Summary
Detta protokoll beskriver studien av neutrofil-biofilminteraktioner. Staphylococcus aureus biofilmer etableras in vitro och inkuberas med perifera blod-härledda humana neutrofiler. Det oxidativa sprängresponsen från neutrofiler kvantifieras och neutrofillokaliseringen i biofilmen bestäms genom mikroskopi.
Abstract
Neutrofiler är den första försvarslinjen som används av immunsystemet under mikrobiell infektion. In vivo rekryteras neutrofiler till infektionsstället där de använder processer som fagocytos, produktion av reaktiva syre- och kvävearter (ROS, RNS, respektive), NETosis (neutrofil extracellulär fälla) och degranulering för att döda mikrober och lösa infektionen. Interaktioner mellan neutrofiler och planktoniska mikrober har studerats omfattande. Det har funnits ett växande intresse för att studera infektioner orsakade av biofilmer de senaste åren. Biofilmer uppvisar egenskaper, inklusive tolerans mot dödande av neutrofiler, som skiljer sig från deras planktoniskt odlade motsvarigheter. Med den framgångsrika etableringen av både in vitro - och in vivo-biofilmmodeller kan interaktioner mellan dessa mikrobiella samhällen med olika immunceller nu undersökas. Här skräddarsys tekniker som använder en kombination av traditionella biofilmmodeller och väletablerade neutrofilaktivitetsanalyser specifikt för att studera neutrofil- och biofilminteraktioner. Bredfältfluorescensmikroskopi används för att övervaka lokaliseringen av neutrofiler i biofilmer. Dessa biofilmer odlas under statiska förhållanden, följt av tillsats av neutrofiler härledda från humant perifert blod. Proverna färgas med lämpliga färgämnen före visualisering under mikroskopet. Dessutom kvantifieras produktionen av ROS, som är en av de många neutrofila svaren mot patogener, i närvaro av en biofilm. Tillägget av immunceller till detta etablerade system kommer att utöka förståelsen för värd-patogeninteraktioner samtidigt som man säkerställer användningen av standardiserade och optimerade förhållanden för att mäta dessa processer exakt.
Introduction
En biofilm är en gemenskap av ytassocierade mikrober eller icke-bundna aggregat inneslutna i en extracellulär polymer substans (EPS)1,2. Dessa samhällen skyddar de inneslutna mikroorganismerna från miljöstressorer, inklusive tolerans mot antimikrobiella medel och immunsystemet3. Flera patogena mikrobiella arter bildar biofilmer som har associerats med kroniska infektioner4. Utvecklingen av biofilmer är en invecklad process som involverar fastsättning på ytor, EPS-produktion, cellproliferation, biofilmstrukturering och cellavskiljning5. När celler har spridit sig för att bilda en biofilm förblir de planktoniska eller translokerar till ett nytt substrat och återinitierar biofilmutveckling6.
Staphylococcus aureus, en opportunistisk patogen, följer ett allmänt schema för biofilmutveckling, inklusive bindning, spridning, mognad och spridning7. Fästprocessen i S. aureus-biofilmer dikteras av hydrofoba interaktioner, teikosyror och mikrobiella ytkomponenter som känner igen adhesiva matrismolekyler (MSCRAMM)8,9. När spridningen av S. aureus börjar produceras EPS, som huvudsakligen består av polysackarider, proteiner, extracellulärt DNA och teikosyror,5. När EPS-komponenter produceras produceras också olika exoenzymer och små molekyler, vilket bidrar till biofilmens 3-dimensionella struktur och hjälper till att lossa5. S. aureus utnyttjar denna mycket samordnade livsstil för att etablera olika kroniska infektioner, inklusive infektioner på grund av att medicintekniska produkter finns i hemmet10.
Meticillinresistent S. aureus (MRSA) är en av de främsta orsakerna till infektioner relaterade till medicintekniska produkter i bostad, såsom centrala ven- och urinkatetrar, protesleder, pacemakers, mekaniska hjärtklaffar och intrauterina enheter11. Under sådana infektioner är neutrofiler de första värdimmuncellerna som rekryteras till infektionsstället för att bekämpa patogener via flera strategier12. Dessa inkluderar fagocytos, degranulering, reaktiv syre- och kväveart (ROS / RNS) produktion eller frisättning av neutrofila extracellulära fällor (NET) för att eliminera patogener13.
Generering av ROS vid fagocytos av mikrober är ett av de viktigaste antimikrobiella svaren som uppvisas av neutrofiler14. Fagocytos förbättras om mikrober är belagda med opsoniner, särskilt immunglobuliner och komplementkomponenter som finns i serum15. De opsoniserade mikroberna känns sedan igen av cellytereceptorer på neutrofiler och uppslukas och bildar ett fack som kallas fagosom15. Neutrofiler genererar och frisätter ROS i fagosomen via det membranassocierade NADPH-oxidaset16. Detta flerkomponentenzymkomplex genererar superoxidanjoner genom att överföra elektroner till molekylärt syre16. Dessutom genererar neutrofiler också RNS genom uttrycket av inducerbart kväveoxidsyntas (iNOS)17. Dessa höga superoxid- och kväveoxidradikaler inom fagosomen har breda antimikrobiella aktiviteter. De kan interagera med metallcentra i enzymer och skada nukleinsyror, proteiner och cellmembran i patogenen 18,19,20,21. Många mikrober antar en biofilmlivsstil och använder olika strategier för att undvika dödande av ROS22,23. Således är standardiserade analyser som kopplar biofilmer med neutrofiler för att kvantifiera ROS fördelaktiga för konsekventa resultat.
Medan analyser, såsom kvantifiering av neutrofil ROS-produktion, ger information om neutrofilernas svar på biofilmer, kan förmågan att visualisera interaktionerna mellan neutrofiler i en biofilm också fungera som ett kraftfullt verktyg. Användningen av fluorescerande färgämnen för mikroskopi kräver ofta optimering för att få högkvalitativa bilder som kan användas för mikroskopibildanalys. Flexibiliteten att optimera vissa tillstånd är begränsad eftersom neutrofiler kan genomgå celldöd efter isolering. Dessutom tvättas biofilmer vanligtvis för att avlägsna planktonpopulationen från den experimentella uppsättningen före tillsats av neutrofiler. Under tvättning kan variationer mellan replikatbiofilmer uppstå på grund av förlust av partiell biomassa om biofilmer fästs löst på ytan.
I stort sett inkluderar nuvarande metoder inom området för att analysera interaktioner mellan neutrofiler och biofilmer huvudsakligen mikroskopi, flödescytometri och kolonibildande enheter (CFU) uppräkning24,25,26,27. Mikroskopi innebär användning av färgämnen som antingen direkt fläckar neutrofilerna och biofilmerna, eller riktar olika neutrofilsvar mot mikrober såsom NET-bildning, degranulering och celldöd25,28. En delmängd av dessa svar, såsom neutrofil celldöd och degranulering, kan också analyseras via flödescytometri, men kräver att neutrofiler företrädesvis inte associeras med stora mikrobaggregat i en biofilm28,29. Flödescytometri kan också kvantifiera vissa biofilmparametrar, såsom cellviabilitet27. Dessa processer kräver dock störningar i biofilmbiomassan och skulle inte vara användbara för att visualisera andra viktiga interaktioner såsom den rumsliga fördelningen av neutrofiler och deras komponenter i en biofilm27,29,30.
Detta protokoll fokuserar på att anpassa några av de traditionellt använda metoderna för att studera neutrofil-biofilminteraktioner på biofilmer som har optimerats för att ge minimal variation under hantering. Detta protokoll tillhandahåller således standardiserade metoder för att odla och kvantifiera biofilmer, isolera primära humana neutrofiler från perifert blod, kvantifiera ROS-produktion och visualisera biofilm-neutrofilinteraktioner via mikroskopi. Detta protokoll kan anpassas till olika system för att förstå biofilm-neutrofila interaktioner samtidigt som man överväger heterogeniteten bland givarpooler.
Protocol
Alla förfaranden godkändes av Ohio State University Institutional Review Board (IRB) (2014H0154). Informerat skriftligt samtycke erhölls från alla givare för att samla in perifert blod för att isolera primära humana neutrofiler. Staphylococcus aureus (USA300 LAC)31 användes som modellorganism för att utföra experimenten. Experimenten utfördes med korrekt personlig skyddsutrustning (PPE) på grund av potentiell exponering för en blodburen patogen.
1. Beredning av in vitro-biofilm
- Få isolerade kolonier av S. aureus från ett kryokonserverat lager 31 med hjälp av en strimplatteteknik32,33 på en näringsrik agarplatta, såsom tryptisk sojaagar (se materialtabell).
- Täck enskilda brunnar i en 96-brunnsplatta med 100 μL 0,001% (v / v) poly-L-lysin (PLL) utspädd i sterilH2Ooch inkubera vid rumstemperatur i 30 min. Aseptiskt aspirerar du PLL-lösningen med hjälp av en vakuumassisterad aspirationsfälla. Låt brunnarna torka över natten vid rumstemperatur.
OBS: Alla aspirationssteg i protokollet utförs med hjälp av en vakuumassisterad aspirationsfälla om inget annat anges. - Förbered en kultur över natten genom att ympa en koloni av S. aureus i minimal essentiell media alfa (MEMα) kompletterad med 2% glukos och inkubera vid 37 ° C, skaka vid 200 rpm i 16-18 h.
- Späd kulturen över natten genom att överföra 50 μL till 5 ml färsk MEMα kompletterad med 2% glukos och inkubera vid 37 °C, skaka vid 200 rpm fram till mitten av logaritmisk fas, vanligtvis mellan optisk densitet 600 (OD600nm) på 0,5-0,8. Använd MEMα för att normalisera mitten av logaritmisk kultur till en OD600nm på 0,1.
- Överför 150 μL normaliserad kultur till varje brunn i den PLL-behandlade 96-brunnsplattan. Inkubera statiskt i 18-20 timmar i en fuktad kammare vid 37 °C.
OBS: Biofilmerna kan också odlas i andra format som μ-kanalsbilder (se Materialförteckning). - Aspirera supernatanten för att ta bort planktoncellerna. Tvätta försiktigt återstående biomassa med 150 μl Hanks balanserade saltlösning (HBSS) för att avlägsna de obundna cellerna. Tillsätt HBSS droppvis för att undvika att störa biofilmen.
OBS: När du aspirerar supernatanten och HBSS under tvättar, lämna precis tillräckligt med vätska (supernatant eller HBSS) i brunnarna som innehåller biofilm så att biofilmen fortfarande är nedsänkt. Detta förhindrar störningar i biofilmstrukturen när HBSS tillsätts droppvis för att tvätta biofilmen. - Upprepa steg 1.6 minst två gånger till för att ta bort alla planktoniska celler. Vid denna tidpunkt är biofilmer redo för omedelbara nedströmsexperiment.
OBS: Om biofilmerna inte används för neutrofila experiment kan HBSS ersättas med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). HBSS föredras framför PBS eftersom HBSS innehåller komponenter, inklusive glukos, som ger optimala förhållanden för neutrofilaktivering34.
2. Kvantifiering av biofilmbiomassa
- Bered en stam av 0,1% (w/v) Crystal Violet (CV) lösning (se materialtabell) genom att lösa upp i 20% (v/v) etanol och 80% (v/v) H2O. Se till att CV:n är helt upplöst i etanol innan du tillsätterH2O. Filtrera lösningen.
- Tillsätt 150 μl 0,1 % CV-lösning till den tvättade biofilmen och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur. Använd minst tre tomma brunnar som kontroller endast för media.
- Aspirera 0,1% CV-lösningen från biofilmerna och tvätta de färgade biofilmerna med 200 μL 1x PBS. Upprepa denna process för totalt tre tvättar för att ta bort eventuellt överskott av CV från brunnarna.
- Tillsätt 150 μl 33 % (v/v) isättika utspädd medH2O. Inkubera vid rumstemperatur på en vippa vid 50 rpm i 30 minuter så att cv:n som är bunden till biomassan löser sig helt.
VARNING: Utför detta steg i en laminär flödeshuv med lämplig personlig skyddsutrustning eftersom isättika är en frätande kemikalie. - Under tiden ställer du in mikroplattläsaren (se Materialförteckning) för att läsa CV-fläckvärdena. Efter behandling med isättika läser du av plattan vid 595 nm våglängd.
OBS: Våglängden som används för att mäta OD för CV kan sträcka sig från 500-600 nm35.
3. Neutrofil isolering
OBS: Neutrofiler isolerades enligt en tidigare publicerad metod med mindre förändringar36. Detta isoleringsprotokoll kombinerar densitetsgradientcentrifugering först, följt av 3% dextransedimentering. Detta avsnitt täcker endast det övergripande neutrofilisoleringsprotokollet, med fokus på de ändringar som gjorts i det publicerade protokollet. Dessutom är protokollet som beskrivs nedan en av de många metoder som kan isolera neutrofiler och kan ersättas efter behov. Andra metoder för att isolera neutrofiler inkluderar användning av cellseparationsmedia eller magnetisk antikroppscellseparation37.
- Dra blod från en vuxen givare via venipunktur, enligt protokollet som beskrivs i den institutionella IRB. Innan blodprovet dras, se till att sprutan har tillräckligt med konserveringsfritt heparin, så att den slutliga koncentrationen av heparin är 20 U/ml.
- Späd det hepariniserade blodet med 3/4 volymen endotoxinfri 0,9% NaCl (se materialtabell) iH2Ovid rumstemperatur.
- För varje 20 ml av det utspädda blodprovet, alikvotera 14 ml av ett kommersiellt tillgängligt densitetsgradientmedium (se materialförteckning) i ett nytt 50 ml koniskt rör. Lägg försiktigt det utspädda blodprovet ovanpå densitetsgradientmediet.
- Centrifugera det skiktade blodprovet vid 400 x g i 40 minuter vid rumstemperatur. Se till att centrifugen har en långsam paus för att undvika att störa skiktet när centrifugeringen är klar.
OBS: Blodprovet kommer att ha fem lager som innehåller en blandning av saltlösning och plasma, ett mononukleärt cellskikt, densitetsgradientmedium, neutrofiler och erytrocyter. - Använd en serologisk pipett och aspirera alla skikt ovanför neutrofilerna och erytrocytpelleten, följt av en mild resuspension av pelleten i kallt endotoxinfritt 0,9% NaCl iH2O. För varje pellet som genereras från ett 20 ml blodprov, återsuspendera pelleten tillbaka till 20 ml volym totalt. Tillsätt 1:1 volym 3% dextran (se Materialförteckning). Inkubera röret upprätt i 18-20 min på is.
OBS: Se till att 3% dextran är gjord med endotoxinfri 0,9% NaCl iH2O. - Ta bort 20 ml av det övre lagret som innehåller neutrofiler och vissa erytrocyter på ett nytt 50 ml koniskt rör och centrifugera det vid 355 x g i 10 minuter vid 4 °C. Häll av supernatanten och lämna efter dig en röd pellet.
- Återsuspendera försiktigt pelleten i 10 ml kallt, steriltH2O-värdei 30 s för att lysera de återstående erytrocyterna. Tillsätt omedelbart 10 ml kall endotoxinfri 0,9% saltlösning till blandningen för att återställa toniciteten. Centrifugera lösningen vid 233 x g i 3 minuter vid 4 °C.
- Häll av supernatanten och återsuspendera pelleten som innehåller 95%-97% neutrofiler i 1 ml kallt HBSS per 20 ml av blodprovet.
- Överför 10 μL av de återsuspenderade neutrofilerna i 90 μl av 0,4% trypanblått uteslutningsfärgämne och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer (se materialtabell).
OBS: Icke-livskraftiga celler är färgade blå eftersom trypanblått uteslutningsfärgämne är ogenomträngligt i livskraftiga celler. Detta protokoll ger >99% cellviabilitet37,38. - Lägg till ytterligare HBSS så att den slutliga koncentrationen av neutrofiler är 4 x 106 celler / ml.
OBS: För fall med <99% cellviabilitet kan den slutliga koncentrationen av 4 x 106 celler / ml fortfarande uppnås; Den totala volymen lösning innehållande 4 x 106 celler/ml erhållen kommer emellertid att minska. Den slutliga koncentrationen av neutrofiler kan justeras enligt användarens experimentella behov. Neutrofilerna återsuspenderades vid en slutlig koncentration på 4 x 106 celler/ml för alla experiment som beskrivs nedan. För att ta hänsyn till variationer mellan givare rekommenderas starkt att alla experiment som är involverade i neutrofiler utförs med minst tre olika givare.
4. Mätning av ROS producerad av neutrofiler
- Tillsätt 100 μl 20 % normalt humant serum (utspätt i HBSS) droppvis till den tvättade biofilmen (steg 1.6) och inkubera vid 37 °C under statiskt tillstånd i 30 minuter för att opsonisera biofilmen.
- Aspirera 20% serumlösningen och tvätta biofilmerna droppvis med 150 μL HBSS en gång. Aspirera HBSS och lämna efter sig brunnar med opsoniserade biofilmer.
OBS: För tolkning av experimentet rekommenderas minst fyra grupper: (A) Neutrofiler + Biofilm, (B) Neutrofiler + PMA (positiv kontroll, se Materialförteckning), (C) Endast neutrofiler och (D) Endast biofilm. - Tillsätt luminol (se materialförteckning) till de neutrofiler som återsuspenderas i HBSS i en koncentration av 4 x 106 celler/ml så att den slutliga luminolkoncentrationen är 50 μM. Denna lösning är klar att användas för grupperna (A) och (C). Tillsätt 4 x 105 neutrofiler blandade med luminol till brunnarna med opsoniserade biofilmer.
- Bered 50 μM luminollösning i HBSS utan neutrofiler i ett separat rör och tillsätt den till den brunninnehållande biofilmen (grupp D).
- Alikvot 350 μl neutrofiler blandade med luminol och tillsätt phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) i en slutlig koncentration av 500 ng/ml till blandningen. För grupp (B), tillsätt 4 x 105 neutrofiler från denna blandning i brunnar utan biofilm. Detta fungerar som en positiv kontroll.
OBS: Koncentrationen av PMA som indikeras i detta steg är relativt hög för att säkerställa robust burst-respons eftersom PMA-stimulerade neutrofiler är en positiv kontroll. PMA kan användas i en lägre koncentration för att aktivera neutrofiler, beroende på experimentet. - Centrifugera plattan vid 270 x g i 30 s vid 4 °C.
- Se till att plattläsaren är inställd på 37 °C tillsammans med inställningen för luminescens och kinetisk avläsning i 60 minuter med 3 minuters intervall. Placera plattan i plattläsaren för att mäta ROS-produktion med neutrofiler i 60 minuter.
OBS: För denna analys odlades biofilmer i vita plattor som användes för luminiscensanalyser. PMA är en känd agonist för det oxidativa burstsvaret39. När du utför studier med PMA, se till att PMA tillsätts i det sista steget medan lösningen som innehåller neutrofiler är kall eftersom PMA omedelbart initierar burst-svaret.
5. Avbildning av biofilm-neutrofila interaktioner
- Ställ in en biofilm med steg 1.2-1.6. För att underlätta biofilmavbildning, använd en fluorescerande stam av S. aureus, såsom USA300 som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP)40,41, för att öka lättheten av mikroskopiavbildning.
OBS: En 6 μ-kanals glidning (se materialtabell) användes istället för en 96-brunnsplatta för att demonstrera in vitro-biofilmmodellen (steg 1). - Inkubera 4 x 106 celler/ml neutrofiler med 100 μM blått CMAC (7-amino-4-klormetylkumarin)-färgämne (BCD, se materialtabell) i 30 minuter i en vippa vid 37 °C och 5 %CO2. Se till att proverna inkuberas i mörkret och begränsa exponeringen för ljus under de återstående stegen.
- För att tvätta överskott av BCD, centrifugera neutrofiler vid 270 x g i 5 minuter och aspirera supernatanten. Återsuspendera neutrofilerna i färsk HBSS. Tillsätt nu etidiumhomodimer-1 (se materialtabell) till de BCD-färgade neutrofilerna i en slutlig koncentration av 4 μM för att övervaka neutrofil och bakteriedöd.
- Tillsätt 150 μl neutrofiler till S. aureus-biofilmen som har odlats i μ-objektsglas, så att förhållandet mellan neutrofil och bakterier är 1:30 (neutrofil: bakterier). Inkubera μ-bilderna i en fuktad kammare i 30 minuter. Antalet bakterieceller baseras på cellantalet erhållet från plätering av en 18 timmars biofilm.
- Avbilda interaktionen mellan neutrofil och biofilm med hjälp av fluorescerande kanaler som motsvarar excitations- och emissionsvåglängderna hos de fluorescerande färgämnena/proteinerna.
OBS: För den aktuella studien är BCD 353/466 nm, etidiumhomodimer-1 är 528/617 nm och GFP är 395/509 nm. Begränsa provets exponering för lasern eller ljuset för att förhindra fotoblekning av proverna. - Analysera bilderna med hjälp av mikroskopibildanalysprogramvara eller program som FIJI / ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ och BAIT, bland många fler42,43,44,45.
OBS: När du arbetar med fläckar är det viktigt att överväga specificiteten hos de färgämnen som används. Vissa fläckar fungerar på prokaryota och eukaryota celler, medan andra bara fungerar på en. Om neutrofiler och biofilmer färgas separat med färgämnen som kan fläcka båda celltyperna, se till att tvätta bort eventuellt kvarvarande färgämne innan du kombinerar neutrofiler och biofilmer för att förhindra korsfärgning.
Representative Results
Media som används för att odla bakteriella biofilmer påverkar överlevnaden av neutrofiler. Olika medier testades för att minska effekten av enbart media på neutrofilernas livskraft för att studera neutrofil-biofilminteraktioner (figur 1). Bakteriella tillväxtmedier som tryptisk sojabuljong minimerar neutrofilernas livskraft, så att ~ 60% av neutrofilerna lever efter en 30 minuters inkubationsperiod vid 37 ° C med 5% CO2. Däggdjurscellodlingsmedier, såsom MEMα, påverkar inte neutrofilernas livskraft och stöder tillväxten av S. aureus-biofilmer. Faktum är att minimala medier främjar robust tillväxt av biofilmer i andra bakterier46,47.
För att bedöma effekten av media på biofilmtillväxt och variation i kvantifiering av biofilmbiomassa efter tvättning av biomassan för att eliminera planktoniska celler, odlades en 18 h S. aureus biofilm i en 96-brunnsplatta, med brunnar behandlade eller obehandlade med poly-L-lysin. En näringsrik (tryptisk sojabuljong (TSB)) och minimala (MEMα) medier användes som de är eller kompletterades med 2% glukos. Biofilmbiomassan färgad med CV avslöjade att S. aureus biofilm odlad i MEMα kompletterad med 2% glukos producerade den mest robusta biofilmen bland alla testade medier (Figur 2A). Dessutom visade biofilmer som odlades i PLL-förbehandlade brunnar innehållande MEMα + 2% glukos mindre variation än biofilmer i PLL-obehandlade brunnar innehållande MEMα + 2% glukos. Dessa biofilmer visade mindre variation i kvantifiering via CV-analys35 och CFU/ml när de pläterades efter exakt hantering av biofilmer för kvantifiering av biomassa. Dessa biofilmer innehöll i genomsnitt 1 x 108 CFU/ml, vilket demonstrerades genom plätering av biofilmerna på 3 separata dagar (figur 2B). Detta nummer är användbart för att bestämma antalet neutrofiler som ska läggas till biofilmerna för neutrofilfunktionalitetsanalyser.
För att mäta ROS-produktion av neutrofiler som svar på biofilmer odlades S. aureus-biofilmer statiskt i 18-20 timmar i en 96-brunnsplatta. Biofilmer opsoniserades sedan och neutrofiler tillsattes. ROS-produktionen mättes sedan i 60 min (figur 3A). Arean under kurvan beräknas från den kinetiska kurvan för att kvantifiera den totala ROS-produktionen av neutrofiler. Neutrofiler behandlade med en agonist, såsom PMA, som används som kontroll, visar en ökad ROS-produktion. I avsaknad av biofilmer visade neutrofiler behandlade med PMA robust ROS-produktion. I närvaro av S. aureus biofilm minskade den totala ROS-produktionen av neutrofiler behandlade med PMA. I avsaknad av PMA är neutrofiler enbart beroende av deras interaktion med biofilmen, vilket ytterligare minskar mängden ROS som produceras (figur 3B).
För att visualisera neutrofil-biofilminteraktionerna med hjälp av fluorescensmikroskopi användes en GFP-uttryckande stam av S. aureus, Blue CMAC-färgämne och etidiumhomodimer-1, som fläckar cytoplasman hos levande celler respektive DNA från döda celler. S. aureus biofilm odlades i 18 timmar i en 6 μ-kanals bild. Blå CMAC-färgämnesmärkta neutrofiler tillsattes tillsammans med etidiumhomodimer-1 till de tvättade biofilmerna och inkuberades i 30 minuter vid 37 ° C med 5% CO2 före avbildning. Bredfältsfluorescerande mikroskopi avslöjade att många neutrofiler var lokaliserade till ytan av S. aureus-biofilmer, medan några finns inom biofilmen (figur 4A). Samspelet mellan S. aureus-celler inom neutrofiler var också uppenbart (figur 4C). De flesta av S. aureus-cellerna som interagerade med neutrofiler (cyan) var döda (magenta), medan några förblev levande (gula) som bestämdes av levande död färgning (figur 4C). Som jämförelse färgades GFP-uttryckande S. aureus-biofilmer med etidiumhomodimer-1, vilket avslöjade en bråkdel av den döda S. aureus-populationen inom biofilmen (figur 4B). Icke-viabla neutrofiler som var positiva för etidiumhomodimer-1 kvantifierades med hjälp av analysprogramvara (se materialtabell) efter inkubation med S. aureus-biofilmer. Cirka 48% av neutrofilerna var redan döda inom 30 minuter efter inkubation med S. aureus biofilm. Under optimeringen av mikroskopiprotokollet bedömdes också effekten av att tvätta biofilmen och neutrofilerna efter 30 minuters inkubation för att avlägsna icke-vidhäftade neutrofiler, vilket avslöjade cirka 33% av döda neutrofiler som fortfarande är fästa vid biofilmen (Figur 4D).
Figur 1: LIVE-DEAD-analys jämför neutrofilöverlevnad mellan bakteriella och däggdjurs tillväxtmedier. Neutrofiler isolerades och inkuberades i HBSS, MEMα, TSB eller 0,1% SDS i 30 minuter. Procent av levande neutrofiler bestämdes, där HBSS-inkuberade neutrofiler behandlades som 100% levande neutrofiler. Resultaten representerar i genomsnitt två oberoende experiment utförda i tre exemplar, med neutrofiler erhållna från två olika givare. Data presenteras som medelvärde ± SD (*p < 0,05, ****p < 0,0001. Enkelriktad ANOVA). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kvantifiering av biofilmbiomassa under olika förhållanden och antal bakteriella viabiliteter för biofilmer som odlas under optimerade förhållanden. (A) S. aureus såddes i en 96-brunnsplatta antingen belagd eller obelagd med poly-L-lysin (PLL). Biofilmer odlades i TSB, MEMα eller något av mediet kompletterat med 2% glukos under statiska förhållanden i 18 timmar. Kristallviolett (CV) färgning utfördes för att fläcka biofilmbiomassa. Den eluterade CV-fläcken späddes ut klockan 1:10 och lästes i en mikroplattläsare. Resultaten representerar i genomsnitt tre oberoende experiment utförda i tre exemplar. Data presenteras som medelvärde ± SD. SD för varje grupp visas längst ner för att visa olika biofilmtillväxtförhållanden. (B) Bakteriella CFU-räkningar erhölls från biofilmer odlade i ett optimerat medium (MEMα + 2% glukos). De 18 h statiska biofilmerna utsattes för samma antal tvättar följt av en 10 min ultraljudsbehandling för att lossa biofilmbiomassan och passerade genom en 22G nål för att störa aggregaten före plätering. Resultaten representerar tre replikat som utförts i tre exemplar. Data presenteras som medelvärde ± SD (ns = inte signifikant. Enkelriktad ANOVA). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kvantifiering av ROS-produktion med neutrofiler via kemiluminescensanalys. (A) Neutrofiler (PMN) inkuberades med HBSS-tvättade S. aureus-biofilmer (BF) antingen i närvaro (sluten grå triangel) eller frånvaro (öppen grå inverterad triangel) av PMA för att mäta ROS-produktion av neutrofiler. Luminol användes för att detektera ROS var 3: e minut i 60 minuter i en mikroplattläsare. Medan neutrofiler behandlade med PMA i frånvaro av en biofilm (sluten svart cirkel) fungerade som en positiv kontroll, fungerade endast neutrofila (öppen svart cirkel) och endast biofilm (öppen grå triangel) grupper som negativa kontroller. Data representerar i genomsnitt två oberoende experiment som utförts i tre exemplar med neutrofiler erhållna från två olika givare. Data presenteras som medelvärde ± SD. (B) Arean under kurvan från (A) beräknades för att kvantifiera den totala ROS som genereras av neutrofilerna. Uppgifterna representeras som medelvärde ± SD. (***p < 0,0001. Enkelriktad ANOVA). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Visualisering av interaktionen mellan S. aureus biofilm och neutrofiler med hjälp av bredfältfluorescensmikroskopi. Blå CMAC-färgämnesmärkta neutrofiler (cyan) kompletterades med etidiumhomodimer-1 (magenta; död) före inkubering med en 18 h S. aureus biofilm (gul). Biofilm-neutrofila interaktioner avbildades med hjälp av fluorescerande mikroskopi med brett fält och bilder bearbetades med hjälp av en bildanalysprogramvara. Experiment utfördes med tre olika donatorer. Representativa bilder presenteras som (A) 3D-vy av S. aureus biofilm med levande (cyan) och döda (magenta; några indikerade med vita pilar) neutrofiler, (B) 3D-vy av en S. aureus-biofilm i frånvaro av neutrofiler med antingen levande S. aureus som uttrycker GFP (gul) eller död S. aureus färgad med ethidiumhomodimer-1 (magenta), (C) en ortogonal vy av S. aureus och neutrofil interaktion som avbildas av xy-, yz- och xz-planen, och (D) kvantifiering av neutrofil viabilitet i närvaro av S. aureus-biofilm efter 30 minuter antingen omedelbart (otvättat) eller efter tre tvättomgångar med HBSS för att avlägsna icke-vidhäftade neutrofiler (tvättade). Neutrofil celldöd presenteras som medelvärde ± SD (Students t-test). Skalstrecket anger 50 μm i (A) och (B) och 10 μm i (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det har gjorts många ansträngningar för att odla robusta och reproducerbara S. aureus-biofilmer för nedströms experiment in vitro48,49,50. Ett standardiserat protokoll beskrivs som utnyttjar PLL: s katjoniska natur, samt kompletterar mediet med glukos för tillväxt av robusta in vitro S. aureus-biofilmer. Tillsatsen av PLL möjliggör bättre fastsättning av den negativt laddade bakteriecellen till de positivt laddade PLL-belagda ytorna. Det är viktigt att notera att PLL vid en koncentration på 10 μg/ml har antimikrobiell aktivitet mot Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli och S. aureus när den inkuberas i 24 timmar51. Samma koncentration används för att belägga ytor; emellertid aspireras överskott av PLL, vilket gör koncentrationen av PLL lägre än 10 μg / ml vid sådd för biofilmtillväxt.
Det är viktigt att notera att PLL endast har fungerat i specifika tillväxtmedier som MEMα med 2% glukos, där det observerades att S. aureus producerade robusta biofilmer med minimal variabilitet (Figur 2A). PLL-koncentration som ska användas tillsammans med andra medietyper skulle kräva ytterligare optimering, såsom att använda en ökad koncentration av PLL för att belägga brunnarna. Dessutom har dessa förhållanden optimerats för en monospecies S. aureus biofilm. Medan kroniska sårbiofilmer ofta är polymikrobiella, är standardisering av analyser för att studera monospecies biofilm och dess interaktioner med neutrofiler och andra immunceller nyckeln till att förstå deras bidrag till patogenes52. Dessa standardiserade protokoll kan optimeras ytterligare för att upprätthålla och studera polymikrobiella biofilmer och deras interaktioner med neutrofiler.
Det observerades också att rika bakterieodlingsmedier, såsom TSB, ledde till förlust av neutrofil livskraft (figur 1). Därför optimerades tillväxtförhållandena för S. aureus-biofilmer i MEMα, som används för däggdjurscellkulturer. För studier med neutrofiler, Detta media stöder neutrofil livskraft och främjar S. aureus tillväxt. Medan det observerades att media påverkar neutrofilernas livskraft, är det också viktigt att överväga att neutrofiler isolerade från perifert humant blod genomgår apoptos ex vivo med cirka 70% apoptotiska neutrofiler vid 20 h53. Detta kräver korrekt hantering, såsom att lagra neutrofilerna på is när man förbereder sig för experiment, använder endotoxinfria reagenser och förhindrar aktivering av neutrofiler genom att undvika virvelbildning av prover med neutrofiler.
Bedömningen av oxidativ burst i neutrofiler utförs rutinmässigt för att bestämma neutrofilernas dödande effekt på patogenen14,54,55. Dessa studier utförs ofta med planktoniska bakterier där neutrofiler tillsätts, och det oxidativa sprängresponsen kvantifieras med hjälp av luminolförstärkt kemiluminescens som detekterar superoxidanjoner som produceras av neutrofiler. Detta protokoll modifieras genom att ersätta planktoniska bakterier med statiskt odlad 18 h S. aureus biofilm. Som sådan kan neutrofiler tillsättas direkt till biofilmen för att bedöma deras aktivering. Å andra sidan producerar bakterier i biofilmer enzymer, såsom katalas och superoxiddismutas för att avgifta ROS23,56. Staphylococcus epidermidis biofilmer producerar högre katalas än dess planktoniska motsvarighet under stress57. Den totala kemiluminescensen av PMA-stimulerade neutrofiler i en S. aureus-biofilm är signifikant lägre än de PMA-stimulerade neutrofilerna där biofilm saknas (figur 2). Detta kan bero på aktiviteten hos dessa avgiftande enzymer. Dessutom producerar S. aureus biofilmer flera porbildande toxiner som kallas leukocidiner som dödar neutrofiler58. Det minskade burst-svaret beror sannolikt också på den minskade livskraften hos neutrofiler i närvaro av S. aureus biofilm. Medan denna studie använder luminol som detekterar den totala ROS som produceras både inuti och utanför cellerna, måste andra reagenser, såsom CM-H 2 DCFDA (5-(och-6) -klormetyl-2'7'-diklordihydrofluoresceindiacetat) eller isoluminol, övervägas om målet med arbetet är att studera intracellulär eller extracellulär ROS-produktion14,53,54 specifikt.
Förmågan att visualisera neutrofil-biofilminteraktioner via mikroskopi kan vara informativ om beteendet hos neutrofiler och biofilmer i närvaro av varandra. Excitations- och emissionsspektra för fluorescerande färgämnen och proteiner representerar en ögonblicksbild av interaktionen mellan en 18 h S. aureus biofilm och neutrofiler efter en 30 minuters inkubation. För att effektivt fånga signaler från färgade celler är det viktigt att begränsa provernas exponering för ljuskällor medan du ställer in proverna för mikroskopi. Under avbildning undviks snabb fotoblekning av proverna genom att sänka ljuskällans intensitet vid justering av alla parametrar som Z-stackhöjd och exponeringstid för olika kanaler.
Dessa enkla metoder möjliggjorde korrekt mikroskopiavbildning där det observerades att få neutrofiler är lokaliserade i biofilmen (figur 4A). Detta kan bero på utrymmen som finns i biofilmen eftersom 18 h S. aureus biofilm odlad i MEMα med 2% glukos inte täcker ytan jämnt (figur 4B). Andra studiers användning av rika medier har dock visat en enhetlig gräsmatta av S. aureus biofilmtillväxt och leukocyter som tränger igenom biofilmen30,58. Vidare observeras också att det fanns neutrofil celldöd efter 30 minuters inkubation med S. aureus-biofilmer på grund av S. aureus biofilmproducerade leukocidiner som lyser neutrofiler58 (Figur 4A,D). Tillsats av ett tvättsteg för att avlägsna icke-vidhäftade neutrofiler efter inkubation av dem med biofilm i 30 minuter avlägsnade ~ 15% av döda neutrofiler från systemet jämfört med den otvättade gruppen, i vilken mikroskopi utfördes omedelbart efter 30 minuters inkubation (figur 4D). Neutrofiler som interagerar med S. aureus observerades också (figur 4C). Ytterligare experiment krävs för att bedöma om S. aureus är uppslukad av neutrofiler eller fäst vid cellytan hos neutrofiler54. Avbildning av neutrofiler och biofilmer är det första steget för att utvärdera flera neutrofila funktioner nedströms, såsom fagocytos och NETosis54,59. Effekten av neutrofiler på biofilmer kan också bedömas genom att kvantifiera biofilmbiomassan, strukturella förändringar av biofilmen och biofilmens livskraft, bland många andra, med hjälp av bildanalysverktyg som anges i steg 5.6. Slutligen finns variationer mellan givare i neutrofiler; Därför rekommenderas att minst tre olika givare används för studier med neutrofiler.
Sammantaget kombinerades standardiserade in vitro-analyser för att bedöma interaktioner mellan neutrofiler och biofilmer. Även om dessa analyser använder S. aureus, kan de beskrivna protokollen enkelt anpassas för att studera andra patogener. Även om det finns olika in vivo-modeller för att studera värd-patogeninteraktioner, kan de vara dyra och arbetsintensiva, särskilt om förhållandena inte är optimerade. Att arbeta med standardiserade in vitro-analyser gör att man kan optimera experimentella förhållanden och bekräfta observationer innan man flyttar till ett in vivo-system. Slutligen har olika djurinfektionsmodeller använts för att studera biofilm-neutrofila interaktioner in vivo. Det är dock viktigt att överväga immunologiska skillnader mellan människor och djurmodeller60,61,62,63. Detta kräver att man använder neutrofiler som härrör från människor för att studera dessa komplexa värd-patogeninteraktioner.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av National Institute of Allergy and Infectious Diseases (R01AI077628) till DJW och ett American Heart Association Career Development Award (19CDA34630005) till ESG. Vi tackar Dr. Paul Stoodley för att förse oss med USA 300 LAC GFP-stam. Dessutom erkänner vi resurser från Campus Microscopy and Imaging Facility (CMIF) och OSU Comprehensive Cancer Center (OSUCCC) Microscopy Shared Resource (MSR), Ohio State University. Vi tackar också Amelia Staats, Peter Burback och Lisa Coleman från Stoodley-labbet för att de utförde bloddragningar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | Endotoxin-free; Used for isolation of neutrophils |
| 150 mL rapid-flow filter unit | Thermo Scientific | 565-0020 | |
| 200 proof ethanol | VWR | 89125-188 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Used for blood draw |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | Used for blood draw |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-2 | |
| Alcohol swab | BD | Used for blood draw | |
| Band-aids | Used for blood draw | ||
| BD Bacto Tryptic Soy Broth | BD | DF0370-07-5 | Combine with 1.5% agar to make Tryptic Soy Agar |
| Cell counter | Bal Saupply | 202C | |
| CellTracker blue CMCH | Invitrogen | C2111 | Blue CMAC Dye (BCD) |
| Clear bottom 96-well flat bottom polystyrene plates | Costar | 3370 | |
| Cotton gauze | Fisherbrand | 13-761-52 | Used for blood draw |
| Crystal violet | Acros Organic | 40583-0250 | |
| Culture tubes | Fisherbrand | 14-961-27 | Borosilicate Glass 13 x 100 mm |
| D-(+)-glucose | Sigma | G-8270 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392-250G | Used for isolation of neutrophils |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | L3224 B | |
| Ficoll-Paque plus | Cytiva | 17144003 | Used for isolation of neutrophils (density gradient medium) |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) 1x | Corning cellgro | 21-022-CV | without calcium, magnesium, and phenol red |
| Hemacytometer | Bright Line | ||
| Heparin | Novaplus | NDC 63323-540-57 | 1000 USP units/mL, Used for blood draw |
| IMARIS 9.8 | Oxford Instruments | Microscopy image analysis software | |
| Luminol | Sigma | A8511-5G | |
| Minimal essential media (MEM) Alpha 1x | Gibco | 41061-029 | |
| Needle (23 G1) | BD | 305145 | Used for blood draw |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon | ||
| NIS-Elements | Nikon | Quantification of dead neutrophils | |
| Normal human serum | Complement Technology | NHS | |
| Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-342 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | |||
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P4707-50ML | |
| Sodium chloride | Fisher Bioreagents | BP358-10 | Used for neutrophil isolation |
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices | Microplate reader software used for data acquisition | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | Microplate reader | |
| Sterile water for irrigation, USP | Baxter | 2F7114 | Endotoxin-free; Used for neutrophil isolation |
| Surflo winged infusion set | Terumo | SC*19BLK | 19 G x 3/4", used for blood draw |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Turnicate | Used for blood draw | ||
| UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| White opaque 96-well plates | Falcon | 353296 | Tissue culture treated and flat bottom plate |
| μ-Slide VI 0.4 | Ibidi | 80601 | μ-channel slide |
References
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).
- Alhede, M., et al. Phenotypes of non-attached Pseudomonas aeruginosa aggregates resemble surface attached biofilm. PLoS One. 6 (11), 27943 (2011).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews: Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Schilcher, K., Horswill, A. R. Staphylococcal biofilm development: structure, regulation, and treatment strategies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (3), 0002 (2020).
- Kaplan, J. B. Biofilm dispersal: mechanisms, clinical implications, and potential therapeutic uses. Journal of Dental Research. 89 (3), 205-218 (2010).
- Otto, M.
- Moormeier, D. E., Bayles, K. W. Staphylococcus aureus biofilm: a complex developmental organism. Molecular Microbiology. 104 (3), 365-376 (2017).
- Gross, M., Cramton, S. E., Gotz, F., Peschel, A. Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces. Infection and Immunity. 69 (5), 3423-3426 (2001).
- Zheng, Y., He, L., Asiamah, T. K., Otto, M. Colonization of medical devices by staphylococci. Environmental Microbiology. 20 (9), 3141-3153 (2018).
- Donlan, R. M.
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
- Chen, Y., Junger, W. G.
- van Kessel, K. P., Bestebroer, J., van Strijp, J. A.
- Nguyen, G. T., Green, E. R., Mecsas, J. Neutrophils to the ROScue: Mechanisms of NADPH oxidase activation and bacterial resistance. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 373 (2017).
- Saini, R., Singh, S. Inducible nitric oxide synthase: An asset to neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 105 (1), 49-61 (2019).
- Imlay, J. A. The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: lessons from a model bacterium. Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).
- Segal, A. W. The function of the NADPH oxidase of phagocytes and its relationship to other NOXs in plants, invertebrates, and mammals. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 40 (4), 604-618 (2008).
- Fang, F. C. Antimicrobial reactive oxygen and nitrogen species: concepts and controversies. Nature Reviews Microbiology. 2 (10), 820-832 (2004).
- Bogdan, C. Nitric oxide and the immune response. Nature Immunology. 2 (10), 907-916 (2001).
- Chua, S. L., et al. Reactive oxygen species drive evolution of pro-biofilm variants in pathogens by modulating cyclic-di-GMP levels. Open Biology. 6 (11), 160162 (2016).
- El Haj, C., Lichtenberg, M., Nielsen, K. L., Bjarnsholt, T., Jensen, P. O. Catalase protects biofilm of Staphylococcus aureus against daptomycin activity. Antibiotics. 10 (5), 511 (2021).
- Ghimire, N., et al. Direct microscopic observation of human neutrophil-Staphylococcus aureus interaction in vitro suggests a potential mechanism for initiation of biofilm infection on an implanted medical device. Infection and Immunity. 87 (12), 00745 (2019).
- Bhattacharya, M., et al. Leukocidins and the nuclease nuc prevent neutrophil-mediated killing of Staphylococcus aureus biofilms. Infection and Immunity. 88 (10), 00372 (2020).
- Bogachev, M. I., et al. Fast and simple tool for the quantification of biofilm-embedded cells sub-populations from fluorescent microscopic images. PLoS One. 13 (5), 0193267 (2018).
- Kerstens, M., et al. A flow cytometric approach to quantify biofilms. Folia Microbiologica. 60 (4), 335-342 (2015).
- Meyle, E., et al. Destruction of bacterial biofilms by polymorphonuclear neutrophils: relative contribution of phagocytosis, DNA release, and degranulation. The International Journal of Artificial Organs. 33 (9), 608-620 (2010).
- Oveisi, M., et al. Novel assay to characterize neutrophil responses to oral biofilms. Infection and Immunity. 87 (2), 00790 (2019).
- Leid, J. G., Shirtliff, M. E., Costerton, J. W., Stoodley, P. Human leukocytes adhere to, penetrate, and respond to Staphylococcus aureus biofilms. Infection and Immunity. 70 (11), 6339-6345 (2002).
- Fey, P. D., et al. A genetic resource for rapid and comprehensive phenotype screening of nonessential Staphylococcus aureus genes. mBio. 4 (1), 00537 (2013).
- Cody, W. L., et al. Skim milk enhances the preservation of thawed -80 degrees C bacterial stocks. Journal of Microbiological Methods. 75 (1), 135-138 (2008).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. 63, 3064 (2012).
- Freitas, M., Porto, G., Lima, J. L., Fernandes, E. Optimization of experimental settings for the analysis of human neutrophils oxidative burst in vitro. Talanta. 78 (4-5), 1476-1483 (2009).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 1 Unit 1B 1 (2005).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
- Zhou, L., et al. Impact of human granulocyte and monocyte isolation procedures on functional studies. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (7), 1065-1074 (2012).
- Quach, A., Ferrante, A. The application of dextran sedimentation as an initial step in neutrophil purification promotes their stimulation, due to the presence of monocytes. Journal of Immunology Research. 2017, 1254792 (2017).
- Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).
- Staats, A., et al. Rapid aggregation of Staphylococcus aureus in synovial fluid is influenced by synovial fluid concentration, viscosity, and fluid dynamics, with evidence of polymer bridging. mBio. , 0023622 (2022).
- Chiu, I. M., et al. Bacteria activate sensory neurons that modulate pain and inflammation. Nature. 501 (7465), 52-57 (2013).
- Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. 102 (1), 14-15 (2013).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
- Hartmann, R., et al. Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ. Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).
- Luo, T. L., et al. Introducing BAIT (Biofilm Architecture Inference Tool): a software program to evaluate the architecture of oral multi-species biofilms. Microbiology. 165 (5), 527-537 (2019).
- Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. Journal of Applied Microbiology. 105 (2), 585-590 (2008).
- Eze, E. C., El Zowalaty, M. E. Combined effects of low incubation temperature, minimal growth medium, and low hydrodynamics optimize Acinetobacter baumannii biofilm formation. Infection and Drug Resistance. 12, 3523-3536 (2019).
- Harris, L. G., Tosatti, S., Wieland, M., Textor, M., Richards, R. G. Staphylococcus aureus adhesion to titanium oxide surfaces coated with non-functionalized and peptide-functionalized poly(L-lysine)-grafted-poly(ethylene glycol) copolymers. Biomaterials. 25 (18), 4135-4148 (2004).
- Miao, J., et al. Biofilm formation of Staphylococcus aureus under food heat processing conditions: first report on cml production within biofilm. Scientific Reports. 9 (1), 1312 (2019).
- Lade, H., et al. Biofilm formation by Staphylococcus aureus clinical isolates is differentially affected by glucose and sodium chloride supplemented culture media. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1853 (2019).
- Guzel Kaya, G., et al. Antibacterial activity of linezolid against gram-negative bacteria: utilization of epsilon-Poly-l-Lysine capped silica xerogel as an activating carrier. Pharmaceutics. 12 (11), 1126 (2020).
- Clinton, A., Carter, T. Chronic wound biofilms: pathogenesis and potential therapies. Laboratory Medicine. 46 (4), 277-284 (2015).
- Scheel-Toellner, D., et al. Reactive oxygen species limit neutrophil life span by activating death receptor signaling. Blood. 104 (8), 2557-2564 (2004).
- Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006842 (2018).
- Guerra, F. E., et al. Staphylococcus aureus SaeR/S-regulated factors reduce human neutrophil reactive oxygen species production. Journal of Leukocyte Biology. 100 (5), 1005-1010 (2016).
- Suo, Y., Huang, Y., Liu, Y., Shi, C., Shi, X. The expression of superoxide dismutase (SOD) and a putative ABC transporter permease is inversely correlated during biofilm formation in Listeria monocytogenes 4b G. PLoS One. 7 (10), 48467 (2012).
- Olwal, C. O., Ang'ienda, P. O., Ochiel, D. O. Alternative sigma factor B (sigma(B)) and catalase enzyme contribute to Staphylococcus epidermidis biofilm's tolerance against physico-chemical disinfection. Scientific Reports. 9 (1), 5355 (2019).
- Bhattacharya, M., et al. Staphylococcus aureus biofilms release leukocidins to elicit extracellular trap formation and evade neutrophil-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7416-7421 (2018).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Dworsky, E. M., et al. Novel in vivo mouse model of implant related spine infection. Journal of Orthopaedic Research. 35 (1), 193-199 (2017).
- Pletzer, D., Mansour, S. C., Wuerth, K., Rahanjam, N., Hancock, R. E. New mouse model for chronic infections by gram-negative bacteria enabling the study of anti-infective efficacy and host-microbe interactions. mBio. 8 (1), 00140 (2017).
- Davis, M. M. A prescription for human immunology. Immunity. 29 (6), 835-838 (2008).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
