Técnicas de microscopía para interpretar la colonización fúngica en tejidos de plantas micoheterótrofas y germinación simbiótica de semillas

Summary

Este protocolo tiene como objetivo proporcionar procedimientos detallados para recolectar, fijar y mantener muestras de plantas micoheterótrofas, aplicando diferentes técnicas de microscopía como microscopía electrónica de barrido y transmisión, microscopía de luz, confocal y fluorescencia para estudiar la colonización fúngica en tejidos vegetales y semillas germinadas con hongos micorrícicos.

Abstract

La botánica estructural es una perspectiva indispensable para comprender completamente la ecología, la fisiología, el desarrollo y la evolución de las plantas. Al investigar plantas micoheterótrofas (es decir, plantas que obtienen carbono de hongos), aspectos notables de sus adaptaciones estructurales, los patrones de colonización tisular por hongos y la morfoanatomía de los órganos subterráneos pueden iluminar sus estrategias de desarrollo y sus relaciones con las hifas, la fuente de nutrientes. Otro papel importante de los hongos simbióticos está relacionado con la germinación de las semillas de orquídeas; todas las especies de Orchidaceae son micoheterótrofas durante la germinación y la etapa de plántula (micoheterotrofia inicial), incluso las que fotosintetizan en etapas adultas. Debido a la falta de reservas nutricionales en las semillas de orquídeas, los simbiontes fúngicos son esenciales para proporcionar sustratos y permitir la germinación. El análisis de las etapas de germinación desde perspectivas estructurales también puede responder preguntas importantes sobre la interacción de los hongos con las semillas. Se pueden aplicar diferentes técnicas de imagen para revelar hongos endófitos en tejidos vegetales, como se propone en este artículo. Las secciones a mano alzada y delgadas de los órganos de la planta se pueden teñir y luego observar mediante microscopía óptica. Un fluorocromo conjugado con aglutinina de germen de trigo se puede aplicar a los hongos y co-incubar con Calcofluor White para resaltar las paredes celulares de las plantas en microscopía confocal. Además, se detallan las metodologías de microscopía electrónica de barrido y transmisión para orquídeas micoheterótrofas, y se exploran las posibilidades de aplicar dichos protocolos en plantas relacionadas. La germinación simbiótica de semillas de orquídeas (es decir, en presencia de hongos micorrícicos) se describe en detalle en el protocolo, junto con las posibilidades de preparar las estructuras obtenidas de diferentes etapas de germinación para análisis con microscopía óptica, confocal y electrónica.

Introduction

La investigación estructural en botánica, que abarca la morfología y anatomía de las plantas, es básica para comprender todo el organismo^1,2, y proporciona perspectivas indispensables para integrar y contribuir al conocimiento sobre la ecología, fisiología^, desarrollo y evolución de las plantas³. Los métodos en morfología y anatomía vegetal actualmente comprenden protocolos, equipos y conocimientos desarrollados recientemente, así como hace más de un siglo². La ejecución continua y la adaptación de métodos clásicos (por ejemplo, microscopía óptica) junto con técnicas más recientes (por ejemplo, microscopía confocal, microtomografía de rayos X) tienen la misma base esencial: conocimientos teóricos que permiten el desarrollo de una metodología.

La herramienta principal en anatomía y morfología vegetal es la imagen. A pesar de la idea errónea de que tales análisis son simples observaciones, dando espacio a interpretaciones subjetivas², el análisis y la comprensión de las imágenes en esta área requieren el conocimiento de los métodos aplicados (el equipo, el tipo de análisis, los procedimientos metodológicos), los componentes celulares, la histoquímica y el cuerpo de la planta (organización y función del tejido, ontogenia, adaptaciones morfológicas). La interpretación de las imágenes obtenidas a través de una variedad de métodos puede conducir a correlacionar forma y función, descifrar la composición química de una estructura, corroborar la descripción de taxones, comprender las infecciones por fitopatógenos y otras evaluaciones similares.

Al investigar plantas micoheterótrofas (MH) (es decir, plantas no fotosintéticas que obtienen carbono de hongos micorrícicos^4,5), aspectos notables de sus adaptaciones estructurales, los patrones de colonización tisular por hongos y la morfoanatomía de los órganos subterráneos pueden iluminar sus estrategias de desarrollo y relaciones con las hifas^, que son la fuente de nutrientes. Los órganos subterráneos de las plantas MH suelen mostrar importantes adaptaciones relacionadas a su asociación con hongos del suelo, por lo que es esencial realizar estas investigaciones anatómicas y morfológicas⁶. Los órganos aéreos de las especies MH no deben ser ignorados, ya que los endófitos también pueden estar presentes en estos tejidos, incluso si no son hongos micorrícicos (observaciones personales, aún no publicadas).

Además de la esencialidad bien establecida de la asociación de hongos micorrícicos con especies MH durante todo su ciclo de vida⁷, todas las especies de orquídeas, incluso las autótrofas, tienen una etapa micoheterotrófica obligada inicial en ambientes naturales. Ocurre porque el embrión de las orquídeas es indiferenciado y carece de endospermo o cotiledones, siendo así incapaz de desarrollarse y establecerse en ambientes naturales sin el apoyo nutricional de socios fúngicos ^4,8. Considerando eso, los protocolos de germinación simbiótica pueden ser aplicados no sólo a especies MH sino también a orquídeas fotosintéticas, con el objetivo de investigar la especificidad orquídea-hongo en germinación y desarrollo protocormo, una metodología ampliamente aplicada en iniciativas para la conservación de especies amenazadas 9,10,11.

En este ensamblaje de métodos, describimos pasos importantes involucrados en la recolección, fijación y almacenamiento de muestras de plantas MH para estudios anatómicos (sección 1), análisis de superficie y selección de muestras (sección 2), métodos de seccionamiento (a mano alzada: sección 3, microtomía: sección 4, criomicrotomía: sección 5), tinción y montaje (sección 6), fluorescencia y microscopía confocal de endófitos fúngicos (sección 7), microscopía electrónica de barrido (sección 8), y microscopía electrónica de transmisión (sección 9). Además, describimos un método de germinación simbiótica para semillas de orquídeas (MH y autótrofa, sección 10), ya que los métodos de imagen mencionados anteriormente se pueden aplicar con éxito para analizar la colonización fúngica de semillas, protocormos y plántulas en el proceso de germinación.

Figura 1: Resumen esquemático de los métodos de imagen. Los esquemas proporcionan indicaciones de los pasos del protocolo en los que se detallan. Abreviaturas: GMA = metacrilato de glicol, OCT = compuesto de temperatura de corte óptima, SEM = microscopía electrónica de barrido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las técnicas de microscopía descritas aquí en detalle (Figura 1) están precedidas por los siguientes pasos esenciales: recolectar, fijar, deshidratar, incrustar y seccionar muestras. Como los pasos son variables (Figura 1) dependiendo de la(s) técnica(s) elegida(s), es importante pensar en el futuro, considerando los fijadores que se prepararán y transportarán al sitio de recolección, cómo se deben preparar las muestras antes de la fijación, los procesos de deshidratación que se utilizarán (sección 1) y las diferentes posibilidades de incrustación y métodos de seccionamiento (secciones 4, 5, y 9). La Figura 1 resume secuencialmente todos los pasos requeridos para cada técnica de microscopía que se describen a continuación.

Protocol

1. Recolectar, fijar y mantener muestras

NOTA: Las plantas totalmente MH generalmente se pueden encontrar en el sotobosque del bosque oscuro 12,13, principalmente en áreas húmedas y abundantes en basura, mientras que las plantas parcialmente MH se pueden encontrar en bosques más abiertos^12,13. Las plantas MH generalmente tienen órganos subterráneos bien desarrollados en una variedad de formas y tamaños.

1. Al recolectar especies MH, explore el suelo alrededor de la base de la planta, teniendo cuidado de no dañar los órganos subterráneos y evite tirar de las plantas del suelo para evitar desconectar los órganos aéreos de los subterráneos.
2. Excave cuidadosamente alrededor de las estructuras aéreas con una paleta de jardinería mientras explora los órganos subterráneos como raíces, tallos, rizomas y órganos de almacenamiento, sin dañar estas estructuras.
3. Retire las partículas de tierra para preservar las estructuras frágiles y lave delicadamente estos órganos con agua del grifo para enjuagar las partículas restantes del suelo antes de fijar las muestras.
4. Las plantas MH asociadas con la hojarasca exigen atención adicional; Recoja cuidadosamente los órganos conectados al material en descomposición a través de sus hifas, evite extraer estos órganos de las estructuras conectadas y recójalos con cuidado, ya que estas partes son muy delicadas. Conserve las estructuras con tales conexiones y recoja la basura también para su análisis.
5. Si opta por analizar material fresco utilizando técnicas de imagen, mantenga las muestras en bolsas de plástico cerradas con la humedad adecuada, evaporando suficiente agua e hidratando la planta, evitando que el exceso de agua esté en contacto con las muestras. Transpórelos al laboratorio inmediatamente y analice las muestras el mismo día en que fueron recolectadas, prestando atención si las muestras aún se conservan al analizarlas.
6. Lleve los fijadores al sitio de recolección en recipientes bien sellados. Fijar las muestras rápidamente después de la recolección para microscopía óptica (LM) y microscopía electrónica de barrido (SEM) en cualquiera de los siguientes fijadores: formalina tamponada neutra al 10% (NBF¹⁴, Tabla 1) o solución de Karnovsky (modificada¹⁵, Tabla 2). La solución de Karnovsky se puede preparar con tampón fosfato^{0,2 M 15}, cuya receta se describe en la Tabla 3.
7. Para el análisis por microscopía electrónica de transmisión (TEM), dividir las muestras con un espesor de 4-3 mm dentro de una gota de tampón de cacodilato glutaraldehído-sódico (modificado¹⁶, Tabla 4) en secciones más pequeñas de 1-2 mm de espesor. Deseche los bordes cortados fuera de la gota. Transferir inmediatamente las secciones a un tubo de recolección con un volumen de fijador más de 10 veces mayor que el volumen de las muestras, ya que es un fijador aditivo (es decir, sus moléculas se agregan químicamente a las proteínas fijadas¹⁶).
   PRECAUCIÓN: Los tres fijadores descritos son altamente tóxicos. Evite la inhalación, especialmente durante su uso en el campo. Prepare todos los fijadores en una campana extractora con guantes. No mezcle cacodilato y ácidos, ya que se puede formar gas arsénico¹⁶.
8. Si las muestras fijas flotan en el fijador, esto indica la presencia de gas en los tejidos vegetales. El aire y otros gases impiden que el fijador penetre en toda la muestra². Eliminar el gas de los tejidos remuestreándolos en partes más pequeñas y usando una bomba de vacío (presión de -300 a -400 inHg) hasta que todas las muestras se hundan en el fondo de la solución¹⁷. Tenga cuidado ya que la presión excesiva ejercida por la bomba puede dañar las muestras.
9. Después de al menos 48 h en la solución de Karnovsky o NBF al 10%, lavar las muestras en 0,2 M PB (Tabla 3) y deshidratarlas con una serie de etanol al 10%, 30%, 50% y finalmente al 70%. Para muestras delicadas, deshidratar durante 30 minutos en cada concentración; Para muestras más grandes, deshidratar durante 1 h o más.
   NOTA: Una solución de etanol al 70% es el medio ideal para almacenar muestras. Las muestras en etanol al 70% se pueden almacenar a temperatura ambiente durante años. No almacene material vegetal durante largos períodos en los fijadores, ya que la eliminación de los agentes fijadores es un paso esencial después de la fijación².
10. Conservar las muestras en glutaraldehído-cacodilato a 4 °C antes de proceder a la posfijación (paso 9.1).

10% de formalina tamponada neutra (NBF)14
Paso 1	añadir 10 ml de solución de formaldehído al 37-40% en 80 ml de agua destilada
Paso 2	añadir 0,4 g de fosfato de sodio monobásico monohidrato (NaH2PO4· H2O) a la solución
Paso 3	añadir 0,65 g de fosfato sódico dibásico, anhidro (Na2HPO4)
Paso 4	engordar el volumen a 100 mL

Tabla 1: Receta de formalina tamponada neutra al 10% 14.

Solución de Karnovsky (modificada15)
Paso 1	en 20 ml de agua destilada a 60-70 °C
Paso 2	Añadir 0,8 g de paraformaldehído (para obtener 4% p/v), agitando
Paso 3	añadir 1-4 gotas de NaOH al 40% y remover hasta que la solución se vuelva clara
Paso 4	enfriarlo y añadir 30 mL de tampón fosfato 0.2 M pH 7.2 (Tabla 3)
Paso 5	diluir glutaraldehído al 25% en 0,1 M PB (pH 7,2) para obtener glutaraldehído al 1% (volumen final: ~60 mL)
Paso 6	añadir glutaraldehído al 1% (paso 5) a la solución obtenida en el paso 4 hasta completar hasta 100 ml de fijador

Tabla 2: Receta de la solución de Karnovsky (modificada¹⁵).

Tampón fosfato (PB) 0,2 M pH 7,2
Paso 1	añadir 14,196 g de fosfato sódico dibásico, anhidro (Na2HPO4) a 400 mL de agua destilada
Paso 2	añadir 13,8 g de fosfato sódico monobásico monohidrato (NaH2PO4· H2O)
Paso 3	Revuelva hasta que la solución esté clara
Paso 4	ajustar el volumen final a 500 ml con agua destilada
Paso 5	ajustar el pH a 7.2
Paso 6	para un PB de 0,1 M, diluir 1:1

Tabla 3: Receta de tampón de fosfato 0.2 M.

Tampón de cacodilato de sodio glutaraldehído al 3% 0,2 M (modificado 16)
Paso 1	Tampón de cacodilato 0,2 M: añadir 4,28 g de trihidrato de cacodilato de sodio en 100 ml de agua destilada
Paso 2	ajustar el pH a 7.2
Paso 3	añadir 12 ml de glutaraldehído al 25% en 25 ml de la solución en la etapa 2 (tampón de cacodilato 0,2 M pH 7,2)
Paso 4	enrasar el volumen a 100 ml con agua destilada

Tabla 4: Receta de tampón de cacodilato de glutaraldehído sódico al 3% 0.2 M (modificado¹⁶).

2. Análisis superficial de órganos en material fijo y no fijo

1. Para analizar las hifas superficiales en órganos, especialmente subterráneos, y aquellos en contacto con hojarasca, observe material fijo o fresco en un microscopio de disección (estereomicroscopio) con un aumento de 7.5x o más, dependiendo de las muestras analizadas.
   1. Visualice las muestras sumergidas en el fijador, etanol al 70% (si se almacena en él) o agua del grifo en el caso de material fresco. Evite la luz directa del microscopio de disección, ya que puede secar y dañar las muestras.
   2. Búsqueda de áreas de interés en las muestras, guiada por las hifas superficiales y rizomorfos. Seleccione muestras que contengan áreas con rizomorfos superficiales, ya que se pueden seccionar para visualizar pelotones y bobinas de hifas dentro de las células corticales en raíces y tallos.
   3. Después de la selección, siga los pasos 1.6 y 1.9 si las muestras aún no están fijas. Si lo desea, fotografíe muestras frescas con un microscopio óptico sin fijación, como se describe en la sección 3.
   4. Utilice la cámara acoplada al microscopio estereoscópico para recoger imágenes de superficies de órganos, rizomorfos y otras estructuras observadas. En tales casos, organice un color de fondo adecuado para contrastar bien con el material y, si es posible, elija un material de fondo con una superficie menos rugosa (por ejemplo, papel).

3. Secciones a mano alzada de órganos vegetales

NOTA: Las secciones a mano alzada de los órganos de las plantas pueden ser un desafío, especialmente para estructuras pequeñas y delgadas. Sin embargo, estas secciones de tejidos con endófitos fúngicos pueden, en algunos casos, evidenciar mejor las hifas y otras características en comparación con las secciones delgadas.

1. Seccionar muestras frescas o fijas con una cuchilla afilada, cortarlas lo más delgadas posible y colocarlas inmediatamente en una pequeña placa de Petri con agua (si está fresca) o etanol al 70% (si está fijada). Use un pincel pequeño para manipular las secciones sin dañarlas.
2. Para facilitar la seccionación de materiales más difíciles (es decir, órganos pequeños, delgados y flexibles), rodee la muestra en una estructura, por ejemplo, poliestireno o pecíolo de Cecropia . Talle el soporte para acomodar la muestra y haga una sección delgada de la muestra y el soporte por completo.
3. Manchar y montar las muestras como se describe en la sección 6.

4. Incrustación de muestras de plantas en resina y seccionamiento

1. Deshidratar aún más las muestras almacenadas en etanol al 70% en 80%, 96% y 2x en etanol al 100%, durante 30 min a 2 h dependiendo del tamaño y la composición de las muestras.
2. Use un kit de resina de metacrilato de glicol (GMA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Véase Gerrits y Horobin (1996)¹⁸ para más consideraciones. Siga los pasos de infiltración e incrustación en consecuencia.
   PRECAUCIÓN: La resina GMA es tóxica, puede causar reacción alérgica e irritación de la piel, los ojos y las mucosas. Use los reactivos en una campana extractora y guantes.
3. Utilice bandejas de moldeo de polietileno para incrustar, seleccionadas por tamaño de muestra (por ejemplo, 13 mm x 19 mm x 5 mm para muestras más grandes, 6 mm x 8 mm x 5 mm para muestras más pequeñas). Preste atención a la orientación deseada de la muestra dentro del molde y use una aguja para ayudar a orientarse.
4. Dejar para la polimerización, preferiblemente a temperatura ambiente, hasta que se solidifique por completo. El proceso de endurecimiento suele durar unas horas, aunque se recomienda desmoldar los bloques al día siguiente. Después de la polimerización, separe cuidadosamente los bloques de resina de los moldes y proceda a unir los bloques lo antes posible para evitar la curvatura del bloque.
5. Lija la cara del bloque de resina que se unirá, creando una superficie plana. Pegue el bloque de resina a un cuboide de madera (se recomienda 2 cm x 2 cm x 3 cm) con un adhesivo de cianoacrilato líquido de viscosidad media (consulte la Tabla de materiales). Asegúrese de que la resina esté completamente unida para evitar comprometer la sección.
6. Realice la sección en un microtomo rotativo como se describe a continuación.
   PRECAUCIÓN: Las hojas de los cuchillos de microtomo son muy afiladas y pueden causar accidentes. Asegúrese de manejarlos siguiendo todas las medidas de seguridad. Antes de acercarse al cuchillo (por ejemplo, para cambiar el bloque, para humedecer la resina), bloquee el volante grueso y coloque la cubierta de seguridad de la cuchilla. Guarde las cuchillas desechables en los casos apropiados. Tenga mucho cuidado al reemplazar las cuchillas.
   NOTA: Se pueden usar diferentes tipos de cuchillos (por ejemplo, desechables o fijos; vidrio o acero) para seccionar resina GMA¹⁸. La calidad de las secciones depende de qué tan afilado sea el cuchillo. Asegúrese de que el cuchillo esté bien sujeto y no pueda moverse. Es posible que sea necesario cambiar regularmente los cuchillos desechables para lograr una mejor sección.
   1. Fije el cuboide de madera firmemente al soporte del bloque. Ajuste la orientación de la sección con los tornillos de orientación y asegúrese de un ángulo adecuado de la cuchilla utilizando la inclinación de la cuchilla. Seleccione el grosor de las secciones; use un ajuste más grueso para el recorte y un ajuste más delgado para las secciones seleccionadas, ya que las secciones GMA se adhieren más adecuadamente a la diapositiva de vidrio cuando son más delgadas; El grosor sugerido para los tejidos vegetales es de 5-8 μm.
   2. Antes de comenzar, enfríe la habitación, si es necesario, ya que las temperaturas más altas empeoran la calidad de las secciones. Prepare lo siguiente para la sección: un vaso de precipitados con agua destilada, una placa caliente, pinceles (al menos dos), pinzas de punta fina, una pipeta Pasteur, portaobjetos de vidrio, papel de filtro (o papel de seda) y un lápiz (para identificar las muestras que se están seccionando).
   3. Ajuste la placa caliente a 50 °C y coloque el vaso de precipitados sobre ella. Preste atención a las diferencias en el calentamiento dependiendo del área de la placa caliente (por lo general, el área media se calienta más que los bordes; caliente el agua en el medio, preferiblemente).
   4. Elija un portaobjetos de vidrio, identifíquelo con un lápiz y pipete el agua destilada tibia por toda la superficie del portaobjetos. Si es necesario, use una solución (por ejemplo, detergente y agua, o etanol al 70%) para romper la tensión entre el agua y el vidrio, de modo que todo el portaobjetos esté igualmente cubierto. Algunos tipos de portaobjetos deben limpiarse previamente con etanol al 70% para obtener una adherencia adecuada a la sección.
   5. Comience avanzando gradualmente la cara del bloque de resina hacia la hoja del cuchillo. No intente seccionar sin avanzar primero el bloque, o de lo contrario el equipo y el bloque pueden dañarse. Si es necesario, recorte el bloque con un grosor superior (10 μm o más).
   6. Al acercarse a una sección adecuada, haga un movimiento firme en un solo sentido con el volante, de modo que la sección se realice de inmediato. Mantenga un control sobre la humedad de la resina. Durante la sección, humedezca regularmente la cara del bloque que se está cortando con un pincel humedecido en agua destilada si hay un problema con las secciones de rizado. Retire el exceso de agua con un pañuelo de papel.
   7. Con un par de pinzas de punta fina, coloque la sección obtenida en el agua sobre el tobogán. Al entrar en contacto con el agua, la resina GMA se estira. Si es necesario, use un pincel para desplegar y estirar suavemente las secciones. Use otro pincel para mantener constantemente la cuchilla libre de residuos de resina. No cambie entre los pinceles para evitar mojar la cuchilla.
   8. Después de poner en cola todas las secciones deseadas en la diapositiva, seque la cara inferior de la diapositiva y colóquela sobre la placa caliente. Retire el exceso de agua de la parte superior del portaobjetos frotando suavemente con un papel de filtro (opcional). Las secciones se adherirán cuando el agua se evapore del tobogán. No deje las guías demasiado largas para evitar que las secciones se dañen por el calor excesivo.
   9. Guarde los portaobjetos en una caja portaobjetos, lejos del polvo y el sol, y utilícelos para teñir y otros procedimientos. Las diapositivas se pueden almacenar durante varios años.

5. Congelación de muestras de plantas y seccionamiento con un criostato

NOTA: La consideración esencial en la criosección de tejido biológico es reducir el daño debido a la formación de cristales de hielo al congelar muestras. La crioprotección generalmente se realiza mediante la infusión de soluciones químicamente inertes como glicerol o sacarosa^19,20.

1. Un día antes de la sección de muestra, realice los siguientes pasos.
   1. Diluir 100 mL de 0.2 M PB (Tabla 3) en 100 mL de agua destilada para obtener 200 mL de 0.1 M PB. Prepare soluciones de sacarosa al 10%, 20% y 30% en PB 0.1 M (por ejemplo, para una solución al 10%, agregue 2 g de sacarosa en 20 ml de tampón).
   2. Para muestras frescas, lávelas en 0,1 M PB durante 30 min. Para las muestras en un fijador, lávelas en el mismo tampón utilizado para preparar el fijador durante 30 minutos. Para muestras en etanol al 70%, hidratarlas en etanol al 50% y al 30% y lavar en 0,1 M PB durante 1 h en cada solución.
   3. Incubar las muestras durante 2 h en sacarosa al 10%, 2 h en sacarosa al 20% y 2 h en sacarosa al 30%, a temperatura ambiente. Después, incubar durante la noche en sacarosa al 30% a 4 °C (o al menos durante 3 h; el tiempo máximo es de 48 h).
2. El día del seccionamiento, preparar 40% y 50% de sacarosa en 0.1 M PB; No prepare soluciones de sacarosa con más de 12 h de antelación. Incubar durante 2 h en cada concentración de sacarosa, a 4 °C.
3. Para la incrustación, en moldes pequeños, hacer una capa de compuesto OCT (medio de temperatura de corte óptima, utilizado para incrustar y congelar las muestras) y mantenerlo a -20 °C para congelar. Los moldes pueden ser moldes histológicos regulares, aunque para facilitar el desmoldeo de los bloques, se pueden hacer papeles o papel de aluminio utilizando un pequeño cuboide como marco y cinta adhesiva.
4. Después de que la capa inferior del compuesto OCT se congele en los moldes, trabaje dentro de una cámara de criostato (aprox. -27 ° C). Colocar las muestras incubadas en sacarosa al 50% en los moldes, en la orientación en la que serán seccionadas. La cara superior de un bloque cuboide suele ser una mejor cara de sección. Marque en el molde donde se colocan las muestras, para que el bloque se pueda recortar fácilmente y se mantenga la orientación correcta.
5. Rodee las muestras en compuesto OCT y reviente cualquier burbuja de aire que toque las muestras. Congelar a -20 °C. Con los bloques completamente congelados, colóquelos dentro de la cámara de criostato (aprox. -27 °C). Desmolde cada uno solo antes de usarlo y preste atención a las marcas que indican la ubicación de la muestra dentro del bloque.
6. Como el compuesto OCT se corta fácilmente con una cuchilla, recorte adecuadamente los bloques antes de colocarlos en los mandriles. Coloque un poco de compuesto OCT en el mandril de criostato y coloque el bloque de modo que la cara superior esté seccionada. Las caras con áreas más pequeñas proporcionan mejores secciones. Espere hasta que el bloque esté bien unido al mandril y pruébelo antes de comenzar a seccionar.
7. Coloque el mandril firmemente en el portamandriles. Ajuste la orientación de la sección con los tornillos de orientación. Ajuste el ángulo del cuchillo usando la inclinación del cuchillo. Seleccione el grosor de las secciones. Las muestras se pueden seccionar secciones de resina más gruesas que las habituales. Las secciones en un rango entre 5-20 μm se obtienen con éxito, siendo las secciones más gruesas más fáciles de hacer (menos rizado y menos daño de las estructuras).
8. Avance la cara del bloque congelado hacia la hoja del cuchillo. No intente seccionar sin hacerlo, o de lo contrario el bloque puede desprenderse del mandril y dañarse. Si es necesario, recorte el bloque con un grosor superior (10 μm o más).
9. Al acercarse a una sección adecuada, coloque la placa estabilizadora (es decir, una placa transparente que retenga la sección) sobre el cuchillo y haga un movimiento firme en un solo sentido con el volante, de modo que la sección se haga de inmediato. Los problemas de rizado pueden ser causados si la placa estabilizadora necesita ser ajustada (generalmente es ajustable en referencia a la cuchilla) o si hay residuos en la cuchilla. Limpie la cuchilla constantemente con un pincel para eliminar los residuos.
10. Utilice portaobjetos especiales para que las secciones se adhieran fácilmente, como portaobjetos silanizados (comerciales o preparados con 2% de aminoalquilsilano en acetona 21), o portaobjetos preparados con 500 μg/ml de poli-L-lisina en agua destilada 21 o 0,2% de gelatina (ver detalles²¹). Mantenga los portaobjetos a temperatura ambiente.
11. Para adherir la sección a una corredera, levante la placa estabilizadora y haga que la corredera toque rápidamente la sección. Como el portaobjetos está a temperatura ambiente, la sección se derrite inmediatamente y se adhiere al portaobjetos. Preste atención para girar la cara tratada de la diapositiva hacia la sección, que puede permanecer por encima del cuchillo o en la cara interna de la placa estabilizadora. Para evitar el curvamiento de las secciones, realice este paso rápidamente tan pronto como se levante la placa y tenga cuidado de no contorsionar la sección.
12. Deje el portaobjetos fuera de la cámara de criostato (a temperatura ambiente) si se le van a añadir nuevas secciones. Después de adherir todas las secciones deseadas al portaobjetos, manténgalo dentro de la cámara de criostato o en el congelador (-20 °C o menos). No exponga los portaobjetos a la humedad. Guárdelas en una caja de diapositivas y recuerde identificar las diapositivas con un lápiz.
    NOTA: Las diapositivas y bloques de OCT se pueden almacenar a -20 °C, aunque no durante demasiado tiempo. Para lograr mejores resultados, use las diapositivas y los bloques dentro de unos días.

6. Tinción de secciones de plantas y endófitos para microscopía óptica

NOTA: Se pueden usar muchos tipos de tinciones para secciones de plantas. Es difícil teñir diferencialmente los hongos endófitos y los tejidos vegetales. Aunque no es un procedimiento de tinción, en la sección 7 se presenta un método para marcar estructuras de hongos (fluorescencia con un conjugado de aglutinina de germen de trigo). Las secciones a mano alzada (explicadas en la sección 3), las secciones de resina (sección 4) y las criosecciones (sección 5) se pueden teñir, aunque las tinciones a base de fenol y alcohol son un desafío para estas muestras, ya que la resina GMA y la OCT pierden adherencia al portaobjetos en estos casos.

1. Utilice uno o combine los siguientes métodos habituales de tinción para muestras de plantas.
   1. Azul de toluidina O^22,23, un método ampliamente aplicado para la tinción general de secciones de plantas. Preparar una solución de 0,05% de azul de toluidina O en 0,1 M de fosfato (pH 6,8) o tampón de citrato 0,09 M (pH 4,5-4,8), dependiendo de la especie y tipos de tejido. Incubar secciones de resina GMA durante 2-10 minutos usando un frasco de tinción de portaobjetos o colocando algunas gotas sobre las secciones si se manchan algunas diapositivas. Lavar cuidadosamente con agua destilada o tampón después de la incubación y montar los portaobjetos con agua o secarlos en una placa caliente para producir portaobjetos permanentes como se describe en el paso 6.3.
   2. El reactivo^{Lugol 2} indica la presencia de almidón. Prepare una solución de yodo al 5% (I₂) y yoduro de potasio (KI) al 10% en agua destilada. Manchar las secciones durante 2 min, agregando unas gotas por encima del portaobjetos, y luego lavar con agua destilada. Esta prueba histoquímica generalmente se aplica a portaobjetos temporales.
   3. Sudán III, IV y negro^{B 24,25} tiñen para diferentes lípidos. Prepare una solución de Sudán al 0,3% (III, IV o B negra) en etanol al 70%, caliéntela hasta que hierva y deje enfriar. Use el sobrenadante, fílelo e incube secciones durante 15-30 minutos en una placa de Petri cerrada. Lave las secciones cuidadosamente con etanol al 70% y agua destilada. Monte los toboganes con agua (generalmente se aplica solo a toboganes temporales).
      NOTA: Como Sudán es un tinte a base de alcohol, es más adecuado para secciones a mano alzada. Realice la tinción de la sección de resina GMA con cuidado, ya que generalmente se desprenden de la diapositiva.
2. Para toboganes temporales, monte las secciones en agua o glicerina y observe posteriormente. Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas para conservarlos un poco más.
3. Para portaobjetos permanentes, monte las secciones con resinas sintéticas (por ejemplo, medio de montaje rápido, consulte Tabla de materiales). Gotea unas gotas del medio de montaje (puede desbordar el cubreobjetos), coloca el cubreobjetos con cuidado para evitar burbujas y usa pinzas para la ropa para presionar la corredera contra el cubreobjetos hasta que esté completamente seca. Elimine el exceso de medio de montaje seco con una cuchilla de afeitar.

7. Aplicación de un fluorocromo conjugado a la aglutinina de germen de trigo en microscopía fluorescente y confocal

NOTA: Este método se puede aplicar a secciones a mano alzada (explicadas en la sección 3), secciones de resina (sección 4) y criosecciones (sección 5). Las criosecciones pueden ser adecuadas para fines de microscopía confocal, ya que se pueden proporcionar muestras más gruesas en comparación con las secciones de resina, pero no tan gruesas como las de mano alzada. Un fluorocromo conjugado con la aglutinina de germen de trigo (WGA, ver Tabla de materiales) se aplica a imágenes fúngicas en microscopía de fluorescencia²⁶. Un microscopio confocal no es esencial, aunque puede proporcionar imágenes tridimensionales claras de las estructuras de las plantas²⁷.

1. Preparar una solución de 0,2 mg/ml de conjugado WGA-fluorocromo en 0,1 M PB²⁸ (pH 7,2, comprobar paso 5.1.1 y Tabla 3). Preparar una solución de Calcofluor White al 1% en 0,1 M PB (pH 7,2). Prepare pequeñas cantidades de estas soluciones, ya que las secciones se incuban directamente con ellas.
2. Incubar las secciones en los portaobjetos de vidrio durante 30 minutos en la solución conjugada WGA-fluorocromo²⁹, utilizando suficiente volumen para cubrir las secciones, luego lavar en 0,1 M PB.
3. Incubar las secciones en la solución de calcofluor, utilizando suficiente volumen como medio de montaje. La solución se puede mantener durante el período de observación.
4. Coloque cubreobjetos en los portaobjetos y observe en un microscopio confocal o un microscopio de luz fluorescente utilizando los siguientes filtros: TC/GFP (excitación: 470-440, emisión: 525-550, para WGA-fluorocromo en la Tabla de materiales - la pared celular fúngica fluoresce verde bajo este filtro²⁹) y DAPI (excitación: 358, emisión: 463, para Calcofluor White)³⁰.
   NOTA: Las imágenes tridimensionales se pueden obtener utilizando la función de la serie Z en el microscopio confocal²⁷.

8. Microscopía electrónica de barrido de órganos vegetales

1. Después de fijar las muestras, realizar la deshidratación y almacenar etanol al 70% (sección 1), una posibilidad es cortar muestras para exponer cualquier superficie deseada para el análisis SEM, si es necesario (por ejemplo, tejidos internos, estructura del ovario). Use una hoja de afeitar afilada y nueva y haga cortes con un movimiento unidireccional, evitando una apariencia dañada de estas áreas en SEM. Si es necesario, use un microscopio estereoscópico para seleccionar las muestras y considere el área de talones metálicos para determinar el tamaño de las muestras.
2. Muestras adicionales de deshidratación para SEM en una serie etanólica: 80%, 96% y 2x en alcohol etílico absoluto (≥99,8%). Mantener muestras pequeñas y delicadas durante 30 minutos en cada concentración y muestras más grandes y densas durante 1 h.
3. Doble los sobres pequeños con papel de seda para organizar las muestras para los próximos pasos, las muestras más grandes se pueden manejar sin un sobre. Identifique los sobres con un lápiz escribiendo una letra o un número, y mantenga un registro de todas las muestras en cada uno. Conservar las muestras en etanol absoluto, aunque no durante mucho tiempo, y proceder al paso 8.4 lo antes posible.
4. Proceda al secado del punto crítico (CP). Opere un secador CP de acuerdo con los procedimientos operativos estándar. Coloque las muestras en etanol absoluto (fluido intermedio) en una cámara de presión. En el punto crítico de_CO2 (31 °C, 7,3 x 10⁶ Pa) el fluido intermedio se disuelve en el fluido de transición (dióxido de carbono líquido) y las muestras se secan³¹.
5. Después del secado CP, almacenar las muestras lo antes posible en un recipiente de desecación, por ejemplo, un matraz sellado que contenga gel de sílice. La humedad atmosférica puede destruir las muestras si se reabsorben³¹.
6. Use talones de metal para montar las muestras. Antes de montar, ponte guantes para manipular los talones, sumérgelos en acetona durante 5 min para eliminar cualquier grasa, y déjalos secar. Utilice una cinta adhesiva de carbono conductiva de doble cara para fijar las muestras en el trozo, y un microscopio estereoscópico para ayudar a colocar las muestras, teniendo en cuenta que la vista desde arriba es la única perspectiva posible en las imágenes SEM.
7. Manipule las muestras con pinzas de punta fina, teniendo cuidado ya que la parte de la muestra que tocan las pinzas generalmente está dañada, así que intente tocar las partes colocadas lejos de las áreas de interés (por ejemplo, áreas en contacto con la cinta). Mantenga los talones con muestras en una placa de Petri sellada con gel de sílice. Continúe con el paso 8.8 lo antes posible.
8. Utilice una capa de pulverización catódica para depositar una capa de metal, generalmente oro o platino, en la superficie de las muestras en una atmósfera de baja presión de un gas inerte, frecuentemente argón³¹. Siga los procedimientos operativos estándar cuando utilice una recubridora de pulverización catódica. El espesor del recubrimiento depende de la topografía de las muestras, generalmente entre 15-40 nm³².
9. Mantenga los talones recubiertos en una placa de Petri sellada con gel de sílice, y siempre que el gel de sílice retenga la humedad, las muestras se pueden almacenar de esta manera durante semanas. Utilice un microscopio electrónico de barrido para analizar las muestras. Las muestras en vacío son golpeadas por un haz de electrones, y la emisión de señales de tal interacción se interpreta como imágenes³¹. Para más detalles sobre el funcionamiento de un microscopio electrónico de barrido, lea Jeffree y Read (1991)³¹ y Bozzola y Russell (1999)³².
10. Para reutilizar los talones, tire de la cinta adhesiva y frótelos con lana de alambre. Lavar en agua del grifo, sumergir en etanol absoluto y secar adecuadamente, evitando la oxidación del metal constituyente.

9. Microscopía electrónica de transmisión

1. Prefijar muestras con tampón glutaraldehído-cacodilato, como se explica en los pasos 1.7 y 1.10. Después de 12-24 h de prefijación, lavar las muestras 3 veces en tampón de cacodilato 0,2 M (pH 7,25) durante 10 min. Realizar postfijación con tetróxido de osmio al 1% (_OsO4) en tampón de cacodilato 0,2 M, durante 12 h en la oscuridad, a temperatura ambiente. Lavar 3 veces con agua destilada durante 5 min.
   PRECAUCIÓN: El cacodilato y el tetróxido de osmio son altamente tóxicos y no deben inhalarse. Utilícelos en campanas extractoras, siguiendo las respectivas fichas de datos de seguridad.
2. Deshidratar las muestras con etanol al 30%, 50%, 70% y 96%, 2x en cada concentración, durante 10 min. Luego, deshidratar 3 veces en alcohol absoluto, durante 15 minutos cada vez.
3. Infiltrar las muestras en resinas acrílicas hidrófilas (ver Tabla de materiales), una vez con resina 1:1 + etanol absoluto y 3x con resina pura durante 8-12 h cada una. Realizar la polimerización en cápsulas de gelatina a 60 °C hasta que se solidifique completamente (12 h máximo¹⁷).
4. Evaluar de cerca la orientación de las muestras dentro del bloque de resina; Cortar la parte superior del bloque, con una cuchilla de afeitar, haciendo una forma piramidal que concentra la muestra en el área de seccionamiento. Obtener secciones semifinas (250-500 nm)³³ en un ultramicrotomo con un cuchillo de diamante y colocar sobre portaobjetos de vidrio en unas pocas gotas de agua.
5. Mantener los portaobjetos en una placa caliente a 60 °C. Manchar las secciones con azul de toluidina O como en el paso 6.1.1 y dejar secar completamente la mancha. Lavar cuidadosamente con agua del grifo. Evalúe la sección obtenida dibujando cuatro cuadrantes y seleccionando el cuadrante más adecuado para el análisis.
6. Recorte el bloque para que la forma piramidal concentre el cuadrante elegido en la cara superior del bloque. Producir secciones ultrafinas (50-100 nm)^33,34. El espesor se evalúa de acuerdo con el color de interferencia de las secciones: las secciones con aproximadamente 70 nm aparecen plateado-oro, con aproximadamente 100 nm aparecen oro y con aproximadamente 200 nm aparecen^{azules 34}.
7. Recoja las secciones ultrafinas del agua utilizando rejillas de cobre y proceda al método de tinción de contraste con acetato de uranilo y citrato de plomo, como se describe a continuación.
   1. Prepare una solución de citrato de plomo (Tabla 5) y congele la solución final en tubos de microcentrífuga con 1 ml de solución en cada uno, solo descongelando justo antes de usar.
   2. Preparar una solución de acetato de uranilo: disolver 0,625 g de acetato de uranilo [UO 2(CH₃COO)₂] en 25 ml de agua destilada recientemente hervida y enfriada. Conservar en un matraz oscuro en el congelador.
      PRECAUCIÓN: El nitrato de plomo es tóxico si se ingiere. 1 N NaOH es altamente corrosivo. El acetato de uranilo es radiactivo y tóxico. No debe ingerirse, inhalarse ni entrar en contacto con la piel.
   3. Al teñir, coloque ambos reactivos preparados en jeringas separadas de 3 ml con unidades de filtro (poro de 0,22 μm, consulte la Tabla de materiales). Prepare una placa de Petri volteada boca abajo con una película termoplástica de sellado sobre ella (ver Tabla de materiales) y dentro de una placa más ancha, con pellets de NaOH en los bordes como trampa para CO₂³² (ver Figura 2).
   4. Deseche la primera gota, y sobre la película coloque una gota de acetato de uranilo y tres gotas de agua destilada por cada rejilla manchada. Haga lo mismo con el citrato de plomo y agregue tres gotas más de agua destilada.
   5. Incubar la rejilla (con el lado opaco hacia abajo, donde están las secciones) en uranilo durante 30 min (tiempo variable). Lave 3 veces en las gotas de agua destilada, secando la rejilla cada vez suavemente con papel de filtro en el lado brillante. Repita con la gota de citrato de plomo (30 min) y lávelo.
8. Después de al menos 4 h, analice las rejillas en un microscopio electrónico de transmisión. En este microscopio, un haz de electrones pasa a través de las secciones en vacío y la imagen se proyecta en una pantalla fluorescente. Para más detalles sobre el funcionamiento de un microscopio electrónico de transmisión, lea Bozzola y Russell (1999)³².

solución de citrato de plomo (para tinción con contraste TEM)
Paso 1	Rodea un vaso de precipitados con papel de aluminio
Paso 2	disolver 0,266 g de nitrato de plomo [Pb(NO3)2] en 6 ml de agua destilada recién hervida y enfriada
Paso 3	agitar durante 2 min
Paso 4	añadir 0,352 g de citrato trisódico [Na3(C6H5O7).2H2O] (la solución debe adquirir un aspecto lechoso)
Paso 5	agitar durante 15 minutos, sellar el vaso de precipitados con papel de estaño y transferir la solución a un vaso de precipitados de 10 ml
Paso 6	añadir 1,6 ml de NaOH 1N y 2,4 ml de agua destilada (la solución debe ser translúcida)
Paso 7	si es necesario, ajuste el pH cerca de 12

Tabla 5: Receta de solución de citrato de plomo.

Figura 2: Esquema de tinción de contraste con soluciones de citrato de plomo y acetato de uranilo . (A) Prepare las placas de Petri, una volteada al revés (en el centro) con película termoplástica para que las gotas se puedan colocar por encima de ella, dentro de una más ancha. Los pellets de NaOH son lugares alrededor del plato central. (B) Las gotas de acetato de uranilo se colocan en los círculos con la letra U, y las gotas de citrato de plomo en los círculos marcados L. DW indican gotas de agua destilada. Las cuadrículas se tiñen secuencialmente en la columna, por lo que se pueden teñir cinco cuadrículas simultáneamente como se representa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

10. Germinación simbiótica de semillas de orquídeas

1. Asegúrese de que las soluciones y todos los materiales utilizados en la germinación simbiótica de las semillas sean estériles para evitar la contaminación. Comience esterilizándolos en autoclave durante 20 minutos a 121 °C. Los pasos de germinación simbiótica se resumen en la Figura 3.
2. Desinfecte superficialmente las frutas y semillas sumergiéndolas en una solución de hipoclorito de sodio que contenga 2% de cloro activo durante 10-15 min para frutas y 7-10 min para semillas, considerando la rigidez y el grosor de la cubierta de semilla⁹. Las semillas delgadas y frágiles se pueden sumergir en una solución diluida de hipoclorito de sodio 1:1. Luego, lavar 3 veces en agua destilada esterilizada en autoclave para eliminar la solución de hipoclorito.
3. Recuperar las semillas filtrando en tejido serigráfico y utilizar las semillas para proceder a las pruebas de germinación (preferiblemente). Si es necesario, guárdelos en sobres de papel de filtro dentro de matraces de vidrio con gel de sílice, a 4 °C, cierre herméticamente los matraces y ciérrelos con film transparente. Transfiera algunas gotas de agua del último lavado al agar dextrosa de papa (PDA, 39 g / L), para evaluar la efectividad del proceso de lavado.
4. Antes de sembrar semillas en el medio de cultivo, evaluar su viabilidad a través de la prueba de tetrazolio (opcional) como se describe a continuación³⁵.
   1. Incubar aproximadamente 10 mg de semillas en un tubo de microcentrífuga con 1 ml de sacarosa al 10% en agua destilada, durante 24 h a temperatura ambiente (aprox. 25 °C), a la luz.
   2. Retire la solución de sacarosa con una micropipeta y agregue 1 ml de solución de tetrazolio al 1% (cloruro de trifeniltetrazolio) en agua destilada. Incubar a 40 °C en un termobloque durante 24 h en la oscuridad.
   3. Retire la solución de tetrazolio con una micropipeta y lave las semillas con agua destilada 2 veces o hasta que se retire la solución. Retire todos los líquidos. Si es necesario, las semillas pueden almacenarse en el congelador hasta una semana (como en el paso 10.3) antes de ser analizadas.
   4. Resuspender las semillas en agua destilada y analizarlas bajo un microscopio óptico. Las semillas viables adquieren un color rojo claro a oscuro, mientras que las semillas no viables conservan su color natural.
5. Realizar el siguiente protocolo adaptado⁹ para la germinación simbiótica de semillas de orquídeas.
   1. Incubar las semillas sobre discos de papel de filtro esterilizados en autoclave (1-2 cm de diámetro) colocados en placas de Petri con medio de cultivo de agar avena (OMA) (2,5 g/L de copos de avena y 7 g/L de agar, pH 6).
   2. En el centro de la placa de Petri, inocular un fragmento de medio de cultivo (aprox. 1 cm²) que contenga micelio del hongo aislado elegido para el procedimiento de germinación. Selle las placas de Petri con film transparente e incubarlas en la oscuridad a unos 25 °C o temperatura ambiente, ya que es más adecuado para el crecimiento de hongos.
   3. Preparar algunos platos con semillas y sin inoculación fúngica, como control negativo para la prueba de germinación.
6. Analice los resultados de germinación semanalmente, recopilando datos cuantitativos y cualitativos y fotografiando protocormos y plántulas. La observación de semillas y protocormos debe realizarse utilizando un microscopio estereoscópico para una evaluación más precisa de la germinación. Utilice una fuente de luz que venga de abajo, ya que permite un mayor contraste, lo que permite discriminar el micelio fúngico de los protocormos más fácilmente.
   1. Recoger muestras en diferentes etapas de desarrollo y corregirlas para análisis anatómicos (sección 1). Aplicar todos los análisis de imágenes descritos anteriormente para investigar endófitos fúngicos en semillas, protocormos y plántulas durante la germinación (microscopía óptica - secciones 4, 5 y 6; confocal y fluorescencia - sección 7; SEM y TEM - secciones 8 y 9).
   2. Generar resultados cuantitativos siguiendo la clasificación de etapas según la Tabla 6. Las etapas describen el desarrollo habitual de las semillas de las orquídeas micoheterótrofas. Recopilar datos semanalmente y tabla con las fechas iniciales de cada etapa observada.
   3. Además, recopile datos cuantitativos que estimen el porcentaje y la tasa de germinación. Cuenta al menos 100 semillas o define los campos de conteo³⁵. Demarque tres o más campos de conteo por placa de Petri, que consisten en regiones fijas con un área estandarizada, y evalúe semanalmente. Calcule los datos recopilados de acuerdo con la ecuación del índice de crecimiento (IG):
      
      donde N 0 es el número de semillas contadas en la etapa₀ , N 1 se refiere a la etapa₁ , y sigue hasta la etapa 6 (registrada como N₆)³⁶.

Figura 3: Resumen esquemático de la metodología de germinación simbiótica de semillas. Los esquemas proporcionan indicaciones de pasos detallados en el protocolo. Abreviaturas: OMA = agar avena, PDA = agar dextrosa de patata. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Etapa de germinación	Descripción
0	Sin germinación
1	Hinchazón del embrión
2	Ruptura de Testa
3	Se desarrollan pelos absorbentes
4	Se desarrolla la proyección del vástago
5	Desarrollo de escamas protectoras (brácteas)
6	Se desarrollan las primeras raíces

Tabla 6: Descripción de las etapas de desarrollo del protocormo aplicadas a los análisis periódicos de las pruebas de germinación. Modificado a partir de etapas descritas en Otero et ^al.36.

Representative Results

Siguiendo las etapas esenciales de fijación del tejido vegetal se obtienen estructuras celulares lo más similares posible al estado vivo, considerando la morfología, el volumen y la organización espacial de los componentes y tejidos celulares¹⁶. Observe tales rasgos en las muestras después de la fijación química (Figura 4). La figura 4C-F representa muestras fijadas adecuadamente bajo microscopía óptica. Seguir los procedimientos de fijación descritos y familiarizarse con la estructura de las muestras ayuda a analizar el éxito de la fijación.

Figura 4: Análisis superficial y secciones de raíces filiformes de la orquídea MH Wullschlaegelia aphylla (Sw.) Rchb.f. (A y B) Rizomorfos en superficie radicular filiforme. (C y D) Secciones a mano alzada no teñidas, evidenciando pelotones en células corticales. (E y F) Secciones delgadas teñidas con azul de toluidina O. Abreviaturas: en = endodermis, ep = epidermis, ct = corteza, hy = hifa, pc = célula parenquimatosa, pe = elementos del floema, pl = pelotón, rfl = raíz (filiforme), rm = rizomorfo, vc = cilindro vascular, xe = elemento xilema. Barras de escala: A = 2 mm; B = 500 μm; C y E = 200 μm; D = 100 μm; F = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Obsérvese en la Figura 4C,D la regularidad de las estructuras y la ausencia de áreas dañadas en una sección a mano alzada de una muestra fijada al 10% NBF. El volumen celular se conserva, asemejándose a los tejidos vivos. La comparación con un órgano fresco seccionado a mano alzada también es importante para reconocer muestras bien fijadas. En la Figura 4E,F, las secciones de muestras incrustadas en resina GMA y fijadas al 10% NBF se tiñeron con azul de toluidina O. Nótese las estructuras bien conservadas de las paredes celulares, sin distorsiones ni áreas dañadas, mostrando rasgos muy similares a los de una muestra seccionada a mano alzada (Figura 4C,D).

Al analizar la superficie de los órganos subterráneos, la presencia de rizomorfos indica hifas que colonizan los tejidos internos. Los rizomorfos son estructuras vegetativas compuestas por un agregado de hifas altamente diferenciadas y formadas por unas pocas especies de hongos, principalmente saprótrofos que descomponen la madera^37,38. Los rizomorfos pueden ser fácilmente reconocibles, generalmente como estructuras oscuras similares a cordones³⁷, como se ve en la Figura 4A, B y Figura 7D. La búsqueda de estas estructuras fúngicas facilita la selección de muestras para observar el patrón de colonización fúngica en los órganos de las plantas. En la Figura 4C,D, las secciones se obtuvieron en áreas con rizomorfos superficiales, mientras que en la Figura 4E, se muestra una sección del mismo órgano sin selección de dicho criterio. Las hifas individualizadas también se pueden identificar bajo un microscopio de disección con una observación perceptiva.

Figura 5: Secciones a mano alzada de la estructura de almacenamiento de Uleiorchis sp . (A) Sección bajo un microscopio de disección. (B) Pelotones bajo un microscopio óptico, concentrados en una región de la corteza del órgano. (C y D) Detalles de hifas de los pelotones analizados. Abreviaturas: hy = hifa, pc = célula parenquimatosa, pl = pelotón, s = septos. Barras de escala: A = 2 mm; B = 500 μm; C y D = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Como se explicó anteriormente, se puede preferir la sección a mano alzada en comparación con la sección delgada dependiendo del objetivo. A mano alzada u otros métodos para obtener secciones más gruesas (más de 10 μm de espesor) pueden evidenciar mejor los pelotones y proporcionar imágenes más representativas de los patrones fúngicos de colonización (por ejemplo, Figura 4C, D y Figura 5A, B). Las secciones a mano alzada también pueden ser adecuadas para el análisis de hifas en amplificación más alta, como se demuestra en la Figura 5C, D, aunque los detalles se logran mejor en secciones más delgadas, como en la Figura 7A, a partir de una muestra incrustada en resina GMA. Algunos detalles de las estructuras celulares de las plantas se observan adecuadamente en secciones delgadas, por ejemplo, la Figura 4F. El montaje también es un paso importante, ya que las imágenes de mejor calidad pueden depender del medio de montaje. Las guías de resina GMA se pueden montar en agua o glicerina, aunque un medio de montaje comercial (consulte la Tabla de materiales) mejorará la imagen final, ya que rellena las imperfecciones del proceso de seccionamiento. En la Figura 6C, se pueden ver imperfecciones (puntas de flecha) en una sección de resina GMA, ya que el tobogán se montó con agua.

Figura 6: Secciones de raíces fusiformes de W. aphylla teñidas con solución de Lugol. (A) Sección a mano alzada teñida con azul de toluidina O y Lugol. (B) Teñido sólo con azul de toluidina O. (C) Sección delgada en resina GMA teñida con lactofenol algodón azul y Lugol, puntas de flecha: imperfecciones por irregularidades de la hoja. (D) Sección a mano alzada teñida sólo con Lugol. Abreviaturas: cw = pared celular, pc = célula parenquimatosa, sg = granos de almidón, vc = cilindro vascular. Barras de escala: A = 200 μm; B y C = 100 μm; D = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El principal beneficio del uso de azul de toluidina O (resultados más adecuados en secciones delgadas) son las importantes propiedades metacromáticas de esta tinción, por lo que adquiere diferentes colores dependiendo del componente celular al que se une y funciona como una tinción policromática adecuada para diferenciar diferentes composiciones de paredes celulares²³. En la Figura 4F, las paredes celulares secundarias en los elementos del xilema se pueden identificar fácilmente por el color claro que adquiere la toluidina. Mientras tanto, los elementos del floema, compuestos solo por paredes celulares primarias, se identifican por sus paredes celulares más delgadas y oscuras. Otra tinción importante, principalmente considerando las plantas MH, es la solución Lugol, ya que los granos de almidón se identifican fácilmente cuando se tiñen con ella. Las secciones están representadas en la Figura 6A-D: sección a mano alzada teñida con azul de toluidina O y Lugol en la Figura 6A y solo azul de toluidina O en la Figura 6B; sección delgada en resina GMA teñida con lactofenol algodón azul y Lugol en la Figura 6C; sección a mano alzada teñida solo con Lugol en la Figura 6D.

La incubación de secciones a mano alzada (Figura 7C), resina GMA (Figura 7B) o OCT con conjugado WGA-fluorocromo y blanco de calcofluor puede mejorar las estructuras de la pared celular fúngica y la pared celular de la planta, respectivamente. Es un método importante para confirmar las hifas, ya que el conjugado WGA tiene especificidad a los residuos de N-acetilglucosaminilo, presentes en la pared celular de los hongos. La Figura 7A muestra una sección de tallo floral teñido con azul de toluidina O, mientras que la Figura 7B es del mismo órgano y confirma que las estructuras observadas en la Figura 7A son hifas. Los artefactos por autofluorescencia se pueden ver en secciones de resina GMA (puntas de flecha, Figura 7B). Estos artefactos generalmente están relacionados con la concentración de fluorocromo y se pueden evitar lavando las muestras más veces con el tampón. En la Figura 7C, se muestra una sección a mano alzada de la raíz, con hifas internas y externas. El mismo órgano puede ser visto por SEM en la Figura 7D, con una abundancia de rizomorfos e hifas individuales en su superficie. Las micrografías SEM adecuadas tienen un buen contraste entre los tonos de gris, por lo que la tridimensionalidad se puede ver e interpretar bien. Elija imágenes representativas y evite las engañosas (lectura adicional: consejos para elegir micrografías electrónicas³²).

Figura 7: Secciones del tallo floral y raíces filiformes de W. aphylla y análisis superficial de raíz filiforme por SEM. (A) Sección delgada de tallo floral en resina GMA, teñida con azul de toluidina O. (B) Sección delgada del tallo floral en resina GMA incubada con conjugado WGA-fluorocromo + blanco Calcofluor, puntas de flecha: artefactos por autofluorescencia. (C) Sección a mano alzada de raíz filiforme incubada con conjugado WGA-fluorocromo + blanco de calcofluor. (D) Micrografía electrónica de barrido de la superficie de la raíz filiforme. Abreviaturas: cw = pared celular, hy = hifas, pc = célula parenquimatosa, pl = pelotón, rfl = raíz (filiforme), rm = rizomorfo. Barras de escala: A, C y D = 100 μm; B = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los frutos de diferentes especies de orquídeas se sumergieron en hipoclorito de sodio con cloro activo al 2% durante 15 min, para garantizar la desinfección superficial completa de los órganos (Figura 8A). Las semillas con capas de semillas más rígidas como de Vanilla sp. (Figura 8A) y Pogoniopsis schenckii (Figura 9B-D) se sumergieron en la misma solución durante 10 min (Figura 8C), mientras que las más delgadas, como de Laelia sp. y Cattleya sp., se mantuvieron durante 7 min (Figura 9A). La transferencia de una alícuota de agua del último lavado confirmó la efectividad del proceso de desinfección antes de proceder a las pruebas de germinación, considerando ambas duraciones de inmersión descritas.

Figura 8: Desinfección superficial de frutos y semillas de Vanilla panifolia, una especie de orquídea fotosintética . (A) Inmersión del fruto en hipoclorito de sodio con cloro activo. B) Frutos seccionados longitudinalmente. (C) Semillas filtradas con tejido serigráfico después de la inmersión en hipoclorito de sodio, listas para ser sembradas o almacenadas en gel de sílice. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La siembra de las semillas sobre discos de papel de filtro asegura que haya suficiente humedad y oxígeno para la germinación y el desarrollo embrionario (Figura 9A-D) sin sumergirse completamente bajo la capa de agua superficial del medio de cultivo. Algunos aislados de hongos pueden crecer vigorosamente sobre las semillas. El medio que contiene 2 g/L de copos de avena triturados proporciona un mejor control del crecimiento de hongos, mejorando la visualización y el análisis de las semillas (Figura 9B). Después de aproximadamente 50-60 días de inoculación aislada, el medio debe renovarse, para que el hongo permanezca activo. Esto se puede hacer transfiriendo las semillas a un nuevo medio OMA de la misma formulación. Las semillas pueden ser transferidas con el papel de filtro, facilitando su transferencia sin dañar las delicadas estructuras de los protocormos, además de mantenerlas en la posición original sin comprometer los campos de conteo previamente establecidos.

Figura 9: Protocolo de germinación simbiótica . (A) Semillas dispuestas sobre papel de filtro en medio OMA. (B) Placas de Petri con semillas y un hongo inoculado (potencialmente micorriza), incubadas durante aproximadamente 21 días. (C y D) Placas de germinación simbiótica con diferentes aislados fúngicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La mayoría de las especies de orquídeas germinan dentro de algunas semanas después de haber sido infectadas por el hongo inoculado o hasta casi más de un mes (Figura 10). Las semillas que no germinan dentro de los 3 meses probablemente no germinarán a menos que se ajuste la metodología. En tales casos, considere posibilidades como la latencia de la semilla o el aislado de hongos que no es micorríz. Algunas especies necesitan protocolos específicos para romper la latencia, otras simplemente presentan una alta especificidad a ciertas parejas micorrízicas, diferentes de las elegidas para la prueba de germinación simbiótica (datos no publicados).

Figura 10: Semillas de Pogoniopsis schenckii, una orquídea aclorofílica y MH, en medio OMA con inoculado fúngico³⁹ capaz de estimular la germinación. (A-D) Semillas y protocormos no germinados en diferentes etapas de desarrollo. Abreviaturas: ng = sin germinación, pt = protocormo, ri = tegumento roto, ts = semilla turgente. Barras de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En las primeras semanas después de inocular el aislado, se evalúan los platos, ya que generalmente toma de 7 a 14 días hasta que las hifas logran las semillas. Considere este período, ya que es preponderante comenzar a registrar el desarrollo de los embriones. Los cambios sutiles durante las etapas de germinación solo se pueden detectar bajo un microscopio de disección, considerando que las estructuras son muy diminutas. Algunos protocormos de especies deben analizarse bajo un microscopio óptico para identificar pelos absorbentes y distinguirlos de las hifas. El análisis GI puede proporcionar resultados más plausiblemente comparables, generando una representación de los datos recopilados y confiriendo más peso a los valores correspondientes a etapas de germinación más avanzadas. Los valores finales pueden oscilar entre cero y seis (o según la última etapa definida). Se pueden aplicar diferentes pruebas estadísticas a los análisis GI (por ejemplo, ANOVA, nivel de significación), dependiendo de las preguntas y demandas del investigador al realizar pruebas de germinación simbiótica.

Discussion

Los análisis de imagen en anatomía y morfología vegetal tienen un potencial importante para cumplir objetivos y ayudar a comprender las relaciones entre las plantas micoheterótrofas y sus endófitos fúngicos indispensables, como lo demuestran los estudios de órganos subterráneos^6,40, análisis estructurales de germinación simbiótica de semillas³⁹ y estructuras aéreas y reproductivas ⁴¹ . La botánica estructural, a pesar de haber perdido su prestigio y espacio frente a otras áreas de las ciencias de las plantas en la última década¹, sigue siendo prominente en responder preguntas y ayudar a revelar novedades y rasgos esenciales de las plantas relacionadas con el desarrollo, la ecología, la fisiología y la evolución. Estos métodos son colectivamente una base para los estudios estructurales de las plantas, considerando aspectos importantes del análisis de plantas MH.

Se proporciona información esencial para recolectar cuidadosamente las plantas MH, ya que de lo contrario los órganos subterráneos bien desarrollados pueden dañarse y no recolectarse por completo. Las adaptaciones notables de estas estructuras⁶ y el contacto íntimo con hongos del suelo, conectados a plantas autótrofas⁴² o hojarasca en descomposición⁴⁰ deben considerarse al recolectar y preservar las estructuras subterráneas. Los pasos esenciales de la fijación de la muestra deben seguirse adecuadamente, con respecto a la preparación correcta de los fijadores y los problemas de tiempo, el tiempo mínimo requerido entre la recolección y la fijación, y el tiempo mínimo requerido en el fijador antes de proceder al almacenamiento. El análisis estructural de muestras bien conservadas depende del proceso de fijación, y los fijadores más comunes y mejor conservados aplicados para estudiar la anatomía de las plantas y la microscopía electrónica se describen en la sección de protocolos. También se pueden aplicar otros fijadores^14,16,25.

Como se dijo anteriormente, el proceso de uso de fijadores químicos es decisivo y puede evaluarse al obtener imágenes de muestra. En LM, las estructuras celulares deben ser lo más similares posible en comparación con los tejidos vivos¹⁶. El volumen, la morfología y la disposición espacial de los componentes celulares identificables deben parecerse lo más posible a los tejidos frescos (no fijos). En TEM, los tejidos bien conservados pueden evidenciarse cuando el tonoplasto es visible, con contornos lisos, y no separado del citoplasma¹⁶. La membrana plasmática no se puede separar y encoger de la pared celular. Las muestras para TEM deben recolectarse lo más delgadas posible y dentro de una gota de fijador, como se explica en la sección de protocolo. El uso de tampones asociados a agentes fijadores proporciona condiciones importantes de osmolaridad y composición iónica a las muestras que se fijan, evitando tantos cambios como sea posible en la estructura celular y ultraestructura¹⁶. En SEM, una preocupación importante es con los fijadores isotónicos y su preparación con tampones, por lo que no hay cambios considerables en el volumen de la muestra (hinchazón o contracción)¹⁶.

Muchos métodos de incrustación diferentes para LM están disponibles para obtener secciones para diversos propósitos. Considerando la tinción y la incubación de colorantes fluorescentes, se presentan dos metodologías importantes para analizar los órganos de las plantas MH. Los descritos anteriormente (secciones a mano alzada, resina GMA e incrustación OCT) se encuentran entre los más comunes y simples, proporcionando libertad metodológica e idoneidad para muchos tipos de análisis. El conjugado WGA-fluorocromo tiene un potencial considerable en estudios de plantas MH, ya que actualmente se aplica más a patógenos fúngicos^28,29,30 y apenas se utiliza con plantas MH endófitos fúngicos. Se detallan los pasos básicos y esenciales para la microscopía electrónica de barrido y transmisión, ya que estas técnicas pueden contribuir en gran medida al análisis estructural de las plantas. La literatura SEM y TEM es rica, y se recomienda leer más 32,33,34,43 si se van a probar otros tipos de análisis de microscopía electrónica.

En cuanto a los procedimientos de germinación simbiótica, es posible realizar la asepsia de la fruta antes de la dehiscencia, sin necesidad de desinfectar las semillas directamente. Sin embargo, las semillas de frutos ya abiertos o colonizados por endófitos (ya descritos para las especies MH^39,41) deben desinfectarse directamente. Una observación importante: el tiempo y las condiciones de almacenamiento y los procesos de asepsia pueden reducir la viabilidad de las semillas de algunas especies como se observa al realizar estos experimentos. El reactivo de tetrazolio confiere un color que va de claro a rojo oscuro a embriones de semillas viables. Los embriones de semillas no viables permanecen con su color natural. Las semillas con tegumentos muy pigmentados o capas rígidas de semillas pueden necesitar un tratamiento previo antes de la prueba de germinación. Se recomienda realizar la escarificación de su tegumento, posibilitando la visualización del embrión³⁵.

Algunos posibles aislados de hongos micorrícicos de orquídeas tropicales, por ejemplo, especies de Ceratobasidium , tienen un crecimiento vigoroso y acelerado en un medio de cultivo rico en nutrientes. Durante el tratamiento, es posible que los aislados cubran completamente las semillas cuando crecen, lo que dificulta o incluso imposibilita la recopilación de datos. El protocolo comúnmente utilizado que contiene 4 g/L de copos de avena triturados⁹ impidió la recolección de datos en la germinación simbiótica de P. schenckii, exigiendo una adecuación a 2 g/L de copos de avena triturados³⁹. El uso de aproximadamente 2,5 g/L de copos de avena para componer el medio OMA en la germinación simbiótica parece ser satisfactorio para limitar el crecimiento de aislados fúngicos más vigorosos (datos no publicados).

Las limitaciones pueden surgir de los métodos descritos, algunos de los cuales pueden superarse eficazmente adaptando los procedimientos o aplicando otros métodos. Como se discutió anteriormente, la incrustación GMA solo es efectiva para seccionar hasta 8 μm de espesor. Sin embargo, la incrustación OCT proporciona diferentes secciones de espesor, incluidas las más gruesas (por ejemplo, 10-20 μm). La tinción solo de estructuras de hongos en los tejidos vegetales no se realiza fácilmente, aunque el WGA-fluorocromo es un fluorocromo conjugado importante y efectivo que marca las paredes celulares de los hongos, aunque es costoso. Otras limitaciones de costos pueden surgir en los métodos SEM y TEM, ya que los altos costos y la esencialidad de los equipos hacen que tales análisis no sean triviales y habituales para todos los grupos de investigación. Las pruebas de germinación simbiótica de semillas, aunque simples y menos costosas, exigen hongos micorrícicos para inocular las semillas y procedimientos cuidadosos para evitar contaminaciones.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	179124	(for SEM stubs mounting)
Agar-agar (AA)	Sigma-Aldrich	A1296	(for seeds germination tests)
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909	fluorescent dye (detects cellulose)
Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8	Sigma-Aldrich	C2488	(for toluidine blue O staining)
Conductive Double-Sided Carbon Tape	Fisher Scientific	50-285-81	(for SEM)
Confocal Microscope	Zeiss		(any model)
Copper Grids	Sigma-Aldrich	G4776	(for TEM)
Critical-point dryer	Balzers		(any model)
Cryostat	Leica Biosystems		(any model)
Dissecting microscope	Leica Biosystems		(= stereomicroscope, any model)
Entellan	Sigma-Aldrich	107960	rapid mounting medium for microscopy
Ethyl alcohol, pure (≥99.5%)	Sigma-Aldrich	459836	(= ethanol, for dehydration processes)
Formaldehyde solution, 37%	Sigma-Aldrich	252549	(for NBF solution preparation)
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	histological tissue fixative
Gelatin capsules for TEM	Fisher Scientific	50-248-71	(for resin polymerisation in TEM)
Gelatin solution, 2% in H2O	Sigma-Aldrich	G1393	(dilute for slides preparation - OCT adherence)
Glutaraldehyde solution, 25%	Sigma-Aldrich	G6257	(for Karnovsky’s solution preparation)
HistoResin	Leica Biosystems	14702231731	glycol methacrylate (GMA) embedding kit
Iodine	Sigma-Aldrich	207772	(for Lugol solution preparation)
Lead(II) nitrate	Sigma-Aldrich	228621	Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)
Light Microscope	Olympus		(any model)
LR White acrylic resin	Sigma-Aldrich	L9774	hydrophilic acrylic resin for TEM
Lugol solution	Sigma-Aldrich	62650	(for staining)
Metal stubs for specimen mounts	Rave Scientific		(for SEM, different models)
Microtome	Leica Biosystems		manual rotary microtome or other model
Oatmeal agar (OMA)	Millipore	O3506	(for seeds germination tests)
OCT Compound, Tissue-Tek	Sakura Finetek USA	4583	embedding medium for frozen tissues
Osmium tetroxide	Sigma-Aldrich	201030	OsO4 (for TEM postfixation)
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793	sealing thermoplastic film
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	(for Karnovsky’s solution preparation)
Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O	Sigma-Aldrich	P8920	(for slides preparation - OCT adherence)
Poly-Prep Slides	Sigma-Aldrich	P0425	poly-L-lysine coated glass slides
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177A-3	(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177C-3	(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Potassium iodide	Sigma-Aldrich	221945	(for Lugol solution preparation)
Potato Dextrose Agar (PDA)	Millipore	70139	(for seeds germination tests)
Scanning Electron Microscope	Jeol		(any model)
Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]	Sigma-Aldrich	A3648	(for slides preparation - OCT adherence)
Silane-Prep Slides	Sigma-Aldrich	S4651	glass slides coated with silane
Silica gel orange, granular	Supelco	10087	(for dessicating processes)
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	C0250	(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	NaOH (for Karnovsky’s solution preparation and TEM contrast staining)
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	425044	NaClO (for seeds surface disinfection)
Sodium phosphate dibasic, anhydrous	Sigma-Aldrich	71640	Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638	NaH2PO4·H2O (for NBF and PB)
Sputter coater	Balzers		(any model)
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)
Sudan III	Sigma-Aldrich	S4131	(for staining)
Sudan IV	Sigma-Aldrich	198102	(for staining)
Sudan Black B	Sigma-Aldrich	199664	(for staining)
Syringe			(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)
Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 µm	Millipore	SLGV033R	PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)
Tek Bond Super Glue 793	Tek Bond Saint-Gobain	78072720018	liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260	(for staining)
Transmission Electron Microscope	Jeol		(any model)
Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	T8877	(for the tetrazolium test in seeds germination)
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S1804	Na3(C6H5O7)·2H2O (for TEM contrast staining)
Ultramicrotome	Leica Biosystems		(any model)
Uranyl acetate	Fisher Scientific	18-607-645	UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)
Vacuum pump			(any model)
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	TermoFisher Scientific	W11261	fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)