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Artículo de método

Aislamiento, cultivo y caracterización de células primarias de Schwann, queratinocitos y fibroblastos del prepucio humano

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DOI:

10.3791/63776

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23 de marzo de 2022

 ,  ,  , 
1Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Center for Orthopaedic Research and Translational Science (CORTS), The Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Dermatology, The Pennsylvania State University College of Medicine

En este artículo

Resumen

El estudio de la cicatrización de heridas asociada con la lesión musculoesquelética a menudo requiere la evaluación de las interacciones in vitro entre las células de Schwann (SC), los queratinocitos y los fibroblastos. Este protocolo describe el aislamiento, cultivo y caracterización de estas células primarias del prepucio humano.

Resumen

Este protocolo describe los métodos de aislamiento, las condiciones de cultivo y la caracterización de células primarias humanas con alto rendimiento y viabilidad utilizando la disociación enzimática rápida de la piel. Los queratinocitos primarios, los fibroblastos y las células de Schwann se extraen del prepucio del recién nacido humano, que está disponible siguiendo los procedimientos estándar de atención. La piel extraída se desinfecta y la grasa subcutánea y el músculo se eliminan con un bisturí. El método consiste en la separación enzimática y mecánica de las capas epidérmicas y dérmicas, seguida de una digestión enzimática adicional para obtener suspensiones unicelulares de cada una de estas capas de la piel. Finalmente, las células individuales se cultivan en medios de cultivo celular apropiados siguiendo los protocolos estándar de cultivo celular para mantener el crecimiento y la viabilidad durante semanas. Juntos, este protocolo simple permite el aislamiento, el cultivo y la caracterización de los tres tipos de células a partir de una sola pieza de piel para la evaluación in vitro de modelos de nervios de la piel. Además, estas células se pueden usar juntas en cocultivos para medir sus efectos entre sí y sus respuestas al trauma in vitro en forma de arañazos realizados robóticamente en el cultivo asociado con la cicatrización de heridas.

Introducción

Las células primarias derivadas de tejido vivo y cultivadas en condiciones in vitro se asemejan mucho al estado fisiológico1, lo que las convierte en un modelo ideal para investigar procesos fisiológicos y fisiopatológicos. La piel contiene múltiples tipos de células, incluyendo queratinocitos, fibroblastos, sebocitos, melanocitos y células de Schwann (SC), que pueden aislarse y cultivarse para experimentos in vitro . No se han descrito métodos para aislar y cultivar queratinocitos, fibroblastos y SC, a partir de una sola pieza de piel. El objetivo de este protocolo es doble: 1) establecer un método confiable y reproducible para el aislamiento y cultivo de SC dérmicos y 2) utilizar un método eficiente y robusto para el aislamiento de queratinocitos, fibroblastos y SC de un solo prepucio humano.

En la actualidad, existen protocolos establecidos para aislar queratinocitos cutáneos 2,3,4 y fibroblastos 5,6. Estos estudios describen el aislamiento de queratinocitos, fibroblastos o ambos de la piel, pero ningún protocolo aborda cómo establecer cultivos de SC primarios de piel humana. Estudios recientes sugieren que los SC neuronales modulan los procesos celulares de queratinocitos y fibroblastos y regulan las funciones fisiológicas normales de la piel7. Por lo tanto, los SC son críticos para la homeostasis de la piel y contribuyen sustancialmente a la fisiología reguladora que influye en el comportamiento de los tipos de células de la piel vecinas presentes8. Por lo tanto, un protocolo que permita el aislamiento de cada uno de estos tipos de células es ideal para experimentos in vitro que involucren la comunicación célula-célula o la diafonía entre tipos de células.

Este protocolo describe el establecimiento de cultivos celulares individuales de células primarias a partir de una sola pieza de piel. Este protocolo es particularmente útil cuando la cantidad de tejido disponible es limitada. Además, el aislamiento de los tres tipos de células de un solo donante permite comparaciones sólidas entre tipos de células o experimentos de cocultivo, al tiempo que mitiga la influencia de la genética durante el experimento deseado.

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Protocolo

La adquisición y el uso de tejido del prepucio humano no identificado con fines de investigación fue revisado y recibió la determinación de "investigación no humana" por la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de Penn State (IRB # 17574).

NOTA: Siguiendo el siguiente protocolo, se obtienen 2,4 x 106 queratinocitos, 4,4 x 106 fibroblastos y 1,1 x 106 SC de un solo prepucio. En general, estas células primarias se pueden utilizar para 3 pasajes, dependiendo de las condiciones experimentales.

1. Aislamiento de células primarias y condiciones de cultivo

  1. Procedimiento de separación de epidermis y dermis
    1. Adquirir prepucio neonatal después de los procedimientos estándar de atención por un médico bajo protocolos regulatorios hospitalarios aprobados. El médico determina el momento de la circuncisión después del nacimiento y la cantidad de piel extraída.
    2. Coloque el prepucio extirpado en un tubo de microcentrífuga que contenga 8-10 ml de medio basal Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco helado y transporte inmediatamente el prepucio al laboratorio de cultivo celular para el aislamiento celular. Enjuague la piel dos veces con 20-25 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de 1x Dulbecco que contenga 1 antibiótico / antimicótico.
      NOTA: Para obtener la máxima viabilidad celular, el prepucio extirpado debe colocarse a 4 °C hasta el procesamiento, y las células deben cosecharse dentro de las 24 h.
    3. Después de enjuagar con DPBS/antibióticos, remoje el prepucio en 25-30 ml de medio basal DMEM helado durante 10-15 min en un plato de cultivo de tejidos de 10 cm. Realice todos los pasos de procesamiento en una campana de cultivo de tejidos utilizando una técnica estéril.
    4. Con un bisturí, corte cuidadosamente el prepucio abierto y exponga la dermis y el tejido adiposo subcutáneo.
    5. Retire el tejido adiposo subcutáneo con fórceps, cuchilla de bisturí y tijeras, según sea necesario. Deseche el tejido adiposo. Corte el prepucio limpio en tres a cinco trozos más pequeños.
    6. Transfiera las piezas de piel a un tubo cónico estéril que contenga 16-20 ml de medio dispasa-I/DMEM (4 mg/ml en medio basal DMEM).
    7. Mezclar las piezas de piel en el tubo cónico por inversión, intermitentemente, durante los primeros 30 min de incubación con dispasa-I. A continuación, coloque el tubo cónico a 4 °C durante 16-18 h, teniendo en cuenta sumergir las piezas de la piel en dispase-I/media.
      NOTA: La solución de Dispasa-I debe prepararse justo antes de la adición utilizando medio basal DMEM frío, filtrarse con un colador de 0,22 μm y mantenerse a 4 °C.
    8. Después de la digestión nocturna con dispase-I, retire los trozos de piel y colóquelos en un plato de cultivo seco y estéril. Desenrolle cada pedazo de piel para que la capa epidérmica externa toque el plato de cultivo.
    9. Usando dos juegos de fórceps, separe cuidadosamente la epidermis de la dermis. Comience en el borde del tejido y despegue la epidermis lejos de la dermis.
      NOTA: Si la capa de la epidermis es difícil de separar de la dermis, la digestión dispasa-I no fue suficiente. Opciones de solución de problemas: 1) devolver las piezas de piel a la solución dispase-I/DMEM e incubarlas durante 2-3 h adicionales a 4 °C; 2) colocar los trozos de piel en dispasa fresca-I/DMEM e incubar a 4 °C durante 2-3 h más.
    10. Use la epidermis y la dermis separadas para aislar queratinocitos (epidermis) y fibroblastos y células de Schwann (dermis).
      NOTA: Siga los pasos a continuación para condiciones específicas de aislamiento y cultivo de tipos de células.
  2. Aislamiento de queratinocitos de la epidermis
    1. Agregue 5 ml de solución salina tampón HEPES (HBS) a un plato de cultivo de 10 cm y agregue los fragmentos separados de la epidermis. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 10 min.
    2. Después de la incubación de HBS, recoja la solución de HBS en un tubo cónico de 50 ml. Agregue 5 ml de tampón de neutralización de tripsina (TNB) (Tabla de materiales) en un tubo cónico de 50 ml y reserve.
    3. Agregue 3 ml de solución de tripsina a los fragmentos epidérmicos. Incubar a 37 °C durante 10 min.
    4. Agitar suavemente los fragmentos epidérmicos usando fórceps hasta que la solución de tripsina se vuelva turbia.
    5. Añadir la solución de tripsina/queratinocitos al tubo que contiene HBS y TNB en el paso 1.2.2.
    6. Para cualquier fragmento epidérmico restante que no se haya disuelto en la digestión inicial de tripsina, agregue 3 ml de tripsina al 0.25% / ácido etilendiaminatetraacético (EDTA). Incubar a 37 °C durante 10 min y repetir los pasos 1.2.4 y 1.2.5.
    7. Añadir 2 ml de suero fetal bovino (FBS) a la solución de tripsina/EDTA que contiene tubos de solución de HBS y TNB.
    8. Centrifugar el tubo de recogida que contiene HBS/TNB/tripsina y queratinocitos a 870 x g durante 5 min a 4 °C.
    9. Aspirar el sobrenadante y resuspendir el pellet celular en 3 mL de medio de crecimiento completo de queratinocitos (Tabla de Materiales).
    10. Filtre la suspensión celular con un filtro estéril de 100 μM en un tubo cónico estéril de 50 ml para eliminar los desechos.
    11. Cuantificar el número de celdas y la viabilidad celular.
      NOTA: Aquí, se utilizó un dispositivo especializado de muestreo y tinción celular (Tabla de Materiales) para cuantificar el número de células y la viabilidad siguiendo las instrucciones del fabricante.
    12. Placas de cultivo de semillas según sea necesario para los experimentos. La densidad de siembra recomendada es de ~45.000 células/cm2.
    13. Coloque las placas de cultivo en una incubadora a 37 °C en 5% de CO2 durante 2 días para permitir que los queratinocitos se adhieran al plato.
    14. Después de 2 días, aspire las células no adheridas. Refresque los medios de cultivo celular cada dos días hasta que los queratinocitos alcancen la confluencia deseada para experimentos de paso o aguas abajo (50% -80% de confluencia).
  3. Aislamiento de células de Schwann (SC) y fibroblastos de la dermis
    1. Matraces T25 pre-recubiertos con poli-L-lisina (PLL, 0,01 μg/μL) utilizando 5 mL de 1x DPBS. Coloque los matraces precubiertos a 37 °C durante 3 h. Lave la matriz de recubrimiento PLL dos veces con 1x DPBS (5 mL).
      NOTA: Los matraces T25 se pueden preparar con anticipación.
    2. Enjuague las piezas aisladas de la dermis con 5 ml de medio basal DMEM.
    3. Picar la dermis en trozos pequeños con tijeras o un bisturí.
    4. Digerir la dermis picada con 5 ml de colagenasa (2 mg/ml en medio basal DMEM) a 37 °C durante 2,5 h. Tritura suavemente la dermis picada con una punta de pipeta cada 30 minutos hasta que la dermis se disocie por completo.
    5. Filtre la suspensión celular con un colador celular de 70 μM. Es necesario aplicar fuerza mecánica utilizando una jeringa de 1 ml para filtrar completamente la suspensión.
    6. Diluir la suspensión celular filtrada con 5 mL de medio DMEM completo (medio basal DMEM + 5% FBS + 1x de antibiótico) para detener la actividad enzimática de la colagenasa.
    7. Centrifugar la suspensión celular a 870 x g durante 5 min a RT para granular las células.
    8. De este pellet celular se obtendrán tanto fibroblastos como SC. Resuspend el pellet celular en 2 mL de medio completo DMEM para dividir las células (1 mL de suspensión/tubo celular) y centrifugar a 870 x g durante 5 min a RT.
    9. Para el cultivo de SC, siga los pasos 1.3.10-1.3.17 y para el cultivo de fibroblastos, siga los pasos 1.3.18-1.3.22.
    10. A partir del paso 1.3.8, aspire el sobrenadante. Resuspendir el pellet celular en 5 mL de medio completo DMEM fresco.
    11. Cuantificar el número de celdas y la viabilidad.
      NOTA: Aquí, se utilizó un dispositivo especializado de muestreo y tinción celular (Tabla de Materiales) para cuantificar el número de células y la viabilidad siguiendo las instrucciones del fabricante.
    12. Sembrar los matraces T25 pre-recubiertos con 5 mL de células resuspendidas a una densidad 4.0 x 103 células/mL. Incubar el matraz a 37 °C en presencia de 5% de CO2 durante la noche (~12-16 h de incubación).
    13. Después de 16 h, confirme la adhesión celular por microscopía (Tabla de Materiales) a un aumento de 10x.
    14. Retire las células no adherentes y lave el matraz 3x con 5 ml de 1x DPBS.
    15. Añadir 5 ml de 10 μM de citosina arabinósido (agente antimitótico, mata los fibroblastos) en medio completo DMEM. Incubar el matraz a 37 °C en presencia de 5% de CO2 durante 24 h.
    16. Aspire el medio que contiene citosina arabinósido del matraz. Enjuague el matraz 3x con 5 mL de 1x DPBS.
    17. Rellenar el matraz de cultivo con 5 mL de medio de cultivo completo scs (Tabla de Materiales) e incubar a 37 °C en presencia de 5% de CO2 durante 48 h. Actualice el medio de cultivo completo SC cada dos días hasta que los SC alcancen el 80% de confluencia.
    18. Aspirar el sobrenadante de la capa dérmica disociada (paso 1.3.8) y resuspendir el pellet celular con 5 mL de medio completo de fibroblastos (medio basal de fibroblastos + 5% FBS + 1x antibiótico).
    19. Cuantificar el número de células y la viabilidad celular.
      NOTA: Aquí, se utilizó un dispositivo especializado de muestreo y tinción celular (Tabla de Materiales) para cuantificar el número de células y la viabilidad siguiendo las instrucciones del fabricante.
    20. Placa los fibroblastos a una densidad celular de 4,0 x 103 células/ml en matraces de cultivo T25 (no pre-recubiertos) utilizando 5 mL de medio completo de fibroblastos. Incubar a 37 °C en presencia de 5% de CO2 durante la noche (~12-16 h de incubación).
    21. Después de 16-24 h, confirme la adhesión celular por microscopía (Tabla de Materiales) a un aumento de 10x. Aspire las células no adherentes del matraz y lave el matraz dos veces con 5 ml de 1x DPBS.
    22. Añadir 5 ml de medio completo de fibroblastos frescos e incubar a 37 °C en presencia de 5% de CO2 durante 48 h. Refresque el medio de cultivo cada dos días hasta que los fibroblastos alcancen la confluencia deseada para los ensayos de paso o aguas abajo (50% -80% de confluencia).

2. Verificación de queratinocitos epidérmicos, SC dérmicos y marcadores proteicos de fibroblastos por inmunofluorescencia

  1. Día 1- Cubra los portaobjetos de vidrio de la cámara y separe las celdas
    1. Pre-recubrir portaobjetos de vidrio de cámara de 4 pocillos con colágeno-I para queratinocitos, o PLL para SC o, solo 1x DPBS para fibroblastos (0.5 mL cada pozo). Asegúrese de recubrir toda la superficie. Incubar diapositivas de cámara a 37 °C durante 2 h. Durante la incubación, prepare las células.
    2. Después de que las células cultivadas alcancen una confluencia del 50% al 80%, lave los matraces con 1x DPBS 3x (1 ml por cada pocillo).
    3. Separe las células adheridas con 5 ml de solución de tripsina-EDTA (TE) al 0,25% incubando a 37 °C en presencia de 5% de CO2 durante 2 min, hasta que las células comiencen a ser redondas. Visualice el desprendimiento celular con microscopía (Tabla de Materiales) a un aumento de 10x.
    4. Después de la incubación, transfiera la solución de TE que contiene células a un tubo cónico con 5 ml de suero fetal bovino (FBS).
    5. Agregue 5 ml de tampón de neutralización de tripsina (TNB) al matraz de cultivo y luego transfiera el contenido al tubo de centrífuga mencionado anteriormente (células con TE y FBS). Visualice el desprendimiento celular con microscopía (Tabla de Materiales) a un aumento de 10x.
      NOTA: TNB o FBS o ambos se pueden usar para neutralizar la actividad de la tripsina.
    6. Centrifugar el tubo cónico que contiene células/TE/TNB a 870 x g durante 5 min. Transfiera el sobrenadante a otro tubo y vuelva a suspender el pellet celular en el medio de cultivo completo correspondiente. Mida la viabilidad celular como se menciona en el paso 1.2.11.
    7. Enjuague los portaobjetos de vidrio de cámara pre-recubiertos (paso 2.1.1) con 1x DPBS (1 mL por cada pozo) 3x.
    8. Semiseque los portaobjetos dentro de la campana de cultivo de tejidos y queratinocitos de semillas, SC o fibroblastos a una densidad adecuada (30,000 células / 0.5 ml / cámara) en un medio de cultivo celular completo apropiado.
    9. Incubar los portaobjetos de la cámara a 37 °C durante la noche para permitir que las células se adhieran.
  2. Día 2- Bloqueo del portaobjetos de vidrio de la cámara con albúmina sérica bovina (BSA) e incubación de anticuerpos primarios
    1. Aspire los medios celulares de las diapositivas de la cámara y lave 3x con 1 mL de 1x DPBS.
    2. Fije las células adheridas con paraformaldehído al 4% en 1x DPBS (1 ml por cada pocillo) e incube durante 15 minutos a RT dentro de la campana de cultivo de tejidos.
    3. Aspire paraformaldehído al 4% de los portaobjetos de la cámara y lave los portaobjetos de la cámara 3x con 1x DPBS (1 ml para cada pocillo).
    4. Permeabilizar las membranas celulares con 1% tritonX-100 en 1x DPBS (1 mL por cada pocillo) e incubar durante 15 min a RT.
    5. Aspire la solución de bloqueo de los portaobjetos de la cámara, lave 3x con 1x DPBS (1 ml por cada pozo) durante 30 s y luego aspire 1x DPBS desde el pozo.
    6. Bloquee los portaobjetos de la cámara con BSA al 5% (0,5 ml para cada pozo) e incube durante 45 min a RT.
    7. Aspire la solución de bloqueo de los portaobjetos de la cámara, lave 3x con 1x DPBS (1 ml por cada pozo) durante 30 s cada uno y luego aspire 1x DPBS del pozo.
    8. Diluir los anticuerpos primarios con BSA al 5% (0,2 ml para cada pocillo) (Diluciones de anticuerpos primarios: queratinocitos: anticuerpo 14 de citoqueratina de ratón (1:100) y anticuerpo de citoqueratina 10 (1:100); Células de Schwann: anticuerpo S100 de ratón (1:200) y anticuerpo del receptor del factor de crecimiento nervioso de conejo (p75-NTR) (1:500); Fibroblastos: anticuerpo de vimentina de conejo (1:200) y anticuerpo de actina alfa-lisa de ratón (α-SMA) (1:200)).
    9. Agregue los anticuerpos primarios a las células correspondientes en el portaobjetos de vidrio de la cámara e incube durante aproximadamente 15-16 h (durante la noche) a 4 ° C en una cámara humidificada.
    10. Aspire los anticuerpos primarios de los portaobjetos de la cámara, lave 3 veces con 1x DPBS (1 ml por cada pozo) durante 30 s cada uno y luego aspire 1x DPBS del pozo.
    11. Diluir los anticuerpos secundarios (Cabra anti-conejo IgG Anticuerpo Secundario-Alexa Fluor 488 (1:500) y Cabra anti-Ratón IgG Anticuerpo Secundario-Alexa Fluor 594 (1:500)) con 0,5% BSA. Agregue el anticuerpo secundario apropiado a cada pocillo (0,2 ml para cada pocillo). Incubar durante 45 min en RT.
    12. Aspire el anticuerpo secundario de los portaobjetos de la cámara, lave 3x con 1x DPBS (1 ml por cada pozo) durante 30 s cada uno y luego aspire 1x DBPS del pozo.
    13. Retire la junta de la corredera de la cámara de 4 pocillos con el removedor de juntas. Trate de no dejar ningún adhesivo en la diapositiva, ya que esto interfiere con la aplicación de la cubierta. Agregue una gota de medio de montaje con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Alternativamente, contramanche los pozos con DAPI y use un medio de montaje que no contenga etiquetas.
    14. Coloque con cuidado la funda en el portaobjetos de vidrio evitando las burbujas de aire y selle el extremo de la cubierta con pegamento. Observe los patrones de tinción de inmunofluorescencia por microscopía (Tabla de Materiales) a un aumento de 10x y / o 20x.

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Resultados

Se utilizó el prepucio neonatal normal para el aislamiento de queratinocitos epidérmicos primarios y SC y fibroblastos dérmicos. Las células primarias aisladas se cultivaron en los respectivos medios de cultivo celular que contenían factores de crecimiento. Después de la siembra de SC y fibroblastos en matraces de cultivo, la mayoría de las células se adhirieron al fondo del matraz dentro de las 2 h. En el caso de los queratinocitos, la mayoría de los queratinocitos se adhirieron por 24 h. Los queratinocitos primarios ep...

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Discusión

Este protocolo describe un método para aislar tres poblaciones celulares distintas de una sola pieza del prepucio, a saber, queratinocitos, fibroblastos y células de Schwann. Existen algunos protocolos de aislamiento disponibles para aislar queratinocitos y fibroblastos 2,3,5,6, pero ninguno describe el aislamiento SC. Además de las células estructurales clave en la piel, los queratinocitos y l...

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Divulgaciones

Todos los demás autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a la Dra. Fadia Kamal y al Dr. Reyad Elbarbary por permitirnos utilizar instrumentos de laboratorio y soporte técnico. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los NIH (K08 AR060164-01A) y el DOD (W81XWH-16-1-0725) a J. C. E., además del apoyo institucional del Centro Médico Hershey de la Universidad Estatal de Pensilvania.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,22 y micro; Filtros estériles M (unidad de filtro de jeringa Millex-GP, polietersulfona)MilliporeSigmaSLGPR33RS
70 y micro; M filtros de célulasCELLTREAT 229483
100 µ Filtros de célulasM CELLTREAT229485
1 mL Jeringas desechablesBD Luer-LokBD-309659
Jeringas desechables de 5 mL (Jeringa estéril, de un solo uso)BD Luer-LokBD309646
Jeringas desechables de 10 mLBD Luer-LokBD305462
1% TritonX-100SigmaX100-1LPreparado en el momento de su uso
4% solución de paraformaldehídoThermoFisher ScientificJ19943. K2Listo para usar y almacenar a 4 & grados; C
5% BSASigmaA7906-100GPreparado en el momento de su uso
70% etanolPharmco111000200
AntibióticoScienCell Research503
Chemometec Vial1-CassetteFisher ScientificNC1420193
ColagenasaGibco17018-029
CoverslipFisherbrand12544D 22*50-1.5
Dispasa ISigma-AldrichD46693
DMEM medio basalScienCell Research9221
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco libre de Ca2+ y Mg2+ (DPBS)Corning  21-031-CV)
Nunc 15 mL Tubos de centrífuga de polipropileno estéril cónicoThermoFisher Scientific339651
Nunc 50 mL Tubos de centrífuga de polipropileno estéril cónicosThermoFisher Scientific339653
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mlFisherbrand02-681-5
Suero fetal bovino (FBS)ThermoFisher Scientific10082147
Medio completo FibroblastScienCell Research2331
Anticuerpo secundario de alta adsorción cruzada de IgG (H+L) anti-ratón de cabra, Alexa Fluor 594Dilución de InvitrogenA11032(1:500)
Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG anti-conejo de cabra (H+L), Alexa Fluor 488InvitrogenA11008Dilución (1:500)
Solución salina tamponada de Hanks (tampón HBSS)LonzaCC-5022
PrepucioTejido de prepucio humano anonimizado con fines de investigación (Junta de Revisión Institucional- IRB #17574).
Medio de queratinocitos KGM-GOLD (KGM oro y suplementos)Lonza00192151 y 00192152
Anticuerpo de actina de músculo lisoThermoFisher Scientific14-9760-82Dilución (1:200)
Anticuerpo de citoqueratina14 de ratónAbcamab7800Dilución (1:100)
Anticuerpo S100 de ratónThermoFisher ScientificMA5-12969Dilución (1:200)
Multicámara (portaobjetos de vidrio de 4 pocillos)Tab-Tek154526
NucleoCounter -Via1-CassetteChemometec941-0012
Poly-L-Lysisne (PLL)ScienCell Research32503
ProLong Gold Montante antidecoloración con DAPIInvitrogenP36935
Anticuerpo Rabbit K10Sigma-AldrichSAB4501656 Dilución (1:100)
Anticuerpo p75-NTR de conejoMilliporeAB1554Dilución (1:500)
Vimentina de conejoProteinTech10366-1-APDilución (1:200)
Medio de cultivo celular de SchwannScienCell Research1701
Pinzas de precisión DUMONT rectas con puntas extrafinas Dumostar, 5ROTHLH75.1Esterilizar con alcohol al 70% antes de usar
Tijeras IRIS, afiladas/afiladas. Longitud 4– 3/8" (111 mm)Codman54-6500Esterilizar con alcohol al 70% antes
de usar Cuchilla quirúrgica - afilada esterilizada (cuchillas de un solo filo Duro Edge Economy)Cuchillas de afeitar de la compañía94-0120Esterilizar con alcohol al 70% antes de usar
Matraz de cultivo T25Corning353109
Tampón de neutralización de tripsina (TNS)LonzaCC-5002
Tripsina/EDTALonzaCC-5012
Microscopio invertidoZEISSAxio Observer 7- Axiocam 506 mono – Microscopio Apotome.2Para la inmunofluorescencia de un portaobjetos de cámara que contiene células teñidas
Microscopio invertidoZEISSPrimovertPara visular/observar la unión o desconexión de células
humano alfa de ratón

Referencias

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