El presente protocolo describe el método de cría de insectos plaga tortricidas en los laboratorios. Los procedimientos para distinguir el sexo de los insectos y extraer ácidos nucleicos para la secuenciación de alto rendimiento se establecen utilizando dos plagas tortricidas.
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Artículo de método
Cría masiva y estudios moleculares en insectos plaga tortricidae
En este artículo
Resumen
Resumen
Tortricidae (Lepidoptera), comúnmente conocidos como polillas tortrix o leafroller, comprende muchas plagas agrícolas y forestales, que causan graves pérdidas agrícolas. Para comprender la biología de tales polillas plaga, las técnicas fundamentales han tenido una gran demanda. Aquí, los métodos para la cría en masa, las observaciones y los estudios moleculares se desarrollan utilizando dos tortrix de té, Homona magnanima y Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Los insectos fueron criados en masa con una dieta artificial en rodajas y mantenidos por endogamia durante más de 100 generaciones teniendo en cuenta sus características biológicas. Los insectos tienen varios dimorfismos sexuales; por lo tanto, es difícil distinguir el sexo durante las etapas de desarrollo, que han impedido los ensayos posteriores. El presente trabajo destacó que el sexo de las larvas de tortricidas podría determinarse mediante la observación de testículos o tinción de orceína láctico-acética para visualizar el cromosoma W específico de la hembra. Además, utilizando los métodos de determinación del sexo, el presente estudio permitió la extracción de ácido nucleico de embriones determinados por sexo y la aplicación hacia la secuenciación de alto rendimiento. Estos consejos son aplicables para otros insectos plaga y facilitarán más estudios morfológicos y genéticos.
Introducción
Los insectos lepidópteros representan más del 10% de todas las especies vivas descritas1, y ciertas especies de taxones causan graves daños a las plantas y graves pérdidas agrícolas 2,3. Aunque se han desarrollado estudios moleculares y genéticos utilizando modelos de insectos como el gusano de seda Bombyx mori 4,5, los insectos plaga siguen sin ser investigados, en parte debido a las dificultades para la cría y manipulación 6,7. Por lo tanto, los estudios y téc....
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Protocolo
1. Recolección de insectos y cría masiva
- Recolectar insectos tortricidas de los campos siguiendo las Referencias 8,12 publicadas anteriormente.
NOTA: Las larvas de H. magnanima y A. honmai se recogen de hojas de té dañadas (Figura 1A); los adultos son atraídos usando luz UV portátil de 4 W (longitud de onda de 365 nm, ver Tabla de Materiales, Figura 1B). - Recoja las larvas recolectadas (Figura 1C, D) individualmente en una pieza de ....
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Resultados
Establecimiento de líneas de acogida y su mantenimiento
La viabilidad de las larvas recolectadas en el campo se atribuye de manera diferente a la ubicación del campo, las estaciones y las condiciones de cría (por ejemplo, el 90% de la viabilidad en Taiwán, Taoyuan, como se muestra en Arai et al.12). Aproximadamente el 30%-50% de los pares generarán la próxima generación como de costumbre. Para H. magnanima y A. honmai, las matrilinas se han mantenido mediante .......
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Discusión
Tortricid comprende varias plagas agrícolas y forestales; el presente estudio presentó métodos para criar tortrix a lo largo de generaciones, observar la embriogénesis y el sexo de los insectos, y realizar análisis moleculares utilizando embriones maduros.
Uno de los obstáculos para el estudio de insectos plaga es establecer métodos de cría. Especialmente, la endogamia a veces afecta negativamente la aptitud de la especie. La reducción de la aptitud física por la consanguínea, llamada depresió.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer el apoyo de las Becas de Investigación para Jóvenes Científicos de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) [Número de subvención 19J13123 y 21J00895].
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1/2 onza taza | de FP CHUPA | CP070009 | la cría de insectos; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| /2 onza de tapa de taza | FP CHUPA | CP070011 | la cría de insectos; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| ácido acético al 99.7% | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japón | 36289 | fijación; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | no se muestra | Cuantificación de ácidos nucleicos; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit Agilent | Technologies | 5067-1511 | Cuantificación de ácidos nucleicos; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| solución de cloruro de benzalconio | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | esterilización; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Algodón | AOUME | 8-1611-02 | cría de insectos; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| solución DAPI | Dojindo, Tokio, Japón | 340-07971 | tinciones; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Fosfato de hidrógeno disódico | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS kit de cuantificación | Invitrogen | Q33231 | Cuantificación de ácidos nucleicos; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II columna | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | Extracción de ARN; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Etanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japón | 4.98748E + 12 | fijación; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Etilendiamina-N,N,N',N'-ácido tetraacético Sal tetrasódica tetrahidratado (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tampón de lisis celular (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Papel glassine | HEIKO | 2100010 | la cría de insectos; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc& utm_source= Bloque |
| de calor Adw WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokio, Japón | 4002620 | incubación; https://www.attoeng.site/ |
| heptano | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japón | 4.98748E+12 | fijación; |
| https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | no se muestra | Dieta artificial; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 Extracción de | ARN; |
| https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | extracción de ácidos nucleicos; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| ácido láctico | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tinciones; |
| https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html metanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japón | 4.98748E+12 | fijación; |
| https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html MSV-3500 vórtice | Biosan | BS-010210-TAK | Mezclador Voltex; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano fotómetro NP 80 | Implen | no se muestra | Cuantificación de ácidos nucleicos; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Paquete natural | amplio Inomata químico | 1859 | cría de insectos; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3% 82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II Kit de preparación de la biblioteca para la preparación de la biblioteca Illumina | New England BioLabs | E7770S | ; |
| https://www.nebj.jp/products/detail/2039 orceína | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tinciones; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehído | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fijación; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polioxietileno(20) Monolaurato de sorbitán | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Luz negra UV portátil (4W, longitud de onda de 365nm) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japón | no se muestra | Colección de insectos; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Cloruro de potasio | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; |
| https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html Fosfato de dihidrógeno de potasio | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, EE. UU | P36965 | antidecoloración; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinasa K Solution | Merck | 71049-4CN | Extracción de ADN; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| solución de precipitación de proteínas | Qiagen | 158912 | extracción de ADN; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Cuantificación de ácidos nucleicos; |
| https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 rifampicina | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japón | 4.98748E+12 | Esterilización; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| Kit de cuantificación de ARN HS | Invitrogen | Q32855 | Cuantificación de ácidos nucleicos; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| solución de ARNasa | Nippon Gene | 313-01461 Extracción de | ARN; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | no se muestra | Dieta artificial; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Cloruro de sodio | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; |
| https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html sulfato de dodecilo sódico | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tampón de lisis celular (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| solución acuosa de hipoclorito de sodio | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japón | 4.98748E+12 | separación de huevos; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Clorhidrato de tetraciclina | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japón | 4.98748E+12 | Esterilización; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tampón de lisis celular; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| agua destilada ultrapura | Invitrogen | 10977023 | extracción de ARN; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
Referencias
- Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
- Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society<....
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