Summary
Konakçı sodyum taurokolat birlikte taşınan polipeptit ile bağlanma afinitesini (KD) ölçmek için izotermal titrasyon kalorimetrisini kullanarak, viral giriş öncesi ve sonrası yaşam döngüsü aşamalarını hedefleyen anti-hepatit B virüsü (HBV) bileşiklerini taramak için bir protokol sunuyoruz. Antiviral etkinlik, viral yaşam döngüsü belirteçlerinin (cccDNA oluşumu, transkripsiyon ve viral montaj) baskılanması yoluyla belirlendi.
Abstract
Hepatit B virüsü (HBV) enfeksiyonu hepatosellüler karsinom için çok önemli bir risk faktörü olarak kabul edilmiştir. Mevcut tedavi sadece viral yükü azaltabilir, ancak tam remisyon ile sonuçlanmaz. HBV enfeksiyonu için etkili bir hepatosit modeli, terapötik ajanların taranması için çok önemli olacak gerçek bir viral yaşam döngüsü sunacaktır. Mevcut anti-HBV ajanlarının çoğu, viral girişten sonraki yaşam döngüsü aşamalarını hedefler, ancak viral girişten önce değil. Bu protokol, viral giriş öncesi ve viral giriş sonrası yaşam döngüsü aşamalarını hedefleyen terapötik ajanları tarayabilen yetkin bir hepatosit modelinin oluşturulmasını detaylandırmaktadır. Bu, sodyum taurokolat kotransporting polipeptit (NTCP) bağlanmasının, cccDNA oluşumunun, transkripsiyonun ve konakçı hücreler olarak imHC veya HepaRG'ye dayalı viral montajın hedeflenmesini içerir. Burada, HBV giriş inhibisyon testi, HBV bağlama ve NTCP aracılığıyla taşıma işlevlerini inhibe etmek için kurkumin kullandı. İnhibitörler, termodinamik parametrelere dayalı HBV ilaç taraması için evrensel bir araç olan izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) kullanılarak NTCP ile bağlanma afinitesi (KD) açısından değerlendirildi.
Introduction
Hepatit B virüsü (HBV) enfeksiyonu tüm dünyada hayatı tehdit eden bir hastalık olarak kabul edilmektedir. Kronik HBV enfeksiyonu karaciğer sirozu ve hepatosellüler karsinom riski taşır1. Mevcut anti-HBV tedavisi çoğunlukla nükleos(t)ide analogları (NA'lar) ve interferon-alfa (IFN-α)2,3 kullanılarak viral giriş sonrası çalışmalara odaklanmaktadır. Bir HBV giriş inhibitörü olan Myrcludex B'nin keşfi, anti-HBV ajanları4 için yeni bir hedef belirlemiştir. Kronik HBV'de giriş inhibitörleri ve NA'ların kombinasyonu, tek başına viral replikasyonu hedefleyenlere kıyasla viral yükü önemli ölçüde azaltmıştır 5,6. Bununla birlikte, HBV giriş inhibitörlerinin taranması için klasik hepatosit modeli, düşük viral reseptör seviyeleri (sodyum taurokolat kotransportan polipeptit, NTCP) ile sınırlıdır. Hepatoma hücrelerinde (yani, HepG2 ve Huh7) hNTCP'nin aşırı ekspresyonu, HBV enfeksiyonunu 7,8 geliştirir. Bununla birlikte, bu hücre hatları düşük faz I ve II ilaç metabolize edici enzimleri eksprese eder ve genetik instabilitesergiler 9. Previral giriş, NTCP bağlama ve viral giriş gibi aday anti-HBV bileşiklerinin farklı mekanizmalarını hedeflemeye yardımcı olabilecek hepatosit modelleri, etkili kombinasyon rejimlerinin tanımlanmasını ve geliştirilmesini hızlandıracaktır. Kurkuminin anti-HBV aktivitesi için yapılan çalışma, viral giriş kesintisine ek olarak yeni bir mekanizma olarak viral girişin inhibisyonunu aydınlatmıştır. Bu protokol, anti-HBV giriş molekülleri10'un taranması için bir konak modelini detaylandırır.
Bu yöntemin amacı, viral giriş inhibisyonu için aday anti-HBV bileşiklerini araştırmak, özellikle NTCP bağlanmasını ve taşınmasını engellemektir. NTCP ekspresyonu HBV girişi ve enfeksiyonu için kritik bir faktör olduğundan, NTCP seviyeleri11'i en üst düzeye çıkarmak için hepatosit olgunlaşma protokolünü optimize ettik. Ek olarak, bu protokol HBV girişi üzerindeki inhibitör etkiyi HBV ekinin inhibisyonu ve içselleştirmenin inhibisyonu olarak ayırt edebilir. Taurokolik asit (TCA) alım testi, NTCP transport12,13'ü temsil etmek için radyoizotop yerine ELISA bazlı bir yöntem kullanılarak da modifiye edildi. Reseptör ve ligand etkileşimi 3D yapıları14,15 ile doğrulandı. NTCP fonksiyonunun inhibisyonu, TCA alım aktivitesi16 ölçülerek değerlendirilebilir. Bununla birlikte, bu teknik, NTCP'nin aday inhibitörlere bağlandığına dair doğrudan kanıt sağlamamıştır. Bu nedenle, yüzey plazmon rezonansı17, ELISA, floresan bazlı termal kayma testi (FTSA) 18, FRET19, AlphaScreen ve diğer çeşitli yöntemler20 gibi çeşitli teknikler kullanılarak bağlanma araştırılabilir. Bu teknikler arasında ITC, bağlanma analizinde bir hedef standarttır, çünkü hemen hemen her reaksiyonda ısı emilimini veya emisyonu gözlemleyebilir21. NTCP ve aday bileşiklerin bağlanma afinitesi (KD) doğrudan ITC kullanılarak değerlendirildi; Bu afinite değerleri, in silico tahmin modeli22 kullanılarak elde edilenlerden daha kesindi.
Bu protokol hepatosit matürasyonu, HBV enfeksiyonu ve HBV giriş inhibitörü taramasındaki teknikleri kapsar. Kısaca imHC ve HepaRG hücre hatlarına dayalı bir hepatosit modeli geliştirilmiştir. Kültürlenmiş hücreler 2 hafta içinde olgun hepatositlere farklılaştırıldı. NTCP düzeylerinin yukarı regülasyonu gerçek zamanlı PCR, western blot ve flow sitometri11 kullanılarak tespit edildi. Hepatit B virion (HBVcc) HepG2.2.15'ten üretildi ve toplandı. Diferansiye imHC veya HepaRG (d-imHC, d-HepaRG), HBV virion ile aşılamadan 2 saat önce anti-HBV adayları ile profilaktik olarak tedavi edildi. Deneyin beklenen sonucu, hücresel HBV ve infektiviteyi azaltan ajanların tanımlanmasıydı. Anti-NTCP aktivitesi TCA alım testi kullanılarak değerlendirildi. NTCP etkinliği, NTCP'yi özel olarak bağlayan aracılar tarafından bastırılabilir. ITC tekniği, inhibitörleri ve hedef proteinlerini tahmin edebilen etkileşimli bağlanmanın fizibilitesini araştırmak, biyomoleküler kompleksin kovalent olmayan etkileşimleri yoluyla reseptör için ligandın bağlanma afinitesini (KD) belirlemek için kullanıldı23,24. Örneğin, K D ≥ 1 × 103 mM zayıf bağlanmayı, K D ≥ 1 × 106 μM orta derecede bağlanmayı ve K D ≤ 1 × 109 nM güçlü bağlanmayı temsil eder. ΔG, bağlanma etkileşimleri ile doğrudan ilişkilidir. Özellikle, negatif ΔG'li bir reaksiyon, bağlanmanın kendiliğinden bir süreç olduğunu gösteren ekzergonik bir reaksiyondur. Negatif bir ΔH ile reaksiyon, bağlanma işlemlerinin hidrojen bağlarına ve Van der Waals kuvvetlerine bağlı olduğunu gösterir. Hem TCA alımı hem de ITC verileri, anti-HBV giriş ajanlarını taramak için kullanılabilir. Bu protokollerin sonuçları sadece anti-HBV taraması için değil, aynı zamanda bağlanma afinitesi ve taşıma fonksiyonu ile değerlendirilen NTCP ile etkileşim için de bir temel sağlayabilir. Bu yazıda konakçı hücre hazırlığı ve karakterizasyonu, deneysel tasarım ve anti-HBV girişinin NTCP bağlanma afinitesi ile birlikte değerlendirilmesi anlatılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Aşağıdaki prosedürler Sınıf II biyolojik tehlike akış davlumbazında veya laminer akışlı davlumbazda gerçekleştirilmelidir. HBV'nin kullanımı IRB (MURA2020/1545) tarafından etik olarak onaylanmıştır. Bu protokolde kullanılan tüm çözümler, reaktifler, ekipman ve hücre hatları hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. Konakçı hücrelerin hazırlanması (olgun hepatositler)
- Kültür hepatositleri (3.75 × 105 hücreli HepaRG veya imHC) ve %10 fetal sığır serumu (FBS), %1 L-glutamin, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş 10 mL DMEM/F12 ortamı içeren 75cm2'lik bir kültür şişesinde muhafaza edilir. Hücrelerin% 80-90 birleşme noktasına ulaşmasını bekleyin (1 hafta içinde).
- Eski ortamı şişeden atın ve hücreleri 4 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
- PBS'yi aspire edin ve 4 mL% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin.
- Şişeyi 37 °C inkübatörde 2-3 dakika boyunca inkübe edin ve 10x objektif lensle ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak yapışkan hücreleri kontrol edin. Tek katmanın kültürleme yüzeyinden ayrıldığından emin olun.
- Şişeye% 10 FBS ile desteklenmiş 4 mL kültür ortamı ekleyerek tripsini inhibe edin ve hasat edilen hücreleri dikkatlice yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve 300 × g, 25 ° C'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Süpernatantı hücre peletinden aspire edin ve% 10 FBS ve antibiyotiklerle desteklenmiş önceden ısıtılmış kültür ortamının 1-2 mL'si ile yeniden askıya alın.
- Hücre süspansiyonunun her birini 10 μL karıştırın ve tripan mavisini karıştırın ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın. Bir sonraki adıma geçmeden önce hücre canlılığının% 90'dan yüksek olduğundan emin olun.
- Tohum 1, 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğunda 2 mL başına 106 hücre × ve hücreler% 100 birleşene kadar DME / F12 tam ortamında muhafaza edilir.
- Hepatik olgunlaşma için, hepatik olgunlaşma ortamı hazırlayın (Williams'ın E ortamı% 10 FBS, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 5 μg / mL insülin, 50 μM hidrokortizon, 2 mM L-glutamin ve% 2 DMSO ile desteklenmiştir).
- Kültür ortamını haftada 2 kez değiştirin.
- HBV enfeksiyonuna hazır olgun hepatositler elde etmek için hepatositleri 2 hafta boyunca olgunlaşma ortamında tutun.
2. Hücresel NTCP'nin nicelleştirilmesi
- NTCP ekspresyonunu gerçek zamanlı PCR kullanarak ölçme
- Olgun hepatositlerin peletini tripsinizasyon yoluyla toplayın (bakınız Adım 1.2-1.5).
- DNaz I tedavisi ile bir RNA ekstraksiyon kiti kullanarak hücre peletinden toplam RNA'yı çıkarın.
- Üreticinin talimatlarını izleyerek bir oligo-dT primer ve ters transkripsiyon sistemi kullanarak 200 ng toplam RNA'dan cDNA'yı sentezleyin.
- cDNA'yı 50 ng / μL'ye seyreltin ve PCR reaksiyonu için bir şablon olarak kullanın. Seyreltilmiş cDNA'nın 2 μL'sini, 5 μM NTCP'ye özgü primerlerle (5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' ve 5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3') SYBR yeşil qRT-PCR Kit çözeltisi içeren PCR ana karışım reaktifleri ile karıştırın.
- Normalizasyon için, GAPDH'yi spesifik primerlere sahip bir temizlik geni olarak kullanın (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' ve 5'-AAATGAGCCCCAGCCCTC-3').
- Aşağıdaki sıcaklık koşulları altında bir termal döngü kullanarak cDNA numunelerini yükseltin: 95 ° C'de 3 dakikalık 1 döngü (ilk denatürasyon); 95 °C'de 30 sn (denatürasyon), 60 °C ila 65 °C'de 30 s (tavlama), 72 °C'de 30 s (uzatma) 40 sn döngü; 72 °C'de 5 dakikalık 1 döngü (son uzatma).
- 2-ΔΔCT yöntemine dayanan bir kalibratör gen olarak GAPDH kullanarak farklılaşmamış hücreler üzerindeki olgun hepatositlerdeki NTCP kıvrım değişimini hesaplayın.
- Batı leke analizini kullanarak NTCP'yi ölçme
- Bir hücre kazıyıcı kullanarak hepatositleri toplayın ve hücre peletini toplamak için 5 dakika boyunca 300 x g, 25 ° C'de santrifüj yapın.
- Hücresel proteini 1x proteaz inhibitörü içeren 100 μL RIPA tamponu ile çıkarmak için RIPA tamponu üreticisinin talimatlarını izleyin.
- Bisinkoninik asit (BCA) yöntemini kullanarak toplam protein konsantrasyonunu ölçün.
- 12.5 μL proteini, hacimce 1: 1 oranında 2x yükleme boyası ile karıştırın.
- Protein karışımını ve standart merdiveni 95 ° C'de 5 dakika kaynatın.
- Elektroforez odasına 1x çalışma tamponu ekleyin.
- Protein standart merdiveninin 5 μL'sini veya kaynamış protein karışımının 20 μL'sini % 10'luk (w / v) bir poliakrilamid jeline yükleyin.
- Jel elektroforezi uygulayın: 30 dakika boyunca 50 V, ardından oda sıcaklığında 1 saat boyunca 90 V.
- Bir PVDF membranını 30 sn metanole batırarak hazırlayın, 1-2 dakika boyunca çift damıtılmış suyla yıkayın ve iki parça filtre kağıdı ile birlikte 10 dakika veya kullanıma kadar transfer tamponunda bekletin.
- Filtre kağıdını yarı kuru bir transfer hücresinin anot plakasına yerleştirin; ardından PVDF membranını, jeli ve filtre kağıdını bu sırayla üstüne yerleştirin.
- Proteinleri jelden PVDF membranına oda sıcaklığında 25 dakika boyunca 10 V'ta aktarın.
- Membranı WB blokaj çözeltisi ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edin.
- Membranı gece boyunca 4 °C'de anti-sodyum taurokolat kotransporting polipeptit (anti-NTCP) (1:100 seyreltme) ile inkübe edin.
- Membranı 3 x 10 dakika TBST ile yıkayın.
- Membranı yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge keçi anti-tavşan anti-tavşan antikoru (1:10.000 seyreltme) ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin.
- Membranı TBST ile 3 x 10 dakika ve ardından TBS ile 1 x 5 dakika yıkayın.
- Bir HRP substratı kullanarak NTCP'yi tespit edin ( bkz.
- Membranın en az 0,1 mL HRP substrat çözeltisi /cm2'sini ekleyin ve membranı karanlıkta 3-5 dakika inkübe edin.
- Kemilüminesans modunda bir Jel Dokümantasyon Sistemi kullanarak NTCP'yi görselleştirin, membran için işaretleyici seçeneğini seçin, her 1 dakikada bir birikimli modda pozlama süresini ayarlayın ve fotoğrafı 5 dakika boyunca çeşitli pozlama süreleriyle çekin.
- Fare anti-GAPDH antikoru (1:200.000 seyreltme) ve HRP-konjuge keçi anti-fare sekonder anti-sekonder antikoru (1:10.000 seyreltme) ile lekeyi sıyırın ve araştırın.
- Akış sitometrisi kullanarak NTCP seviyesinin ölçülmesi
- Olgun hepatositlerin hücre peletlerini, hücreleri 15 dakika boyunca 8 mM EDTA ile inkübe ederek toplayın.
NOT: Tripsin veya hücre yüzey reseptörlerini bozabilecek diğer proteazları kullanmaktan kaçının. NTCP bir hücre yüzeyi reseptör proteini olduğundan, tripsinizasyona bağlı hasar olumsuz sonuçlar verebilir. - Hepatositleri 15 dakika boyunca 1x PBS'de 300 μL% 3.7 paraformaldehit ile sabitleyin. Hücre süspansiyonunu 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 300 × g, 25 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Hücreleri 2x'i %1 FBS (v/v) ile 700 μL 1x PBS ile yıkayın, 300 × g, 25 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın, hücre peletine PBS'de 300 μL %0,05 Triton X-100 ekleyin ve hücreleri geçirgenleştirmek için 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- 300 × g, 25 °C'de 10 dakika santrifüj, hücre peletini %1 FBS (v/v) içeren 700 μL PBS ile 3 x 1 dakika yıkayın. NTCP'ye karşı birincil antikoru olan hücreleri (1:100 seyreltme) 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri Perm/Wash tamponu ile 3 x 1 dakika yıkayın ve 300 × g, 25 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
- İkincil antikoru olan hücreleri, Alexa Fluor 488'e 4 ° C'de 30 dakika boyunca konjuge edin. Hücreleri Perm/Wash tamponu ile 3 x 1 dakika yıkayın ve 300 × g, 25 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Hücre peletini %1 FBS (v/v) ile 200 μL PBS ile yeniden askıya alın.
- Akış sitometresini açın, lazeri 15 dakika ısıtın ve rutin temizlik yapın.
- İleri saçılma (FSC), yan saçılma (SSC) ve floresein izotiyosiyanat (FITC) veya fikoeritrin (PE) dahil olmak üzere ölçüm parametrelerini seçin ve yazılım tarafından otomatik kompanzasyon ayarını yapın. Kompanzasyon kontrol örneklerini dahil edin: lekesiz kontrol, FITC boyalı kontrol ve PE boyalı kontrol.
NOT: FSC ve SSC parametreleri, geçit analizi için hücre popülasyonunu seçmek üzere tek tek hücrelerin boyutunu ve ayrıntı düzeyini belirlemek için kullanılır. Floresan kanal dedektörü FITC ve PE kanallarına sahiptir. Bu protokol için, Alexa Fluor 488'i algılamak üzere FITC kanalını seçin. - Lekesiz numuneyi orta akışkan akış hızıyla (60 μL/dak) çalıştırın, FSC ve SSC eşiklerini, ilgilenilen hücre popülasyonunu kapsayana kadar ayarlayın, bu alandaki kapı bölgesini işaretleyin ve tüm tazminat kontrollerine uygulayın.
- Lekesiz kontrolü kullanarak floresan fotoçarpan tüpünü (PMT) ayarlayın ve negatif kadrandaki FITC veya PE'nin PMT voltajını ayarlayın. Pozitif lekeli numuneyi çalıştırın ve pozitif kadran ölçeğinde FITC veya PE'yi ayarlayın. Lekesiz, FITC lekeli veya PE lekeli denetimleri çalıştırın, telafiyi hesaplayın ve örnek ayarlara uygulayın. NTCP seviyesini ölçmek için hepatosit örneğini çalıştırın.
- Boyanmış hepatositleri akış sitometresi yazılımını kullanarak analiz edin ( bkz.
- BD FACSuite pencereleri altında, Veri Kaynakları Sekmesindeki kontrol tüpüne tıklayın ve ham verilerin görünmesini bekleyin.
- Sağ taraftaki Çalışma Sayfası sekmesinde, Elips Kapısı düğmesine tıklayın, fare imlecini kullanarak SSC'deki hücre popülasyonunu ve FSC nokta grafiğini seçin ve P1 çemberinin görünmesini bekleyin.
- Aralık Geçidi düğmesine tıklayın ve en yüksek floresan yoğunluğu değerinden başlayarak sağ tarafa doğru FITC histogramında bölgeyi işaretleyin. Görünen P2 çizgisini gözlemleyin.
- Deneme tüpüne tıklayın ve Çalışma Sayfası sekmesindeki verilerin değiştiğini gözlemleyin. İstatistikler düğmesine ve ardından çalışma sayfasındaki boş alana tıklayın. Görünen NTCP popülasyonunun istatistiksel değerlerini gözlemleyin.
- Olgun hepatositlerin hücre peletlerini, hücreleri 15 dakika boyunca 8 mM EDTA ile inkübe ederek toplayın.
3. Hücre kültürü kaynaklı HBV parçacıklarının üretimi (HBVcc)
- Kültür HepG2.2.15 tam ortamda (DMEM% 10 FBS, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile desteklenmiştir) 24 saat boyunca 10 cm'lik bir Petri kabında.
- HepG2.2.15 %60-%70 birleşime ulaştığında 380 μg/mL genetikin (G418) ile desteklenmiş tam ortamı değiştirin. Şartlandırılmış ortamı her 2 günde bir hasat edin; HBV içeren ortamı 4 °C'de saklayın.
- Süpernatantı 20 dakika boyunca 5.000 × g, 4 ° C'de santrifüj ederek hücre kalıntılarını temizleyin. 20 mL'lik bir şırınga kullanarak şartlandırılmış ortamı toplayın ve hücre kalıntılarını gidermek için 0,45 μm düşük protein bağlayıcı bir filtreden süzün.
- HBV'yi konsantre etmek için, 1 hacimli konsantratörü Adım 3.3'ten itibaren filtrelenmiş süpernatantın 3 hacmi ile konik bir santrifüj tüpünde seyreltin ve çözeltiyi tüp ters çevirerek dikkatlice karıştırın. Karışımı 1 saat boyunca 4 °C'ye yerleştirin. Çözeltiyi 1.500 × g, 4 °C'de 1 saat boyunca santrifüj edin ve kirli beyaz bir peletin görünür olduğundan emin olun.
NOT: Adım 3.3'ten itibaren her 30 mL filtrelenmiş süpernatant için, toplam hacmin 40 mL'sine ulaşmak için 10 mL yoğunlaştırıcı ekleyin. - HBV titresini (genom eşdeğeri) HBV 1.3-mer WT replikonu ile 1 × 102 ila 1 × 1010 arasında değişen standart bir eğri olarak, daha önce açıklandığı gibi mutlak gerçek zamanlı PCR kullanarak değerlendirin11.
- Peletin FBS'de nazikçe yeniden oluşturulması ve tek kullanımlık alikotlarda -80 °C'de 1 yıla kadar saklanması.
4. Anti-HBV giriş testi
- Olgunlaşma ortamında 6 delikli plakalarda% 100 akıcı imHC veya HepaRG'yi (Williams'ın E ortamında% 2 DMSO,% 10 FBS, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 5 μg / mL insülin, 50 μM hidrokortizon ve 2 mM L-glutamin) 2 hafta boyunca koruyun ve ortamı haftada 2 kez değiştirin.
- Ortamı aspire edin, ardından 2 saat boyunca William'ın E ortamı ile seyreltilmiş kurkumin (10-30 μM) veya 4 μM siklosporin A (CsA) ekleyin. Aday HBV giriş inhibitörünü aspire edin ve% 4 polietilen glikol içeren 1 mL William E besiyeri ile değiştirin.
- HBV parçacıklarını kültür ortamına, kuyucuk başına 100 enfeksiyon çokluğunda (MOI) ekleyin ve 18 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Süper nantantı atın, 2 mL soğuk PBS ekleyin ve eski ortamı bağlanmamış HBV ile durulamak için hafifçe döndürün.
- 7 gün boyunca 2 mL komple William's E ortamı ve kültürü ekleyin. Ortamı aspire edin, hücreleri 1x PBS ile yıkayın ve hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS'de% 3.7 paraformaldehit ile sabitleyin. Enfekte olmuş hücreleri IF bloke edici solüsyon (PBS'de% 0.2 Triton X-100 ve% 3 sığır serum albümini) ile geçirgen hale getirin ve bloke edin ve oda sıcaklığında 60 dakika boyunca inkübe edin.
- Bloke edici çözeltiye 1:200 seyreltmede birincil antikoru (anti-HBV çekirdek antijeni) ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Hücreleri 3 x 1 dakika yıkama çözeltisi ile yıkayın (PBS'de% 0.5 Ara 20).
- IF bloke edici çözeltiye ikincil antikor (1:500 seyreltme) ekleyin, oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin ve hücreleri yıkama çözeltisiyle 3 x 1 dakika yıkayın.
- Numuneyi 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile antifade montaj ortamı ile monte edin ve cam bir kapak kayması ile örtün. Bir DAPI filtresi (Ex 352-402 nM ve Em 417-477) ve bir PE filtresi (Ex 542-582 ve Em 604-644) ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak floresan sinyalini 20x objektif bir lens ile birlikte tespit edin ve aday bileşiklerin anti-HBV giriş aktivitesini belirleyin.
5. HBV-hücre bağlama testi
- Olgunlaşma ortamında 6 delikli plakalarda% 100 akıcı imHC veya HepaRG'yi (Williams'ın E ortamında% 2 DMSO,% 10 FBS, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 5 μg / mL insülin, 50 μM hidrokortizon ve 2 mM L-glutamin) 2 hafta boyunca koruyun ve ortamı haftada 2 kez değiştirin.
- Ortamı aspire edin, ardından William'ın E ortamında 2 saat boyunca seyreltilmiş kurkumin (10-30 μM) veya siklosporin A (4 μM) ekleyin. HBV giriş inhibitörünü aspire edin ve% 4 polietilen glikol içeren 1 mL William E besiyeri ile değiştirin.
- HBV parçacıklarını kültür ortamına kuyucuk başına 100 MOI'de ekleyin ve HBV'nin hepatositlere bağlanmasına izin vermek için 2 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin. İlişkisiz HBV içeren ortamı atın, 2 mL soğuk PBS ekleyin ve harcanan ortamın izlerini gidermek için hafifçe döndürün.
- Enfekte olmuş hücreleri bir hücre kazıyıcı kullanarak toplayın ve hücreleri lizis tamponu ile bozun. HBV için spesifik primerlerle gerçek zamanlı PCR kullanarak HBV DNA'sını değerlendirmek için lizatı bir toplama tüpüne aktarın ve toplam DNA'yı çıkarın (ileri primer: 5'- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3' ve ters astar: 5'- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3') iç kontrol olarak PRNP (ileri astar: 5'- GACCAATTTATGCCTACAGC-3', ters primer: 5'- TTTATGCCTACAGCCTCCTA-3').
- Adım 2.1'de açıklanan sıcaklık koşullarını kullanarak bir termal döngüdeki PCR ürünlerini yükseltin.
- 2-ΔΔCT yöntemine dayanarak kalibratör gen olarak PRNP'yi kullanarak tedaviye karşı tedavide göreceli HBV DNA seviyelerini / 1 × 106 hücreyi hesaplayın.
6. Taurokolik asit (TCA) alım testi
- % 100 akıcı imHC ve HepaRG hücrelerini olgunlaşma ortamında 14 gün boyunca saklayın.
- Ortamı aspire edin ve hepatositleri 1x PBS ile yıkayın. William'ın E ortamında 2 saat boyunca seyreltilmiş kurkumin veya siklosporin A (10-50 μM) ekleyin. Ortamı sodyum taurokolik asit çözeltisi (1x HEPES'te 0.5 M sodyum taurokolat hidrat) ile değiştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Sodyum taurokolik asit çözeltisini aspire edin ve 3x'i soğuk 1x HEPES ile yıkayın. 300-500 μL soğuk 1x HEPES ekleyin ve hücreleri buz üzerinde hücre kazıyıcılarla toplayın.
- 20 s için 20 kHz frekansında ultrasonikasyon ile hücreleri homojenize edin ve 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Hücre kalıntılarını çökeltmek için lizatları 20 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüj yapın. Süpernatantı toplayın ve bir TCA ELISA tahlil kiti kullanarak hücre içi taurokolik asit konsantrasyonunu değerlendirin (bkz.
7. İzotermal titrasyon kalorimetrisi kullanılarak protein-ligand etkileşimlerinin belirlenmesi
NOT: Bu tahlil sistemi MicroCal PEAQ-ITC (ITC yazılımı) temel alınarak geliştirilmiştir.
- Tamponu hazırlayın (50 mM Tris-HCl tampon, pH 7.0).
- Arabellekte 15 μM NTCP hazırlayın.
- Tamponda 150 μM adayı HBV giriş inhibitörü solüsyonları hazırlayın.
- Tamponu kullanarak ITC cihazındaki numune hücresini, referans hücreyi ve şırıngayı yıkayın (Adım 7.1.).
- Windows sistemlerinde yazılım simgesine çift tıklayarak ITC yazılımını başlatın. Denemeyi çalıştır vurgulama sekmesinin altında, 19 Injection.itcm için microCal Yöntemi'ni seçin ve aç'a tıklayın. Yeni bir pencere açıldığında, temizle sekmesine tıklayın ve Temizleme Yöntemi penceresinde, Hücre Temizleme Yöntemi için Yıka düğmesini ve Şırınga Temizleme Yöntemi için Durulama düğmesini seçin. İleri'ye tıklayın ve ekrandaki talimatları izleyin.
NOT: Yıkama adımının tamamlanması 1,4 saat sürebilir.
- Windows sistemlerinde yazılım simgesine çift tıklayarak ITC yazılımını başlatın. Denemeyi çalıştır vurgulama sekmesinin altında, 19 Injection.itcm için microCal Yöntemi'ni seçin ve aç'a tıklayın. Yeni bir pencere açıldığında, temizle sekmesine tıklayın ve Temizleme Yöntemi penceresinde, Hücre Temizleme Yöntemi için Yıka düğmesini ve Şırınga Temizleme Yöntemi için Durulama düğmesini seçin. İleri'ye tıklayın ve ekrandaki talimatları izleyin.
- Numuneyi ITC'ye yükleyin; Denemeyi Çalıştır sekmesinin altında, Yükle düğmesine tıklayın ve ekrandaki talimatları okuyun. İleriye tıklayın ve bu yükleme adımı tamamlanana kadar video talimatlarını izleyin.
- Referans hücresini bir şırınga kullanarak çözelti tamponuyla doldurun. Bir şırınga kullanarak numune hücresini tamponda 15 μM NTCP ile doldurun ve numune hücresi üzerindeki fazla NTCP çözeltisini çıkarın. Şırıngayı 150 μM kurkumin (ligand) çözeltisi ile doldurun ve şırıngadaki hava kabarcıklarından kaçının.
- Örneği çalıştırın ve Denemeyi Çalıştır sekmesinin altında Çalıştır düğmesine tıklayın. Sol taraftaki deneysel bilgileri ve deneysel ortamı gösteren pencereleri gözlemleyin. Ligand ve protein konsantrasyonlarını [Syr] içinde 150 μM, [Hücre] içinde 15 μM ve sıcaklıkta 25 °C olarak girin.
- Yazılımda, enjeksiyon işlemini gerçekleştirmek için başlat'a tıklayın ve protein-ligand etkileşiminin tamamlanması için 1.4 saat bekleyin.
NOT: Soluk analiz düğmesi yazılım pencerelerinin altında görünür. - Enjeksiyon tamamlandıktan sonra analiz düğmesinin aydınlandığını gözlemleyin. Analiz yazılımını kullanarak ham verileri analiz etmek için kontrol yazılımındaki analiz düğmesine tıklayın. Ham verileri görüntülemek için genel bakışa tıklayın ve uygun modeli Tek Bir Bağlama Sitesi Kümesi olarak seçin.
- Bağlama durumunun deneysel verileri (bağlama, bağlama yok, kontrol veya kontrol verileri) gösterdiğinden ve deneme değerlerinin (KD, ΔG, ΔH, TΔS ve N) yazılım panelinde sunulduğundan emin olun.
- Hidrojen bağı, van der Waals bağı ve hidrofobik etkileşim dahil olmak üzere etkileşim bağlanmasını tahmin eden termodinamik parametreleri tif veya jpeg formatına aktarın.
- Deneme tamamlandıktan sonra, Adım 7.4'ü izleyerek örnek hücreyi yıkayın.
8. İstatistiksel analiz
- Tüm deneyleri üç bağımsız kopyada gerçekleştirin (n = 3).
- Deneysel verileri SD ± olarak sunar ve istenen istatistiksel analiz yazılımını kullanarak istatistiksel analiz yapar.
- İki ortalama değer arasında karşılaştırma yapmak için iki kuyruklu eşlenmemiş bir Öğrenci t-testi kullanın veya bir kontrol değerine birden fazla değer arasında çoklu karşılaştırmalar için Dunnett ile tek yönlü varyans analizi (ANOVA) uygulayın. Anlamlılık düzeyini p ≤ 0,05 olarak ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Özellikle imHC'nin diferansiye aşamasında binüklee hücreler ve poligonal şekilli morfoloji (Şekil 1) dahil olmak üzere hepatik olgunlaşma özellikleri gözlenmiştir (Şekil 1A). NTCP ekspresyonunda büyük bir artış d-HepaRG ve d-imHC'de sırasıyla 7 kat ve 40 kat olarak ölçülmüştür (Şekil 1B). HBV girişine duyarlılık kazandırdığı varsayılan NTCP'nin yüksek glikozile formu, d-imHC'de d-HepaRG'ye göre daha fazla saptandı (Şekil 1C). Diferansiye imHC, farklılaşmamış hücrelere göre% 65.9 daha yüksek NTCP seviyeleri içeriyordu (Şekil 1D).
Şekil 2A , profilaktik tedavinin bir özetini göstermektedir. Şekil 2B, enfeksiyon sonrası 7. günde anti-HBV giriş aktivitelerini değerlendirmek için yapılan HBV immünofloresan boyamasını gösterirken, Şekil 2C , HBV bağlama testi protokolünü özetlemektedir. Hücre yüzey reseptörü üzerindeki HBV bağlanma düzeyi gerçek zamanlı PCR ile değerlendirildi (Şekil 2D). NTCP'nin HBV ataşmanı için reseptör olup olmadığını belirlemek için, aday bağlayıcı inhibitörler için TCA alımı belirlendi (Şekil 2E). Bu modele dayanarak, aday bileşiklerin varsayılan inhibitör aktivitesi, NTCP yoluyla HBV bağlanmasını azaltmıştır.
Kalorimetrik değişiklik, numune hücresine sürekli enjeksiyonlarla tespit edildi (Şekil 3). Standart bir doğrusal olmayan en küçük kareler regresyonu, verilere iyi oturmuş bir bağlama bölgesine dayanarak çizildi. Düz çizgi, deneysel değerlere en uygun olanı gösterdi (Şekil 3A, B). Tablo 1 , NTCP'nin siklosporin A (CsA) veya aday bir bileşik ile bağlanması ile ilişkili termodinamik parametreleri göstermektedir.
Şekil 1: NTCP karakterizasyonu ile HepaRG ve imHC'nin hepatik olgunlaşması. Her iki hücre hattı da 2 hafta boyunca hepatik olgunlaşma ortamında kültürlendi. (A) Binüklee hücreler ve poligonal şekilli morfoloji gibi hepatosit özellikleri sadece imHC'nin olgunlaşma aşamasında gözlenmiştir. Ölçek çubukları = 50 μm. (B) NTCP ekspresyonu hem HepaRG hem de imHC'de yukarı regüle edildi. GAPDH ile normalize edilen NTCP, imHC'de HepaRG'den daha yüksekti. (C) Olgunlaşmadan sonra NTCP'nin yüksek glikozile edilmiş bir formu gözlendi. (D) d-imHC'de NTCP yükselme yüzdesi akım sitometrisi kullanılarak değerlendirildi. *, ** ve *** sırasıyla p ± 0.05, p < 0.01 ve p < 0.001 ile istatistiksel farkı temsil <. Kısaltmalar: NTCP = sodyum taurokolat birlikte taşınan polipeptit; GAPDH = gliseraldehit 3-fosfat dehidrojenaz; NTCP-FITC = floresein izotiyosiyanat etiketli NTCP. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Profilaktik CCM tedavisi viral girişi, hücre içi HBV DNA'sını ve TCA alım aktivitesini azalttı. (A) d-imHC, HBV ile aşılamadan önce 2 saat boyunca CCM ile ön tedavi edildi. (B) Anti-HBV giriş aktivitesi, enfeksiyon sonrası 7. günde immünofloresan boyama ile belirlendi. (C) HBV bağlama protokolünün şematik bir zamanlaması sunulur. (D) Hepatositler üzerindeki bağlı HBV DNA düzeyi değerlendirildi ve 4 μM CsA ve klasik HBV giriş inhibitörü 25 ünite/mL heparin ile karşılaştırıldı. (E) 10-30 μM CCM'nin TCA alım inhibisyonu üzerindeki etkisine NTCP reseptörü aracılığıyla aracılık edildi. Kısaltmalar: CCM = curcumin; HBV = hepatit B virüsü; TCA = taurokolik asit; d-imHC = farklılaşmış imHC; CsA = siklosporin A; HP = heparin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: NTCP'nin bireysel moleküllere (CsA veya aday bileşik) afinitesi ITC kullanılarak gösterilmiştir. NTCP'nin (A) CsA veya (B) kurkumin ile kombinasyonu için ITC profili, NTCP çözeltisine (15 μM NTCP, pH 7.0, 25 ° C) bir bileşiğin (150 μM CsA veya aday) sıralı enjeksiyonundan üretilmiştir. Diferansiyel güç (μcal/s) ve zaman (min) arasındaki kalorimetrik ham veriler çizildi. Veriler, katı çizgilerin en uygun sonuçları gösterdiği tek bölgeli bir bağlama modeline dayanarak analiz edildi. NTCP çözeltisine ligandların (CSA veya kurkumin) enjeksiyonu sırasında, entalpi (ΔH), numune hücresindeki ligand konsantrasyonunda bir artıştan sonra değişti. Bu veriler bağlanma reaksiyonunun oluştuğunu göstermektedir. Kısaltmalar: CsA = siklosporin A; NTCP = sodyum taurokolat birlikte taşıyan polipeptit; ITC = izotermal titrasyon kalorimetrisi; DP = diferansiyel güç. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Protein | Ligand | Bağlama sabiti (KD) | Entalpi değişimi (ΔH) | Entropi değişimi (ΔTΔS) | Gibbs Serbest Enerji değişimi (ΔG) | Bağlama türü |
| (M-1) | (kcal/mol) | (kcal/mol) | (kcal/mol) | |||
| İnsan NTCP'si (SLA10A1) | CCM | 1.21 ×10-6 | -1 | 0.6 | -0.39 | Hidrojen bağı |
| İnsan NTCP'si (SLA10A1) | TCA | 1 ×10-9 | 80 | -96 | -16 | Hidrofobik etkileşim |
Tablo 1: NTCP ile ITC kullanılarak bireysel bileşikler (CCM ve TCA) arasındaki etkileşimden kaynaklanan termodinamik parametreler. Kısaltmalar: NTCP = sodyum taurokolat birlikte taşınan polipeptit; CCM = kurkumin; TCA = taurokolik asit; ITC = izotermal titrasyon kalorimetrisi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HBV enfeksiyonu, hepatositler25 üzerindeki heparan sülfat proteoglikanlarına (HSPG'ler) düşük afiniteli bağlanma ile başlatılır, ardından endositoz26 yoluyla daha sonra içselleştirme ile NTCP'ye bağlanır. NTCP, HBV girişi için çok önemli bir reseptör olduğundan, HBV girişini hedeflemek, de novo enfeksiyonu, anneden çocuğa bulaşmayı (MTCT) ve karaciğer nakli sonrası nüksünü azaltmak için klinik olarak çevrilebilir. Viral girişin kesilmesi, kronik HBV enfeksiyonu için uygulanabilir bir alternatif tedavi olacaktır.
Yukarıda belirtilen protokoldeki bazı kritik adımlar burada özetlenmiştir. Konakçı hücreleri hazırlarken,% 2 DMSO ile olgunlaşma ortamını eklemeden önce hepatositlerin% 100 akıcılığa ulaştığından emin olun. Subkonfluent hepatositlerin %2 DMSO'da kültürlenmesi hücre ölümüne ve dekolmanı ile sonuçlanacaktır. NTCP ekspresyonu27,28'i en üst düzeye çıkarmak için olgunlaşma süresi 4 haftaya kadar uzatılabilir, ancak 2 haftalık bir olgunlaşma süresi önerilir.
Hücresel NTCP ekspresyonunun nicelleştirilmesi için üç teknik önerilmiştir. Kullanıcıların en aşina oldukları tekniği seçmeleri önerilir; Burada batı leke analizine göre akış sitometrisini tercih ettik çünkü kullanışlı, hızlı ve kolay.
Hücre kültüründen türetilmiş HBV parçacıklarının (HBVcc) üretimi için HepG2.2.15, genetikin (G418) direnç geni29 ile birlikte HBV tam uzunlukta genom ile geçici transfeksiyon yoluyla HepG2'den türetilmiştir. Kültür ortamı 380-500 μg / mL genetikin içermelidir, aksi takdirde hücreler HBVcc üretmez. Düşük protein bağlayan, 0.45 μm filtre, HBV verimini kaybetmemek için süpernatantı netleştirmek için kullanılmalıdır. HBV'yi konsantre etmek için, standart bir santrifüj ile polietilen glikol (PEG) kullanıldı. HBV parçacıkları ayrıca bir sakkaroz gradyanı ve ultrasantrifüjleme kullanılarak konsantre edilebilir. Enfeksiyon azalacağı için çoklu donma ve çözülme döngülerinden kaçınılmalıdır.
Anti-HBV giriş testinde, hepatositler olgunlaşma indüksiyonundan önce% 100 birleşime ulaşmalıdır. Bu protokol profilaktik tedaviye dayalı olarak geliştirilmiştir. Konakçı hücreler, HBV12 ile enfeksiyondan önce 2 saat boyunca aday bileşiklere maruz bırakıldı. Enfeksiyondan 7 gün sonra, HBV enfeksiyonu immünofloresan kullanılarak değerlendirildi. Tüm bileşenler, blokaj çözeltisinin konsantrasyonları, birincil ve ikincil antikorlar ve yıkama adımları, minimum spesifik olmayan lekelenme ile en iyi sonucu elde etmek için optimize edilmelidir. Burada, optimize edilmiş konsantrasyonlar ve teknikler sağladık.
TCA alım testi protokolü, NTCP transportunun inhibisyonu için altın standardı tanımlamaktadır. Radyoaktif TCA'yı önlemek için protokolü değiştirdik. TCA alım testi için kritik adımlar hücre yıkama ve hasattır. Tüm bu prosedürler, bileşiğin daha fazla hücresel aktivitesini-içselleşmesini önlemek için her zaman buz üzerinde yapılmalıdır. Hücreleri homojenize ettikten ve hücre kalıntılarını peletledikten sonra, süpernatant pelet bozulmadan nazikçe aspire edilmelidir. Kullanıcının tesisi sıvı sintilasyon tekniğinin kullanımına izin veriyorsa, TCA taşıma ve alım çalışmalarında 3H-taurokolik asit yaygın olarak kullanılır. ELISA kullanarak TCA alımını doğruladığımız için, bu alternatif teknik radyoaktif bileşiğin kullanımının yerini alabilir.
ITC, çözünür proteinler ile küçük moleküler ağırlıklı ligandlar arasındaki etkileşimlere bağlı termodinamik parametreleri belirlemek için yaygın olarak kullanılan biyofiziksel bir yöntemdir30,31. Bu teknik, çeşitli ligandların küçük bir molekül veya protein ile etkileşimini araştırmak için kullanılabilir. ITC, sinyal tespiti için ek adımlar, moleküler ağırlık sınırlamaları ve etiketleme, immobilizasyon veya başka herhangi bir kimyasal modifikasyon içermeyen doğrudan ve invaziv olmayan bir yöntemdir. ITC'nin sınırlandırılması, etkileşime giren malzemelerin yüksek konsantrasyonlarının ön koşuludur. Protein ve ligand, karıştırılarak 1 saat boyunca 25 °C'de suda (10-100 μM) yüksek oranda arıtılmalı ve yeterince çözünür olmalıdır. Kararsız protein çözeltisi, zamanın bir fonksiyonu olarak ısı sinyali değişimi yoluyla tespit edilebilir.
İnsan tarafından geliştirilmiş NTCP hepatositleri, HBV enfeksiyonunun in vitro çalışması için alternatif bir model sağlar, ancak HepaRG ve primer insan hepatositlerine benzer. Bu konakçı modeller, sınırlı güvenilirlikleri ve duyarlılıklarınedeniyle engellenmektedir 8,33. HepG2-NTCP veya Huh7-NTCP hücrelerinde verimsiz HBV yayılımı, HBVcc üreten hücrelerden türetilen düşük HBV inokülümü ile kanıtlanmıştır. Birkaç çalışmada, HBV, hedef hücreleri 1.00033,34'lük bir MOI'de enfekte etmek için kullanıldı. HBVcc'deki subviral parçacıklar HBV zarf proteini (L / M / S) içerir ve NTCP'yi rekabetçi bir şekilde bağlar, bu da enfeksiyonun azalmasına neden olur35. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, bu protokol NTCP seviyelerini en üst düzeye çıkarmak için HepaRG veya imHC kültürünü bir olgunlaşma protokolü ile değiştirdi. HepG2.2.15'ten türetilen HBVcc, inokülum olarak kullanılmadan önce konsantre edildi. HBV kor antijeni11'in ölçümüne bağlı olarak diferansiye imHC'de HBV infektivitesi %80'den yüksekti.
Viral girişi kesmek için NTCP'yi hedef alan anti-HBV bileşiklerinin tanımlanmasını tanımladık ve NTCP seviyelerini artırmak için hepatik olgunlaşma prosedürünü benimsedik. Giriş inhibitörlerini tanımlamak için, hepatositler, viral bağlanmaya izin vermek için 4 ° C'de HBV ile enfeksiyondan önce 2 saat boyunca aday bileşiklerle ön işlemden geçirildi, ancak girişe izin verilmedi. HBV infektivitesindeki azalma enfeksiyon sonrası 7. günde değerlendirildi. Temsili veriler, modeli doğrulamak için pozitif bir kontrol olarak klasik bir NTCP inhibitörü olan siklosporin A'yı içeriyordu.
NTCP hem taşıyıcı hem de reseptör aracılı endositoz fonksiyonlarını kolaylaştırdığından, HBV giriş inhibitörleri bu mekanizmalardan en az birini hedefleyebilir. NTCP transportunun inhibisyonu, ELISA'ya dayalı bir TCA alım testi kullanılarak değerlendirilebilir ve radyoaktif TCA'yı klasik protokol36'dan elimine eder. NTCP ve giriş inhibitörü arasındaki afinite ITC kullanılarak ölçüldü. Bu teknik, stokiyometri (n), ayrışma sabiti (KD), serbest enerjideki değişim (ΔG), entalpi (ΔH), entropi (ΔS) ve bağlanmanın ısı kapasitesi (ΔCp) dahil olmak üzere temel termodinamik parametreleri sağlamıştır. Çeşitli anti-HBV ajanları, bir nükleozid analoğu olan lamivudin ile karşılaştırılabilir HBV ters transkriptazı spesifik olarak bağlayabilen quercetin, rutin, hesperidin ve luperol gibi moleküler kenetlenme ile tanımlanmıştır. Bileşikler ITC kullanılarak araştırıldı ve HBV polimeraz37 ile -9.3 ila -5.2 kcal / mol arasında değişen negatif Gibb enerjisi (-ΔG) ve 1 × 10-6 ila 1 × 10-3 M KD sergiledi. Birlikte ele alındığında, yukarıda belirtilen bu testlerden elde edilen veriler, HBV giriş inhibitörleri olarak işlev gören aday bileşiklerin antiviral etkinliğinin taranmasına yardımcı olacaktır. Oluşturulan protokol, yeni NTCP antagonistlerini / inhibitörlerini keşfetmek için yararlı olacaktır. Viral girişin baskılanması profilaktik ve terapötik tedavide yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan etmektedir.
Acknowledgments
Bu araştırma projesi, Mahidol Üniversitesi ve Tayland Bilim Araştırma ve İnovasyon (TSRI) tarafından ayrı ayrı A. Wongkajornsilp ve K. Sa-ngiamsuntorn'a verilen desteklenmektedir. Bu çalışma, Ulusal Yüksek Öğretim Bilim Araştırma ve İnovasyon Politikası Konseyi Ofisi tarafından Rekabet Edebilirlik Program Yönetim Birimi (hibe numarası C10F630093) aracılığıyla finansal olarak desteklenmiştir. A. Wongkajornsilp Mahidol Üniversitesi Siriraj Hastanesi Tıp Fakültesi Chalermprakiat hibesi sahibidir. Yazarlar, ITC tekniğindeki yardımları için Bayan Sawinee Seemakhan'a (Mahidol Üniversitesi Fen Fakültesi, İlaç Keşfi Mükemmel Merkezi) teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
| Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
| Reagents | |||
| 4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
| BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
| Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
| G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
| HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
| Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
| Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
| Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
| Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
| RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
| TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
| TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
| Antibodies | |||
| Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
| Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
| HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
| Reagent composition | |||
| 1° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Hepatic maturation medium | |||
| Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| 5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
| 50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
| 2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| IF Blocking solution | |||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| 0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
| RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
| Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
| PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
| NaF | Final concentration: 10 mM | ||
| Western blot reagent | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
| WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
| 1x Running buffer 1 L | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
| SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
| Blot transfer buffer 500 mL | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
| Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
| Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
| Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
| SDS | Merck | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
| Equipments | |||
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
| CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
| FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
| Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
| Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
| Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
| PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
| T-75 cell culture flask | Corning | 431464U | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
| Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
| Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |
References
- Levrero, M., Zucman-Rossi, J.
- Kim, K. -H., Kim, N. D., Seong, B. -L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).
- Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints. Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).
- Volz, T., et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus. Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).
- Mak, L. -Y., Seto, W. -K., Yuen, M. -F. Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection. Viruses. 13 (6), 1169 (2021).
- Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. HBV and HDV: New Treatments on the Horizon. Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054 (2021).
- Iwamoto, M., et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).
- Tong, S., Li, J. Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning. Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).
- Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity. Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).
- Thongsri, P., et al. Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding. Scientific Reports. 11 (1), 19125 (2021).
- Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV. Viruses. 11 (10), 952 (2019).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).
- Kaneko, M., et al. A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).
- Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection. PLoS One. 12 (1), 0170419 (2017).
- Tsukuda, S., et al. A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins. Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).
- Klumpp, K., et al. High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).
- Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B. JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).
- Saso, W., et al. A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).
- Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).
- Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
- Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796 (2011).
- Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144 (2016).
- Sureau, C., Salisse, J. A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant. Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).
- Herrscher, C., et al. Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis. Cellular Microbiology. 22 (8), 13205 (2020).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Mayati, A., et al. Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin. Scientific Reports. 8 (1), 16115 (2018).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).
- Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).
- Srivastava, V. K., Yadav, R. Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. Misra, G. , Academic Press. 125-137 (2019).
- Seeger, C., Mason, W. S. Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus. Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).
- Seeger, C., Sohn, J. A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, 216 (2014).
- Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
- Chai, N., et al. Properties of subviral particles of hepatitis B virus. Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).
- Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes. Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).
- Parvez, M. K., et al. Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study. Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).
