Ensayos in vitro estandarizados para visualizar y cuantificar las interacciones entre neutrófilos humanos y biopelículas de Staphylococcus aureus

Una biopelícula es una comunidad de microbios asociados a la superficie o agregados no unidos encerrados en una sustancia polimérica extracelular (EPS)^1,2. Estas comunidades protegen los microorganismos encerrados de los factores estresantes ambientales, incluida la tolerancia a los agentes antimicrobianos y al sistema inmunológico³. Varias especies microbianas patógenas forman biofilms que han sido asociados con infecciones crónicas⁴. El desarrollo de biopelículas es un proceso intrincado que implica la fijación a superficies, la producción de EPS, la proliferación celular, la estructuración de biopelículas y el desprendimiento celular⁵. Una vez que las células se dispersan para formar una biopelícula, permanecen planctónicas o se translocan a un nuevo sustrato y reinician el desarrollo de la biopelícula⁶.

Staphylococcus aureus, un patógeno oportunista, sigue un esquema general de desarrollo de biopelículas, incluyendo adhesión, proliferación, maduración y dispersión⁷. El proceso de unión en biopelículas de S. aureus está dictado por interacciones hidrofóbicas, ácidos teicoicos y componentes de superficie microbiana que reconocen moléculas de matriz adhesiva (MSCRAMMs)^8,9. A medida que comienza la proliferación de S. aureus, se produce EPS, que consiste principalmente en polisacáridos, proteínas, ADN extracelular y ácidos teicoicos⁵. A medida que se producen componentes EPS, también se producen varias exoenzimas y moléculas pequeñas, lo que contribuye a la estructura 3-dimensional de la biopelícula y ayuda en el desprendimiento⁵. S. aureus aprovecha este estilo de vida altamente coordinado para establecer diversas infecciones crónicas, incluyendo infecciones debidas a la permanencia de dispositivos médicos¹⁰.

El S. aureus resistente a la meticilina (SARM) es una de las principales causas de infecciones relacionadas con dispositivos médicos permanentes, como catéteres venosos y urinarios centrales, articulaciones protésicas, marcapasos, válvulas cardíacas mecánicas y dispositivos intrauterinos¹¹. Durante tales infecciones, los neutrófilos son las primeras células inmunes del huésped reclutadas en el sitio de la infección para combatir los patógenos a través de múltiples estrategias¹². Estos incluyen fagocitosis, desgranulación, producción reactiva de especies de oxígeno y nitrógeno (ROS/RNS) o liberación de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) para eliminar patógenos¹³.

La generación de ROS tras la fagocitosis de microbios es una de las respuestas antimicrobianas clave exhibidas por los neutrófilos¹⁴. La fagocitosis aumenta si los microbios están recubiertos de opsoninas, particularmente inmunoglobulinas y componentes del complemento que se encuentran en el suero¹⁵. Los microbios opsonizados son reconocidos por los receptores de la superficie celular en los neutrófilos y engullidos, formando un compartimento llamado fagosoma¹⁵. Los neutrófilos generan y liberan ROS en el fagosoma a través de la NADPH-oxidasa¹⁶ asociada a la membrana. Este complejo enzimático multicomponente genera aniones superóxido mediante la transferencia de electrones al oxígeno molecular¹⁶. Además, los neutrófilos también generan RNS a través de la expresión de óxido nítrico sintasa inducible (iNOS)¹⁷. Estos radicales con alto superóxido y óxido nítrico dentro del fagosoma tienen amplias actividades antimicrobianas. Pueden interactuar con centros metálicos en enzimas y dañar ácidos nucleicos, proteínas y membranas celulares del patógeno 18,19,20,21. Numerosos microbios adoptan un estilo de vida de biopelícula y emplean diferentes estrategias para evadir la muerte por ROS^22,23. Por lo tanto, los ensayos estandarizados que acoplan biopelículas con neutrófilos para cuantificar ROS son beneficiosos para obtener resultados consistentes.

Mientras que los ensayos, como la cuantificación de la producción de ROS de neutrófilos, proporcionan información sobre las respuestas de los neutrófilos a las biopelículas, la capacidad de visualizar las interacciones de los neutrófilos dentro de una biopelícula también puede servir como una herramienta poderosa. El uso de colorantes fluorescentes para microscopía a menudo requiere optimización para obtener imágenes de alta calidad que se pueden utilizar para el análisis de imágenes de microscopía. La flexibilidad para optimizar algunas condiciones es limitada, ya que los neutrófilos pueden sufrir la muerte celular después del aislamiento. Además, las biopelículas generalmente se lavan para eliminar la población planctónica de la configuración experimental antes de la adición de neutrófilos. Durante el lavado, la variabilidad entre las biopelículas replicadas puede surgir debido a la pérdida de biomasa parcial si las biopelículas se adhieren libremente a la superficie.

En términos generales, los métodos actuales en el campo para analizar las interacciones entre neutrófilos y biopelículas incluyen principalmente microscopía, citometría de flujo y enumeración de unidades formadoras de colonias (UFC)^24,25,26,27. La microscopía implica el uso de colorantes que tiñen directamente los neutrófilos y las biopelículas, o se dirigen a diversas respuestas de neutrófilos contra microbios como la formación de NET, la desgranulación y la muerte celular^25,28. Un subconjunto de estas respuestas, como la muerte celular de neutrófilos y la desgranulación, también puede analizarse mediante citometría de flujo, pero requiere que los neutrófilos no se asocien preferentemente con grandes agregados de microbios en una biopelícula^28,29. La citometría de flujo también puede cuantificar algunos parámetros del biofilm, como la viabilidad celular²⁷. Estos procesos, sin embargo, requieren la interrupción de la biomasa de biofilm y no serían útiles para visualizar otras interacciones importantes como la distribución espacial de los neutrófilos y sus componentes dentro de un biofilm^27,29,30.

El presente protocolo se centra en adaptar algunos de los métodos utilizados tradicionalmente para estudiar las interacciones neutrófilos-biofilm en biofilms que han sido optimizados para proporcionar una variabilidad mínima durante la manipulación. Por lo tanto, este protocolo proporciona métodos estandarizados para cultivar y cuantificar biopelículas, aislar neutrófilos humanos primarios de sangre periférica, cuantificar la producción de ROS y visualizar las interacciones biopelícula-neutrófilos a través de microscopía. Este protocolo se puede adaptar a diferentes sistemas para comprender las interacciones biopelícula-neutrófilos teniendo en cuenta la heterogeneidad entre los grupos de donantes.

Todos los procedimientos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Estatal de Ohio (IRB) (2014H0154). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los donantes para recolectar sangre periférica para aislar neutrófilos humanos primarios. Staphylococcus aureus (USA300 LAC)³¹ se utilizó como organismo modelo para realizar los experimentos. Los experimentos se realizaron con el equipo de protección personal (EPP) adecuado debido a la posible exposición a un patógeno transmitido por la sangre.

1. Preparación del biofilm in vitro

1. Obtener colonias aisladas de S. aureus a partir de un stock criopreservado 31 utilizando una técnica de placa rayada^32,33 en una placa de agar rica en nutrientes^, como el agar tríptico de soja (ver Tabla de materiales).
2. Recubrir los pocillos individuales de una placa de 96 pocillos con 100 μL de poli-L-lisina (PLL) al 0,001% (v/v) diluida en_H2Oestéril e incubar a temperatura ambiente durante 30 min. Asépticamente, aspire la solución de PLL utilizando una trampa de aspiración asistida por vacío. Deje que los pocillos se sequen durante la noche a temperatura ambiente.
   NOTA: Todos los pasos de aspiración en el protocolo se realizan utilizando una trampa de aspiración asistida por vacío a menos que se indique lo contrario.
3. Preparar un cultivo nocturno inoculando una colonia de S. aureus en medio esencial mínimo alfa (MEMα) suplementado con glucosa al 2% e incubar a 37 °C, agitando a 200 rpm durante 16-18 h.
4. Diluir el cultivo nocturno transfiriendo de 50 μL a 5 ml de MEMα fresco suplementado con glucosa al 2% e incubar a 37 °C, agitando a 200 rpm, hasta la fase logarítmica media, generalmente entre densidad óptica 600 (OD_600nm) de 0.5-0.8. Utilice MEMα para normalizar el cultivo logarítmico medio a un OD_600nm de 0,1.
5. Transfiera 150 μL de cultivo normalizado a cada pocillo de la placa de 96 pocillos tratada con PLL. Incubar estáticamente durante 18-20 h en una cámara humidificada a 37 °C.
   NOTA: Las biopelículas también se pueden cultivar en otros formatos, como diapositivas de μ canales (consulte la Tabla de materiales).
6. Aspirar el sobrenadante para eliminar las células planctónicas. Lave suavemente la biomasa restante con 150 μL de solución salina equilibrada (HBSS) de Hanks para eliminar las células no unidas. Agregue HBSS gota a gota para evitar interrumpir la biopelícula.
   NOTA: Mientras aspira el sobrenadante y HBSS durante los lavados, deje suficiente líquido (sobrenadante o HBSS) en los pocillos que contienen biopelícula de modo que la biopelícula aún esté sumergida. Esto evita la interrupción de la estructura de la biopelícula cuando se agrega HBSS gota a gota para lavar la biopelícula.
7. Repita el paso 1.6 al menos dos veces más para eliminar todas las células planctónicas. En este punto, las biopelículas están listas para experimentos inmediatos aguas abajo.
   NOTA: Si las biopelículas no se utilizan para experimentos con neutrófilos, HBSS se puede sustituir con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se prefiere HBSS sobre PBS ya que HBSS contiene componentes, incluida la glucosa, que proporcionan condiciones óptimas para la activación de neutrófilos³⁴.

2. Cuantificación de biomasa de biofilm

1. Prepare una reserva de solución de Crystal Violet (CV) al 0,1% (p/v) (consulte la Tabla de materiales) disolviendo en etanol al 20% (v/v) y al 80% (v/v) H2O. Asegúrese de que el CV esté completamente disuelto en etanol antes de agregar_H2O. Filtre la solución.
2. Añadir 150 μL de solución CV al 0,1% al biofilm lavado e incubar durante 20 min a temperatura ambiente. Utilice al menos tres pozos vacíos como controles de sólo medios.
3. Aspirar la solución CV al 0,1% de los biofilms y lavar los biofilms teñidos con 200 μL de 1x PBS. Repita este proceso para un total de tres lavados para eliminar cualquier exceso de CV de los pocillos.
4. Añadir 150 μL de ácido acético glacial al 33% (v/v) diluido con_H2O. Incubar a temperatura ambiente en un balancín a 50 rpm durante 30 min para permitir que el CV unido a la biomasa se disuelva completamente.
   PRECAUCIÓN: Realice este paso en una campana de flujo laminar con el EPP adecuado, ya que el ácido acético glacial es un producto químico corrosivo.
5. Mientras tanto, configure el lector de microplacas (consulte la Tabla de materiales) para leer los valores de tinción CV. Después del tratamiento con ácido acético glacial, lea la placa a una longitud de onda de 595 nm.
   NOTA: La longitud de onda utilizada para medir el OD de CV puede variar de 500-600 nm³⁵.

3. Aislamiento de neutrófilos

NOTA: Los neutrófilos fueron aislados siguiendo un método previamente publicado con cambios menores³⁶. Este protocolo de aislamiento combina primero la centrifugación por gradiente de densidad, seguida de la sedimentación con dextrano al 3%. Esta sección solo cubre el protocolo general de aislamiento de neutrófilos, centrándose en los cambios realizados en el protocolo publicado. Además, el protocolo descrito a continuación es uno de los muchos métodos que pueden aislar neutrófilos y pueden sustituirse según sea necesario. Otros métodos para aislar neutrófilos incluyen el uso de medios de separación celular o separación celular de anticuerpos magnéticos³⁷.

1. Extraer sangre de un donante adulto por venopunción, según el protocolo descrito en el IRB institucional. Antes de la extracción de sangre, asegúrese de que la jeringa tenga suficiente heparina sin conservantes, de modo que la concentración final de heparina sea de 20 U/ml.
2. Diluir la sangre heparinizada con 3/4 del volumen de NaCl libre de endotoxinas al 0,9% (ver Tabla de Materiales) en_H2Oa temperatura ambiente.
3. Por cada 20 ml de la muestra de sangre diluida, alícuota 14 ml de un medio de gradiente de densidad disponible comercialmente (ver Tabla de materiales) en un tubo cónico fresco de 50 ml. Coloque cuidadosamente la muestra de sangre diluida sobre el medio de gradiente de densidad.
4. Centrifugar la muestra de sangre en capas a 400 x g durante 40 min a temperatura ambiente. Asegúrese de que la centrífuga tenga una rotura lenta para evitar alterar la capa una vez que se complete la centrifugación.
   NOTA: La muestra de sangre tendrá cinco capas que contienen una mezcla de solución salina y plasma, una capa de células mononucleares, medio de gradiente de densidad, neutrófilos y eritrocitos.
5. Usando una pipeta serológica, aspirar todas las capas por encima de los neutrófilos y el pellet de eritrocitos, seguido de una suave resuspensión del pellet en NaCl libre de endotoxinas frías al 0,9% en_H2O. Para cada pellet generado a partir de una muestra de sangre de 20 ml, resuspenda el pellet a 20 ml de volumen total. Agregue un volumen de 1:1 de dextrano al 3% (consulte la Tabla de materiales). Incubar el tubo en posición vertical durante 18-20 minutos sobre hielo.
   NOTA: Asegúrese de que el dextrano al 3% esté hecho con NaCl al 0,9% libre de endotoxinas en_H2O.
6. Extraer 20 ml de la capa superior que contiene neutrófilos y algunos eritrocitos en un nuevo tubo cónico de 50 ml y centrifugarlo a 355 x g durante 10 min a 4 °C. Vierta el sobrenadante dejando atrás una bolita roja.
7. Resuspender suavemente el pellet en 10 ml de_H2Ofrío y estéril durante 30 s para lisar los eritrocitos restantes. Agregue inmediatamente 10 ml de solución salina fría al 0,9% libre de endotoxinas a la mezcla para restaurar la tonicidad. Centrifugar la solución a 233 x g durante 3 min a 4 °C.
8. Vierta el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet que contiene 95% -97% de neutrófilos en 1 ml de HBSS frío por 20 ml de la muestra de sangre.
9. Transfiera 10 μL de los neutrófilos resuspendidos en 90 μL de colorante de exclusión azul de tripano al 0,4% y cuente las células utilizando un hemocitómetro (ver Tabla de materiales).
   NOTA: Las células no viables se tiñen de azul ya que el colorante de exclusión azul tripano es impermeable en las células viables. Este protocolo proporciona >99% de viabilidad celular^37,38.
10. Agregue HBSS adicional de tal manera que la concentración final de neutrófilos sea de 4 x 10⁶ células/ml.
    NOTA: Para casos con <99% de viabilidad celular, aún se puede lograr la concentración final de 4 x 10⁶ células/ml; sin embargo, el volumen total de solución que contiene 4 x 10⁶ células/ml obtenido disminuirá. La concentración final de neutrófilos se puede ajustar de acuerdo con las necesidades experimentales del usuario. Los neutrófilos se resuspendieron a una concentración final de 4 x 10⁶ células/ml para todos los experimentos descritos a continuación. Para tener en cuenta la variabilidad de donante a donante, se recomienda encarecidamente que todos los experimentos relacionados con neutrófilos se realicen con al menos tres donantes diferentes.

4. Medición de ROS producidas por neutrófilos

1. Añadir 100 μL de suero humano normal al 20% (diluido en HBSS) gota a gota al biofilm lavado (paso 1.6) e incubar a 37 °C en condiciones estáticas durante 30 min para opsonizar el biofilm.
2. Aspirar la solución sérica al 20% y lavar los biofilms gota a gota con 150 μL de HBSS una vez. Aspirar el HBSS, dejando atrás pozos con biofilms opsonizados.
   NOTA: Para la interpretación del experimento, se recomienda un mínimo de cuatro grupos: (A) Neutrófilos + Biopelícula, (B) Neutrófilos + PMA (control positivo, ver Tabla de materiales), (C) Neutrófilos solamente, y (D) Biopelícula solamente.
3. Agregue luminol (ver Tabla de materiales) a los neutrófilos resuspendidos en HBSS a una concentración de 4 x 10⁶ células/ml tal que la concentración final de luminol sea de 50 μM. Esta solución está lista para usar para los grupos (A) y (C). Añadir 4 x 10⁵ neutrófilos mezclados con luminol a los pocillos con biofilms opsonizados.
4. En un tubo separado, prepare una solución de luminol de 50 μM en HBSS sin neutrófilos y agréguela al biofilm que contiene el pocillo (grupo D).
5. Alícuota 350 μL de neutrófilos mezclados con luminol y añadir forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) a una concentración final de 500 ng/ml a la mezcla. Para el grupo (B), añadir 4 x 10⁵ neutrófilos de esta mezcla en pocillos sin biopelícula. Esto sirve como un control positivo.
   NOTA: La concentración de PMA indicada en este paso es relativamente alta para garantizar una respuesta robusta a la ráfaga, ya que los neutrófilos estimulados por PMA son un control positivo. PMA se puede utilizar a una concentración más baja para activar los neutrófilos, dependiendo del experimento.
6. Centrifugar la placa a 270 x g durante 30 s a 4 °C.
7. Asegúrese de que el lector de placas esté ajustado a 37 °C junto con el ajuste de luminiscencia y lectura cinética durante 60 minutos con intervalos de 3 minutos. Coloque la placa en el lector de placas para medir la producción de ROS por neutrófilos durante 60 min.
   NOTA: Para este ensayo, las biopelículas se cultivaron en placas blancas utilizadas para ensayos de luminiscencia. El PMA es un agonista conocido para la respuesta de explosión oxidativa³⁹. Cuando realice estudios con PMA, asegúrese de que PMA se agregue en el paso final mientras la solución que contiene neutrófilos esté fría, ya que PMA inicia inmediatamente la respuesta de ráfaga.

5. Imágenes de las interacciones biopelícula-neutrófilos

1. Configure una biopelícula siguiendo los pasos 1.2-1.6. Para facilitar las imágenes de biopelícula, emplee una cepa fluorescente de S. aureus, como USA300 que expresa la proteína fluorescente verde (GFP)^40,41, para aumentar la facilidad de las imágenes de microscopía.
   NOTA: Se utilizó un portaobjetos de 6 μ canales (consulte la Tabla de materiales) en lugar de una placa de 96 pocillos para demostrar el modelo de biopelícula in vitro (paso 1).
2. Incubar 4 x 10⁶ células/ml de neutrófilos con 100 μM de colorante azul CMAC (7-amino-4-clorometilcumarina) (BCD, ver Tabla de materiales) durante 30 min en un balancín a 37 °C y 5% de_CO2. Asegúrese de que las muestras se incuben en la oscuridad y limite la exposición a la luz durante los pasos restantes.
3. Para lavar el exceso de BCD, centrifugar los neutrófilos a 270 x g durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Resuspender los neutrófilos en HBSS fresco. En este punto, agregue etidio homodímero-1 (consulte la Tabla de materiales) a los neutrófilos teñidos con BCD a una concentración final de 4 μM para controlar la muerte bacteriana y de neutrófilos.
4. Agregue 150 μL de neutrófilos a la biopelícula de S. aureus que se ha cultivado en μ portaobjetos, de modo que la proporción de neutrófilos a bacterias sea de 1:30 (neutrófilos: bacterias). Incubar los μ portaobjetos en una cámara humidificada durante 30 min. El número de células bacterianas se basa en los recuentos celulares obtenidos al colocar una biopelícula de 18 h.
5. Imagen de la interacción neutrófilo-biopelícula utilizando canales fluorescentes correspondientes a las longitudes de onda de excitación y emisión de los colorantes/proteínas fluorescentes.
   NOTA: Para el presente estudio, BCD es 353/466 nm, ethidium homodimer-1 es 528/617 nm y GFP es 395/509 nm. Limite la exposición de la muestra al láser o a la luz para evitar el fotoblanqueo de las muestras.
6. Analice las imágenes utilizando software de análisis de imágenes de microscopía o programas como FIJI / ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ y BAIT, entre muchos más^42,43,44,45.
   NOTA: Cuando se trabaja con manchas, es importante tener en cuenta la especificidad de los tintes en uso. Algunas tinciones funcionan en células procariotas y eucariotas, mientras que otras funcionan solo en una. Si los neutrófilos y las biopelículas se tiñen por separado con tintes que pueden teñir ambos tipos de células, asegúrese de lavar cualquier tinte restante antes de combinar neutrófilos y biopelículas para evitar la tinción cruzada.

Los medios utilizados para cultivar biopelículas bacterianas influyen en la supervivencia de los neutrófilos. Se probaron diferentes medios para reducir el efecto de los medios solos sobre la viabilidad de los neutrófilos para estudiar las interacciones neutrófilos-biopelícula (Figura 1). Los medios de crecimiento bacteriano como el caldo de soja tríptico minimizan la viabilidad de los neutrófilos, de modo que ~ 60% de los neutrófilos están vivos después de un período de incubación de 30 minutos a 37 ° C con 5% deCO2. Los medios de cultivo de células de mamíferos, como MEMα, no afectan la viabilidad de los neutrófilos y apoyan el crecimiento de biopelículas de S. aureus. De hecho, los medios mínimos promueven el crecimiento robusto de biopelículas en otras bacterias46,47.

Para evaluar el efecto de los medios sobre el crecimiento del biofilm y la variabilidad en la cuantificación de la biomasa del biofilm después del lavado de la biomasa para eliminar las células planctónicas, se cultivó un biofilm de S. aureus de 18 h en una placa de 96 pocillos, con pocillos tratados o no tratados con poli-L-lisina. Se utilizó un medio rico en nutrientes (caldo de soja tríptico [TSB]) y un medio mínimo (MEMα) tal cual o suplementado con glucosa al 2%. La biomasa de biofilm teñida con CV reveló que la biopelícula de S. aureus cultivada en MEMα suplementada con 2% de glucosa produjo la biopelícula más robusta entre todos los medios probados (Figura 2A). Además, las biopelículas cultivadas en pocillos pretratados con PLL que contenían MEMα + 2% de glucosa mostraron menos variabilidad que las biopelículas en pocillos no tratados con PLL que contenían MEMα + 2% de glucosa. Estas biopelículas mostraron menos variabilidad en la cuantificación a través del ensayo CV35 y la UFC / ml cuando se colocaron después de manipular con precisión las biopelículas para la cuantificación de biomasa. Estas biopelículas contenían, en promedio, 1 x 108 UFC/ml, como se demuestra al colocar las biopelículas en 3 días separados (Figura 2B). Este número es útil para determinar el número de neutrófilos que se agregarán a las biopelículas para los ensayos de funcionalidad de neutrófilos.

Para medir la producción de ROS por neutrófilos en respuesta a biopelículas, las biopelículas de S. aureus se cultivaron estáticamente durante 18-20 h en una placa de 96 pocillos. Luego se opsonizaron biopelículas y se agregaron neutrófilos. La producción de ROS se midió durante 60 min (Figura 3A). El área bajo la curva se calcula a partir de la curva cinética para cuantificar la producción total de ROS por los neutrófilos. Los neutrófilos tratados con un agonista, como PMA, utilizado como control, muestran un aumento de la producción de ROS. En ausencia de biopelículas, los neutrófilos tratados con PMA mostraron una producción robusta de ROS. En presencia de biopelícula de S. aureus , la producción global de ROS por neutrófilos tratados con PMA disminuyó. En ausencia de PMA, los neutrófilos dependen únicamente de su interacción con la biopelícula, lo que reduce aún más la cantidad de ROS producida (Figura 3B).

Para visualizar las interacciones neutrófilos-biopelícula utilizando microscopía de fluorescencia, se utilizó una cepa de S. aureus que expresa GFP, colorante CMAC azul y homodímero de etidio-1, que tiñe el citoplasma de células vivas y el ADN de células muertas, respectivamente. La biopelícula de S. aureus se cultivó durante 18 h en un portaobjetos de 6 μ canales. Se agregaron neutrófilos marcados con colorante CMAC azul junto con homodímero-1 de etidio a las biopelículas lavadas y se incubaron durante 30 minutos a 37 ° C con 5% deCO2 antes de la obtención de imágenes. La microscopía fluorescente de campo amplio reveló que muchos neutrófilos estaban localizados en la superficie de las biopelículas de S. aureus, mientras que unos pocos están dentro de la biopelícula (Figura 4A). La interacción entre las células de S. aureus dentro de los neutrófilos también fue evidente (Figura 4C). La mayoría de las células de S. aureus que interactúan con los neutrófilos (cian) estaban muertas (magenta), mientras que unas pocas permanecieron vivas (amarillas) según lo determinado por la tinción de muertos vivos (Figura 4C). A modo de comparación, las biopelículas de S. aureus que expresan GFP se tiñeron con homodímero-1 de etidio, lo que reveló una fracción de la población muerta de S. aureus dentro de la biopelícula (Figura 4B). Los neutrófilos no viables que fueron positivos para el homodímero-1 de etidio se cuantificaron utilizando un software de análisis (ver Tabla de materiales) después de la incubación con biopelículas de S. aureus. Aproximadamente el 48% de los neutrófilos ya estaban muertos dentro de los 30 minutos de la incubación con biopelícula de S. aureus. Durante la optimización del protocolo de microscopía, también se evaluó el efecto del lavado del biofilm y los neutrófilos después de 30 min de incubación para eliminar los neutrófilos no adheridos, revelando alrededor del 33% de neutrófilos muertos todavía unidos al biofilm (Figura 4D).

Figura 1: El ensayo LIVE-DEAD compara la supervivencia de neutrófilos entre los medios de crecimiento bacterianos y de mamíferos. Los neutrófilos se aislaron e incubaron en HBSS, MEMα, TSB o SDS al 0,1% durante 30 min. La tinción LIVE-DEAD se realizó utilizando Calcein AM (vivo) y ethidium homodimer-1 (muerto). Se determinó el porcentaje de neutrófilos vivos, donde los neutrófilos incubados con HBSS se trataron como neutrófilos 100% vivos. Los resultados representan un promedio de dos experimentos independientes realizados por triplicado, con neutrófilos obtenidos de dos donantes diferentes. Los datos se presentan como media ± DE (*p < 0,05, ****p < 0,0001. ANOVA unidireccional). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Cuantificación de biomasa de biofilm en diferentes condiciones y recuento de viabilidad bacteriana de biofilms cultivados en las condiciones optimizadas. (A) S. aureus se sembró en una placa de 96 pocillos recubierta o no con poli-L-lisina (PLL). Los biofilms se cultivaron en TSB, MEMα o cualquiera de los medios suplementados con glucosa al 2% en condiciones estáticas durante 18 h. Se realizó tinción de violeta cristal (CV) para teñir la biomasa de biopelícula. La tinción CV eluyida se diluyó a 1:10 y se leyó en un lector de microplacas. Los resultados representan un promedio de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Los datos se presentan como media ± DE. La SD para cada grupo se muestra en la parte inferior para demostrar la variabilidad de las diferentes condiciones de crecimiento de la biopelícula. (B) Los recuentos bacterianos de UFC se obtuvieron a partir de biopelículas cultivadas en un medio optimizado (MEMα + 2% de glucosa). Las biopelículas estáticas de 18 h se sometieron al mismo número de lavados seguidos de una sonicación de 10 minutos para aflojar la biomasa de biopelícula y pasaron a través de una aguja de 22G para interrumpir los agregados antes del recubrimiento. Los resultados representan tres réplicas realizadas por triplicado. Los datos se presentan como media ± DE (ns = no significativo. ANOVA unidireccional). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Cuantificación de la producción de ROS por neutrófilos mediante ensayo de quimioluminiscencia. (A) Los neutrófilos (PMN) se incubaron con biopelículas de S. aureus (BF) lavadas con HBSS en presencia (triángulo gris cerrado) o ausencia (triángulo invertido gris abierto) de PMA para medir la producción de ROS por los neutrófilos. Luminol se utilizó para detectar ROS cada 3 minutos durante 60 minutos en un lector de microplacas. Mientras que los neutrófilos tratados con PMA en ausencia de una biopelícula (círculo negro cerrado) sirvieron como control positivo, los grupos de neutrófilos solo (círculo negro abierto) y solo biopelícula (triángulo gris abierto) sirvieron como controles negativos. Los datos representan un promedio de dos experimentos independientes realizados por triplicado con neutrófilos obtenidos de dos donantes diferentes. Los datos se presentan como media ± DE. (B) El área bajo la curva de (A) se calculó para cuantificar el ROS total generado por los neutrófilos. Los datos se representan como media ± DE. (***p < 0,0001. ANOVA unidireccional). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Visualización de la interacción entre el biofilm de S. aureus y los neutrófilos mediante microscopía de fluorescencia de campo amplio. Los neutrófilos marcados con colorante CMAC azul (cian) se suplementaron con homodímero-1 de etidio (magenta; muerto) antes de incubar con una biopelícula de S. aureus de 18 h (amarillo). Las interacciones biopelícula-neutrófilos se obtuvieron imágenes mediante microscopía fluorescente de campo amplio y las imágenes se procesaron utilizando un software de análisis de imágenes. Los experimentos se realizaron con tres donantes diferentes. Las imágenes representativas se presentan como (A) vista 3D de la biopelícula de S. aureus con neutrófilos vivos (cian) y muertos (magenta; algunos indicados con flechas blancas), (B) vista 3D de una biopelícula de S. aureus en ausencia de neutrófilos con S. aureus vivo que expresa GFP (amarillo) o S. aureus muerto teñido con homodímero-1 de etidio (magenta), (C) una vista ortogonal de S. aureus e interacción de neutrófilos como se muestra en los planos xy, yz y xz, y (D) cuantificación de la viabilidad de neutrófilos en presencia de biopelícula de S. aureus después de 30 minutos, ya sea inmediatamente (sin lavar) o después de tres rondas de lavados con HBSS para eliminar los neutrófilos no adheridos (lavados). La muerte celular de neutrófilos se presenta como media ± SD (prueba t de Student). La barra de escala indica 50 μm en (A) y (B) y 10 μm en (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.