: NA_00038329). |
| Organoides de colon humano derivados | de biopsia John Hopkin's University | : | los organoides fueron proporcionados por el profesor Mark Donowitz (número de la Junta de Revisión Institucional: NA_00038329). |
| Zoë CM-1 y comercio; Módulo de Cultura | Emulate Inc. | - | Módulo de cultura |
| Orb-HM1™ Emular módulo de | concentrador Inc. | - | 5% de CO2, estiramiento al vacío y fuente |
| de alimentación Chip-S1™ Emular chip estirable | Inc. | - | Pod de chips de órgano |
| ; Módulos Portátiles | Emulate Inc. | - | Módulo portátil |
| Caja de luz ultravioleta | Emulate Inc. | - | - |
| Emular cuna de chips | Inc. | - | 1 por plato de cultivo cuadrado |
| Steriflip®-HV Filtros | EMD Millipore | SE1M003M00 | 0.45 μ m Plato |
| cultivo de célula cuadrada con filtro de PVDF (120 x 120 mm) | VWR | 82051-068-Handheld | |
| vacío aspirador | Corning | 4930 | - |
| Aspirante pipetas | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, poliestireno, individualmente |
| envuelto Puntas de aspiración | - | Estéril (esterilizado en autoclave) | |
| Serológico pipetas | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, y 25 mL baja endotoxina, estéril | |
| Pipeta | P20, P200, P1000 y pipeta multicanal estándar | ||
| Consejos | P20, P200, y P1000. | ||
| Tubos cónicos ( Proteína LoBind® Tubos) | Eppendorf | 0030122216; 0030122240 | tubos de 15 mL, 50 mL |
| Eppendorf Tubos® lo-bind | Eppendorf | 022431081 | tubos de 1,5 mL placa |
| pared negra de 96 pocillos | - | - | para análisis de permeabilidad epitelial |
| Microscopio (con cámara) | - | - | Para campo claro |
| Baño de agua (o cuentas) | de imagen: | ajuste a 37 grados; C | |
| Configuración de vacío | - | - | Mínimo presión: -70 kPa |
| Raspadores de células | Matraces Biotium | 220033 | |
| T75 | BD Falcon | 353136 | Matraz de cultivo celular |
| Emular reactivo-1 ( ER-1) | Emular Inc. | - | Solución de recubrimiento de virutas |
| Emular reactivo-2 ( ER-2) | Emular Inc. | - | Solución de recubrimiento de virutas |
| Dulbecco' s PBS (DPBS) | Corning | 21-031-CV | 1X |
| Agua de grado de cultivo celular | Corning | MT25055CV | |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | Para el recuento de células |
| TryplE | Expreso ThermoFisher Organoides de | 12604013 | Científicos disociación y células endoteliales desapego solución |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Ciencia | 12634028 | Medio |
| IntestiCult™ Medio de crecimiento de organoides (humano) | Tecnologías de células madre | 06010 | Medio de crecimiento de organoides |
| Medio de crecimiento de células endoteliales MV 2 | Promocell | C-22121 | Medio endotelial |
| Suero fetal bovino (FBS) | Sigma | F4135 | Serum |
| Primocin™ | Agente antimicrobiano | InvivoGen | ANT-PM-1 |
| Attachment Factor™ | Cell Systems | 4Z0-210 solución de | recubrimiento para |
| matraz Matrigel - Factor de crecimiento reducido | Corning | 356231 | Matriz de membrana basal solubilizada |
| Colágeno IV | Sigma | C5533 | Componente ECM |
| Fibronectina | Corning | 356008 | componente ECM |
| Y-27632 | Tecnologías de células madre | 72304 | suplemento de medios organoides |
| CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-10 | suplemento de medios de organoide |
| Solución de recuperación | Corning | 354253 | Solución de disociación de matriz de mebrana basacional |
| bovina (BSA) | Sigma | A9576 | 30%, Agua estéril |
| de grado de cultivo | celular Corning | MT25055CV | estéril, |
| agua DMSO | Sigma | D2650 | disolvente |
| 3KDa Dextran Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | 10 mg polvo |
| Rifampicina (RIF) | Sigma | Cat# R3501 | Inductor CYP |
| Hidrato de testosterona | Sigma | T1500 | CYP sustrato |
| 1,25-dihyroxy Vitamina D3 (VD3) | Sigma | Cat# D1530 | Inductor CYP |
| Acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1% (v/v) | Sigma | 159002 | Solución de parada LCMS |
| IFNγ | Peprotech | 300-02 | |
| 4% Paraformaldehído (PFA) | EMS | 157-4 | Fijador |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Suero de burro normal (NDS) | Sigma | 566460 | |
| anti-ocludina | ThermoFisher Scientific | 33-1500 | marcador de uniones estrechas |
| anti-Claudin 4 | ThermoFisher Scientific | 36-4800 | marcador de uniones estrechas |
| anti-E-cadherina | Abcam | ab1416 | marcador de uniones epiteliales adherentes |
| anti-VE-cadherina | Abcam | ab33168 | marcador de uniones adherentes endoteliales |
| anti-Zonula Occludens 1 (ZO-1) | Thermo Fischer | 339194 | marcador de uniones estrechas |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | tinción nuclear |
| 2-mercaptoetanol | Sigma | M6250 | |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183020 | kit de lisis, aislamiento y purificación de ARN |
| SuperScript™ IV VILO&comercio; Master Mix | Invitrogen | 11756050 | kit de transcriptasa inversa |
| TaqMan™ Mezcla maestra avanzada rápida | 4444557 | qPCR | Applied Biosystems |
| QuantStudio™ 5 Sistema de PCR en tiempo real | Applied Biosystems | A28573 | Ciclo de PCR en tiempo real |
| 18S cebador | ThermoFisher Scientific | Hs99999901_s1 | Eucariota 18S rRNA |
| CYP3A4 cebador | ThermoFisher Scientific | Hs00604506_m1 | Citocromo familia 3 subfamilia A miembro 4 |
| Pierce™ Kit de ensayo Coomassie Plus (Bradford) | ThermoFisher Scientific | 23236 | Kit de cuantificación de proteínas |
| Tampón de lisis MSD Tris | Meso Scale Diagnostics | R60TX-3 | Tampón de lisis de |
| proteínas Caspasa-3 escindida/total Kit de lisado de células enteras | Diagnóstico a mesoescala | K15140D | Kit de detección de caspasa 3 |
| V-PLEX Panel de lesiones vasculares 2 Kit humano | Diagnóstico a escala mesográfica | K15198D | |
| V-PLEX Panel Proinflamatorio Humano II (4-Plex) | Diagnóstico a escala mesográfica | K15053D | |
| Zeiss LSM 880 | Microscopio Zeiss-Confocal | ||
| Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27 | Zeiss-20X | lentes de objetivo de larga distancia | |
| Zeiss AXIOvert.A1 | Zeiss-Microscopio | campo claro | |
| Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1 | Lentes de objetivo Zeiss-10X |
Referencias
- Fritz, A., et al. Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).
- Okumura, R., Takeda, K.
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Reimpresiones y permisos
