El estudio de la cicatrización de heridas asociada con la lesión musculoesquelética a menudo requiere la evaluación de las interacciones in vitro entre las células de Schwann (SC), los queratinocitos y los fibroblastos. Este protocolo describe el aislamiento, cultivo y caracterización de estas células primarias del prepucio humano.
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Artículo de método
Aislamiento, cultivo y caracterización de células primarias de Schwann, queratinocitos y fibroblastos del prepucio humano
En este artículo
Resumen
Resumen
Este protocolo describe los métodos de aislamiento, las condiciones de cultivo y la caracterización de células primarias humanas con alto rendimiento y viabilidad utilizando la disociación enzimática rápida de la piel. Los queratinocitos primarios, los fibroblastos y las células de Schwann se extraen del prepucio del recién nacido humano, que está disponible siguiendo los procedimientos estándar de atención. La piel extraída se desinfecta y la grasa subcutánea y el músculo se eliminan con un bisturí. El método consiste en la separación enzimática y mecánica de las capas epidérmicas y dérmicas, seguida de una digestión enzimática adicional para obtener suspensiones unicelulares de cada una de estas capas de la piel. Finalmente, las células individuales se cultivan en medios de cultivo celular apropiados siguiendo los protocolos estándar de cultivo celular para mantener el crecimiento y la viabilidad durante semanas. Juntos, este protocolo simple permite el aislamiento, el cultivo y la caracterización de los tres tipos de células a partir de una sola pieza de piel para la evaluación in vitro de modelos de nervios de la piel. Además, estas células se pueden usar juntas en cocultivos para medir sus efectos entre sí y sus respuestas al trauma in vitro en forma de arañazos realizados robóticamente en el cultivo asociado con la cicatrización de heridas.
Introducción
Las células primarias derivadas de tejido vivo y cultivadas en condiciones in vitro se asemejan mucho al estado fisiológico1, lo que las convierte en un modelo ideal para investigar procesos fisiológicos y fisiopatológicos. La piel contiene múltiples tipos de células, incluyendo queratinocitos, fibroblastos, sebocitos, melanocitos y células de Schwann (SC), que pueden aislarse y cultivarse para experimentos in vitro . No se han descrito métodos para aislar y cultivar queratinocitos, fibroblastos y SC, a partir de una sola pieza de piel. El objetivo de este protocolo es doble: 1) establecer un método confiable y reproducible pa....
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Protocolo
La adquisición y el uso de tejido del prepucio humano no identificado con fines de investigación fue revisado y recibió la determinación de "investigación no humana" por la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de Penn State (IRB # 17574).
NOTA: Siguiendo el siguiente protocolo, se obtienen 2,4 x 106 queratinocitos, 4,4 x 106 fibroblastos y 1,1 x 106 SC de un solo prepucio. En general, estas células primarias se pueden utilizar para 3 pasajes, dependiendo de las condiciones experimentales.
1. Aislamiento de células primarias y condiciones de cultivo
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Resultados
Se utilizó el prepucio neonatal normal para el aislamiento de queratinocitos epidérmicos primarios y SC y fibroblastos dérmicos. Las células primarias aisladas se cultivaron en los respectivos medios de cultivo celular que contenían factores de crecimiento. Después de la siembra de SC y fibroblastos en matraces de cultivo, la mayoría de las células se adhirieron al fondo del matraz dentro de las 2 h. En el caso de los queratinocitos, la mayoría de los queratinocitos se adhirieron por 24 h. Los queratinocitos primarios ep.......
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Discusión
Este protocolo describe un método para aislar tres poblaciones celulares distintas de una sola pieza del prepucio, a saber, queratinocitos, fibroblastos y células de Schwann. Existen algunos protocolos de aislamiento disponibles para aislar queratinocitos y fibroblastos 2,3,5,6, pero ninguno describe el aislamiento SC. Además de las células estructurales clave en la piel, los queratinocitos y l.......
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Divulgaciones
Todos los demás autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a la Dra. Fadia Kamal y al Dr. Reyad Elbarbary por permitirnos utilizar instrumentos de laboratorio y soporte técnico. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los NIH (K08 AR060164-01A) y el DOD (W81XWH-16-1-0725) a J. C. E., además del apoyo institucional del Centro Médico Hershey de la Universidad Estatal de Pensilvania.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,22 y micro; Filtros estériles M (unidad de filtro de jeringa Millex-GP, polietersulfona) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 y micro; M filtros de células | CELLTREAT 229483 | ||
| 100 µ Filtros de células | M CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL Jeringas desechables | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| Jeringas desechables de 5 mL (Jeringa estéril, de un solo uso) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| Jeringas desechables de 10 mL | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Preparado en el momento de su uso |
| 4% solución de paraformaldehído | ThermoFisher Scientific | J19943. K2 | Listo para usar y almacenar a 4 & grados; C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Preparado en el momento de su uso |
| 70% etanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiótico | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Colagenasa | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispasa I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM medio basal | ScienCell Research | 9221 | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco libre de Ca2+ y Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Tubos de centrífuga de polipropileno estéril cónico | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Tubos de centrífuga de polipropileno estéril cónicos | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Medio completo Fibroblast | ScienCell Research | 2331 | |
| Anticuerpo secundario de alta adsorción cruzada de IgG (H+L) anti-ratón de cabra, Alexa Fluor 594 | Dilución de Invitrogen | A11032 | (1:500) |
| Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG anti-conejo de cabra (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilución (1:500) |
| Solución salina tamponada de Hanks (tampón HBSS) | Lonza | CC-5022 | |
| Prepucio | Tejido de prepucio humano anonimizado con fines de investigación (Junta de Revisión Institucional- IRB #17574). | ||
| Medio de queratinocitos KGM-GOLD (KGM oro y suplementos) | Lonza | 00192151 y 00192152 | |
| Anticuerpo de actina de músculo liso | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilución (1:200) |
| Anticuerpo de citoqueratina14 de ratón | Abcam | ab7800 | Dilución (1:100) |
| Anticuerpo S100 de ratón | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilución (1:200) |
| Multicámara (portaobjetos de vidrio de 4 pocillos) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Montante antidecoloración con DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Anticuerpo Rabbit K10 | Sigma-Aldrich | SAB4501656 Dilución (1:100) | |
| Anticuerpo p75-NTR de conejo | Millipore | AB1554 | Dilución (1:500) |
| Vimentina de conejo | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilución (1:200) |
| Medio de cultivo celular de Schwann | ScienCell Research | 1701 | |
| Pinzas de precisión DUMONT rectas con puntas extrafinas Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Esterilizar con alcohol al 70% antes de usar |
| Tijeras IRIS, afiladas/afiladas. Longitud 4– 3/8" (111 mm) | Codman | 54-6500 | Esterilizar con alcohol al 70% antes |
| de usar Cuchilla quirúrgica - afilada esterilizada (cuchillas de un solo filo Duro Edge Economy) | Cuchillas de afeitar de la compañía | 94-0120 | Esterilizar con alcohol al 70% antes de usar |
| Matraz de cultivo T25 | Corning | 353109 | |
| Tampón de neutralización de tripsina (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Tripsina/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Microscopio invertido | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Microscopio Apotome.2 | Para la inmunofluorescencia de un portaobjetos de cámara que contiene células teñidas |
| Microscopio invertido | ZEISS | Primovert | Para visular/observar la unión o desconexión de células |
Referencias
- Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J.
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Reimpresiones y permisos
