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Extracción de aminoácidos no proteicos de cianobacterias para cromatografía líquida-análisis de espectrometría de masas en tándem

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DOI:

10.3791/63779

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9 de diciembre de 2022

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1Hyphenated Mass Spectrometry Laboratory (HyMaS), University of Technology Sydney, 2School of Life Sciences, University of Technology Sydney

En este artículo

Resumen

El presente protocolo describe la extracción de aminoácidos no proteicos de matrices biológicas a través de la precipitación de proteínas de ácido tricloroacético (TCA) y la hidrólisis ácida antes del análisis mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem.

Resumen

Los aminoácidos no proteicos (NPAA) son una gran clase de aminoácidos (AA) que no están codificados genéticamente para su traducción en proteínas. El análisis de NPAA puede proporcionar información crucial sobre la absorción y / o función celular, las vías metabólicas y la toxicidad potencial. β-metilamino-L-alanina (BMAA) es un NPAA neurotóxico producido por varias especies de algas y se asocia con un mayor riesgo de enfermedades neurodegenerativas, lo que ha llevado a un interés de investigación significativo. Existen numerosas formas de extraer AA para su análisis, siendo la espectrometría de masas en tándem la cromatografía líquida la más común, que requiere precipitación de proteínas seguida de hidrólisis ácida del pellet de proteína. Los estudios sobre la presencia de BMAA en especies de algas proporcionan resultados contradictorios, con el uso de la preparación/extracción y análisis de muestras no validadas como causa primaria. Como la mayoría de los NPAA, la precipitación de proteínas en TCA acuoso al 10% y la hidrólisis con HCl fumante es la forma más apropiada de extracción para BMAA y sus isómeros aminoetilglicina (AEG) y ácido 2,4-diaminobutírico (2,4-DAB). El presente protocolo describe los pasos en un método validado de extracción NPAA comúnmente utilizado en laboratorios de investigación y enseñanza.

Introducción

Los aminoácidos son compuestos químicos que contienen al menos una amina y un grupo funcional carboxílico. Algunos aminoácidos también contienen un grupo imino, un grupo ácido funcional distinto del carboxílico; Otros aminoácidos tienen grupos amina que no están unidos al grupo α-carbono1. Hay más de 500 aminoácidos2, 22 de los cuales se conocen como aminoácidos proteicos utilizados para la codificación genética en la síntesis de proteínas ribosómicas3. Estos 22 aminoácidos se pueden subdividir en esenciales y no esenciales. Los aminoácidos esenciales son necesarios para que un organismo funcione correctamente y sólo pueden ser adquiridos por fuentes externas. Los aminoácidos no esenciales pueden ser sintetizados dentro del organismo. La clasificación de los 22 aminoácidos en esenciales / no esenciales es única para las especies individuales. Todos los demás aminoácidos son aminoácidos no proteicos (NPAA) que no están codificados para la síntesis de proteínas. Los aminoácidos, ya sean proteicos o no proteicos, también pueden desempeñar un papel de señalización dentro de un organismo y actuar como intermediarios metabólicos4. Debido a sus funciones importantes y variables, los niveles de aminoácidos pueden proporcionar una idea de la condición del organismo, la funcionalidad y las vías metabólicas, etc. Hay dos mecanismos principales por los cuales los aminoácidos pueden incorporarse a una cadena polipeptídica: la síntesis de proteínas ribosómicas, que utiliza los 22 aminoácidos en la codificación, y la síntesis de péptidos no ribosómicos, que, junto con los aminoácidos proteicos, permite el uso de algunos NPAA en la síntesis. Ciertos NPAA pueden imitar aminoácidos proteicos, lo que puede llevar a su incorporación errónea en péptidos y proteínas. La mala incorporación provoca un mal plegamiento de las proteínas, que, a su vez, tiene efectos perjudiciales5, como la mala incorporación de la NPAA L-3,4 dihidroxifenilalanina (L-DOPA) en lugar de tirosina, impactando negativamente la función celular y la salud 6,7. Una fuente adicional de NPAA incorporados es a través de la modificación postraduccional (PTM) de residuos de aminoácidos. Los residuos de aminoácidos se modifican por varias razones, incluidos los cambios en la conformación, estabilidad y funcionalidad de péptidos o proteínas. Tras la hidrólisis de proteínas o péptidos que contienen PTM, estos residuos de aminoácidos modificados se liberan en su forma NPAA libre 8,9.

El NPAA β-metilamino-L-alanina (BMAA) producido por cianobacterias, diatomeas y dinoflagelados 10 es una neurotoxina sospechosa que está implicada como un factor contribuyente a diversas enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica / complejo parkinsonismo-demencia (ALS-PDC)11,12, la esclerosis lateral amiotrófica y la enfermedad de Alzheimer 13 . Se sugiere que BMAA se incorpora erróneamente en la cadena polipeptídica de proteínas en lugar de L-serina14 y / u otros aminoácidos proteicos. La mala incorporación de BMAA puede conducir al mal plegamiento de las proteínas, lo que resulta en la deposición de agregados de proteínas en las neuronas14. En la última década, el interés en BMAA ha aumentado significativamente. Se ha descubierto que una amplia gama de especies de cianobacterias de ambientes de agua dulce, marina y salobre producen BMAA15, lo que lleva a su amplia distribución en varios ecosistemas16,17. Además, se ha demostrado que BMAA se biomagnifica a través de la cadena alimentaria a la red alimentaria humana18,19. Debido a los posibles efectos sobre la salud, la falta de comprensión y las incongruencias de la toxicidad de BMAA, es imperativo continuar la investigación hasta que finalmente se comprenda la toxicidad de BMAA o BMAA se considere segura20,21.

El análisis de aminoácidos en muestras biológicas se puede dividir en cuatro pasos principales: preparación de la muestra, derivatización de aminoácidos, separación y detección, e identificación y cuantificación. La cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) es el método de análisis preferido, ya que proporciona una separación y análisis específicos y reproducibles de aminoácidos.

Las técnicas de preparación de muestras para analizar muestras de cianobacterias y otras algas implican predominantemente un método de extracción de aminoácidos en sus formas libres y unidas a proteínas. A lo largo de los años, los métodos de extracción se han mantenido relativamente consistentes con elementos comunes, incluida la disolución de la muestra para separar los aminoácidos libres de su forma unida, seguida de la precipitación de proteínas y la liberación de los aminoácidos unidos a través de la hidrólisis con ácido clorhídrico (HCl) a temperaturas elevadas22 . Esta forma de extracción ha sido optimizada para aminoácidos proteicos y empleada para NPAAs. Sin embargo, la detección y cuantificación de BMAA y sus isómeros (Figura 1), aminoetilglicina (AEG) y ácido 2,4-diaminobutírico (2,4-DAB), en la misma especie de cianobacterias han mostrado resultados inconsistentes en la literatura, con una posible explicación en las diferencias en las condiciones de crecimiento y/o la cepa de algas que producen cantidades variables o nulas de BMAA23 . Se ha argumentado que una explicación más probable de las inconsistencias en la detección y cuantificación de BMAA y sus isómeros se debe a protocolos experimentales no validados, al uso de una amplia gama de técnicas analíticas y a detalles experimentales insuficientes en los métodos informados16,24 que conducen a datos irreproducibles entre laboratorios. Sin embargo, Glover et al.25 y Banack26 han desarrollado y validado recientemente una técnica analítica para la detección y cuantificación de BMAA y sus isómeros utilizando cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC)-MS/MS de acuerdo con las directrices de la Sociedad Internacional de Químicos Analíticos (AOAC), la Farmacopea de los Estados Unidos y la FDA necesarias para la validación de un solo laboratorio.

Estos experimentos de validación se centraron en la separación y detección de BMAA y sus isómeros y no abordaron las inconsistencias en los protocolos de preparación de muestras. Lage et al.27 compararon el rendimiento de tres métodos de extracción comunes para cuantificar BMAA y sus isómeros en muestras de cianobacterias mediante LC-MS/MS: extracción en fase sólida (SPE) de aminoácidos libres28,29; un método de precipitación de proteínas que implica una extracción de metanol y precipitación de acetona30; y el método de extracción más utilizado para BMAA, la precipitación de proteínas con ácido tricloroacético (TCA)31. Concluyeron que la precipitación de la proteína TCA era el protocolo óptimo, produciendo concentraciones más altas de BMAA en las muestras de prueba en comparación con los otros métodos de extracción. Su estudio validó la extracción de TCA con derivatización de BMAA utilizando 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamato (AQC) en una matriz de cianobacterias, proporcionando una guía establecida para lograr datos de BMAA confiables y reproducibles. La extracción de aminoácidos TCA es una técnica de preparación de muestras aceptada y común que también se puede aplicar a otras matrices. Sin embargo, la estabilidad del aminoácido durante la hidrólisis necesita ser considerada para prevenir la degradación u oxidación, que puede ser superada con el uso de modificadores químicos y agentes reductores32. La extracción de TCA se usa y enseña rutinariamente a los nuevos estudiantes de investigación, y aunque el protocolo se informa ampliamente, una ayuda visual en la aplicación de este método es un recurso valioso, asegurando una ejecución adecuada y consistente.

La cromatografía de fase inversa se usa comúnmente para separar aminoácidos, lo que requiere un paso de derivatización antes de los análisis. La derivatización de aminoácidos como BMAA permite la retención cromatográfica y puede aumentar la resolución entre isómeros. También aumenta la masa molecular y mejora la ionización en el espectrómetro de masas. Se han utilizado varios reactivos derivatizantes para el análisis de aminoácidos a través de LC-MS/MS, incluyendo propilcloroformiato (PCF)33, 6-aminoquinolyl-N-hydrosysuccinimidyl carbamato (AQC)27, 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC)34 y dansyl chloride (DC)35. Sin embargo, las únicas técnicas validadas para analizar BMAA utilizaron PCF 36 o AQC24,26,37 como su reactivo derivatizante.

El alcance de este protocolo se centra en la extracción de TCA de NPAAs de matrices de cianobacterias. Es un método intensivo en mano de obra que se usa y enseña rutinariamente en laboratorios de investigación académicos y de la industria basados en manuscritos que pueden ser cortos en detalles; por lo tanto, este protocolo proporciona detalles del procedimiento y las técnicas involucradas en la preparación de muestras para el análisis de BMAA libre y unido como aminoácido modelo.

Protocolo

Para el presente estudio se utilizó la especie de cianobacteria Merismopedia 38.

1. Preparación de la muestra cruda

  1. Recoger la espuma de algas de la fuente acuática de interés o de un matraz cultivado de cianobacterias y colocarla en el tubo de centrífuga38 de 50 ml.
    NOTA: La muestra debe congelarse a -20 °C para extracciones posteriores y descongelarse antes del siguiente paso.
  2. Centrifugar los tubos que contienen la muestra a 3.500 x g durante 10 min a 25 °C. Decantar el sobrenadante en un contenedor de residuos y desecharlo en residuos biológicos.
    NOTA: El sobrenadante puede reservarse para futuros análisis del exosoma.
  3. Cubra el tubo que contiene el pellet de muestra de forma segura con una película de sellado (consulte la Tabla de materiales) y perfore algunos agujeros en la película con una pinza nasal larga y afilada. Guarde el tubo en posición vertical a -80 °C durante 30 min.
  4. Encienda y equilibre el liofilizador a 0,1 mbar y -80 °C (~30 min).
    NOTA: Los parámetros (paso 1.4) están optimizados para el liofilizador utilizado para el presente estudio (ver Tabla de materiales). Siga los procedimientos operativos estándar de acuerdo con el modelo de liofilizador disponible en el laboratorio o establezca la temperatura más baja posible si el modelo de liofilizador no baja hasta -80 ° C.
    1. Coloque el/los tubo(s) de centrífuga en posición vertical en un recipiente de vidrio para liofilizadores y colóquelo dentro del congelador de -80 °C durante 5 minutos para enfriar el frasco.
    2. Retire el recipiente de vidrio del congelador y coloque la tapa de goma.
    3. Asegúrese de que el mango de la salida de la válvula de goma del liofilizador esté ventilado a la atmósfera (apuntando hacia arriba) y fije firmemente el recipiente de vidrio.
    4. Gire el mango de la salida de la válvula de goma muy lentamente a la posición de apuntar hacia abajo para exponer el frasco al vacío y permitir hasta 24 h de liofilización para garantizar la sublimación de todo el líquido.
    5. Para liberar el vacío en el frasco, gire el mango a la posición apuntando hacia arriba, separe el recipiente de vidrio y retire las muestras liofilizadas.
  5. Utilice una balanza analítica para pesar 15-50 mg de pellets de muestra seca en un tubo de centrífuga de 15 ml.
    NOTA: Las muestras pueden almacenarse a -80 °C si no se procesan más en esta etapa.

2. Lisado celular y fraccionamiento de NPAAs libres

  1. Añadir 100 μL de 100 ng/ml de D5-2,4-DAB (ver Tabla de materiales) estándar utilizando una micropipeta al tubo de muestra (opcional).
  2. Agregue 300-600 μL de tricloroacético acuoso al 10% p/v (TCA, consulte la Tabla de materiales) o 300-600 μL de 11.7% -13.3% TCA, respectivamente, si agrega el estándar D5-2,4-DAB.
    NOTA: Elija un volumen de TCA acuoso que cubra completamente el pellet.
  3. Coloque los tubos de muestra en un recipiente lleno de hielo picado.
  4. Utilice un sonicador de sonda (consulte la Tabla de materiales) a potencia media-alta (70%) y lisar la muestra durante 1 minuto siguiendo los pasos a continuación.
    PRECAUCIÓN: Asegure el EPP adecuado con el uso de orejeras con cancelación de ruido.
    1. Siga los protocolos de seguridad apropiados en preparación para el uso del sonicador de sonda colocando letreros en uso en la puerta, realizando la sonicación en la campana extractora y usando orejeras con cancelación de ruido.
    2. Encienda el sonicador e ingrese los siguientes parámetros: amplitud, 70%; Tiempo, 1 min.
    3. Rocíe etanol al 70% sobre una toallita de papel sin pelusa (consulte la Tabla de materiales) y limpie la sonda.
    4. Sumerja completamente el extremo de la sonda en la muestra y pulse Inicio.
    5. Cuando el sonicador de la sonda se detenga, coloque el tubo de centrífuga que contiene la muestra en hielo durante 1 minuto.
    6. Para asegurarse de que las células están lisadas, repita los pasos 2.4.3-2.4.5 una vez más.
  5. Colocar la muestra en nevera a 4 °C durante 12-24 h para permitir la precipitación de proteínas.
  6. Centrifugar la muestra acuosa de TCA al 10% a 3.500 x g durante 15 min a 8 °C.
  7. Use una micropipeta para transferir el sobrenadante a un tubo de 2 ml etiquetado como "Fracción libre".
  8. Micropipeta 400 μL de TCA acuoso al 10% en el tubo de centrífuga que contiene el pellet de muestra restante y romper el pellet por agitación de vórtice o con la punta de micropipeta.
  9. Repita los pasos 2.6-2.7, transfiriendo el sobrenadante al mismo tubo de "fracción libre" de 2 ml.
  10. Micropipeta 400 μL de 10% TCA/acetona en el tubo de centrífuga con el pellet restante y rompe el pellet con vórtice o la punta de micropipeta.
  11. Centrifugar la muestra de TCA/acetona al 10% a 3.500 x g durante 15 min a 8 °C. Use una micropipeta para transferir el sobrenadante al tubo de 2 ml etiquetado como "Fracción libre".
  12. Coloque el tubo de "fracción libre" con la tapa abierta en un evaporador centrífugo (consulte la Tabla de materiales) hasta que se eliminen todos los líquidos volátiles (al menos 1 h).
  13. Una vez que la muestra esté libre de líquidos volátiles, cubra el tubo de forma segura con una película de sellado y perfore la película con algunos orificios con una pinza nasal larga y afilada. Coloque la muestra en un congelador a -80 °C.
  14. Liofilizar la muestra de "Fracción libre" repitiendo todos los pasos del paso 1.4.
  15. Micropipetear 200 μL de ácido clorhídrico (HCl) de 20 mM en el tubo de "fracción libre" para reconstituir la muestra liofilizada y colocarla en un congelador de −80 °C.
    NOTA: La "fracción libre" de la muestra está lista para la filtración en el paso 4. El pellet restante se procesará en los siguientes pasos para el fraccionamiento de proteínas.

3. Fraccionamiento de los NPAA unidos a proteínas

  1. Use un grabador de vidrio para etiquetar los viales de cubierta de vidrio con los detalles de la muestra para su identificación.
    NOTA: El ácido fuerte puede disipar el etiquetado de tinta; Por lo tanto, se recomienda grabar las etiquetas en vidrio.
  2. Micropipeta 100 μL de 100 ng/ml D5-2,4-DAB patrón sobre el pellet de muestra (opcional).
  3. Micropipetear 400 μL de acetona al 100% sobre el pellet de muestra y romper el pellet utilizando la agitación del vórtice o la punta de micropipeta.
  4. Utilice un conjunto de micropipetas de 1 ml a 1.000 μL para transferir el pellet lavado y resuspendido al vial de la cubierta de vidrio correspondiente.
    NOTA: Se pueden agregar otros 400 μL de acetona al 100% al pellet agitado para ayudar en la transferencia completa del pellet al vial de la cubierta de vidrio. Esto se puede repetir una tercera vez si es necesario.
  5. Centrifugar a 8.000 x g durante 5 min a 25 °C y decantar el líquido en residuos biológicos.
  6. Coloque el pellet restante en un evaporador centrífugo hasta que se elimine todo el líquido y el pellet esté seco (~ 1 h).
  7. Prepare el vial de hidrólisis al vacío añadiendo 1 ml de HCl 6 M en el fondo del vial de hidrólisis.
  8. Use pinzas para insertar cuidadosamente los viales de cubierta etiquetados que contienen las muestras secas en el vial de hidrólisis, asegurando una posición vertical y estable.
    NOTA: Se pueden usar viales de cáscara vacía para ayudar a mantener los viales de muestra en posición vertical si el número de muestras es menor que la capacidad del vial de hidrólisis.
  9. Fije la tapa al vial de hidrólisis y empuje la perilla roja de la tapa para cerrar la válvula.
  10. Encienda la bomba de vacío, conecte el tubo de vacío a la cabeza de la tapa del vial de hidrólisis y presione la perilla verde de la tapa para abrir la válvula.
  11. Deje que la bomba de vacío (ver Tabla de materiales) elimine el aire del vial durante 1 minuto.
  12. Cierre el vial presionando la perilla roja de la tapa del vial de hidrólisis, apague la bomba de vacío y retire el tubo de vacío.
  13. Conecte un tubo de goma al grifo de gas nitrógeno en el banco de laboratorio y abra ligeramente el grifo. Coloque el pulgar en el extremo del tubo, séllelo y cuente hasta que el gas comience a escapar a medida que aumenta la presión. Este será el plazo para el siguiente paso. Ajuste el flujo de gas a un marco de tiempo adecuado.
  14. Fije el otro extremo del tubo de goma a la cabeza de la tapa del vial de hidrólisis y, a continuación, empuje inmediatamente la perilla verde de la tapa. Cuente hasta el tiempo determinado en el paso 3.13 y empuje rápidamente la perilla roja de la tapa y retire el tubo de goma.
  15. Repita los pasos 3.10-3.14 dos veces para asegurarse de que el vial de hidrólisis de vidrio esté libre de aire y lleno de gas nitrógeno.
  16. Colocar el vial de hidrólisis en un horno precalentado a 110 °C durante 16-18 h.
  17. Use guantes de horno para extraer el vial de hidrólisis de vidrio del horno y deje que se enfríe dentro de la campana extractora durante 10 minutos. Dentro de la campana extractora, mientras la mira hacia usted, empuje la perilla verde para liberar presión y gas.
  18. Use pinzas para retirar los viales de la cáscara del vial de hidrólisis.
  19. Reconstituir los pellets de muestra hidrolizados mediante micropipeteo de 200 μL de HCl de 20 mM en el vial de la cubierta. Asegúrese de que el pellet se vuelva a suspender mediante vórtice o utilizando una punta de pipeta.
  20. Centrifugar los viales de cubierta que contienen los gránulos de muestra reconstituidos durante 2 min a 5.300 x g y 25 °C.

4. Filtrado de muestras

  1. Etiquete los tubos filtrantes de 2 ml (consulte la Tabla de materiales) que contengan filtros de membrana de poro de 0,2 μm como "Fracción libre" y "Fracción de proteína".
  2. Transfiera las muestras reconstituidas de la etapa 2.15 (fracción libre) y la etapa 3.20 (fracción proteica) a los tubos filtrantes correspondientes.
  3. Colóquelos en la centrífuga durante 30 min a 5.000 x g y 25 °C.
  4. Retire los filtros de los tubos filtrantes y tapelos. Las muestras ahora están listas para la derivatización de aminoácidos en el paso 5.
    NOTA: Las muestras se pueden colocar en el congelador de -80 °C para su almacenamiento para su posterior derivatización y análisis.

5. Derivatización de aminoácidos

  1. Derivatizar las muestras usando propilcloroformiato (PCF)39 o 6-aminoquinolyl-N-hydrosysuccinimidyl carbamato (AQC)40 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales).

Resultados

En la Figura 2 se proporciona una ilustración del protocolo de extracción como una guía de referencia resumida. Los resultados obtenidos por Violi et al.38 fueron elegidos para representar un resultado positivo de este protocolo de extracción para el análisis de isómeros BMAA de cianobacterias. Diecinueve especies individuales de cianobacterias fueron cultivadas en 11 sitios de agua dulce del este de Australia. Usando el mismo protocolo, los isómeros BMAA se extrajeron en fracciones libres y proteicas, se derivaron con PCF y se analizaron usando LC-MS / MS. Diecisiete de los aislados de cianobacterias fueron positivos para BMAA, y los 19 contenían el isómero 2,4-DAB. Un resultado positivo se confirma utilizando un método LC-MS/MS validado y observando al menos tres transiciones de monitoreo de reacciones múltiples (MRM), una como ion cuantificador y dos como iones calificadores en el tiempo de retención esperado. En la Figura 3 se muestra un cromatograma MRM representativo de un patrón que contiene BMAA y sus isómeros, indicado por las líneas codificadas por colores. La presencia y concentración de BMAA e isómeros en las 19 muestras, seccionadas para mostrar la concentración de BMAA e isómeros en las fracciones libres y unidas, se resume en la Tabla 1. Se observó una detección positiva para los tres isómeros en la fracción libre de las especies de Merismopedia recolectadas en el lago Liddell (NSW, Australia), donde la fracción libre contenía una concentración de BMAA de 68,38 μg/g en peso seco (DW) ± 2,25 μg/g DW, 2,4-DAB con una concentración de 1.223,98 μg/g DW ± 20,7 μg/g DW, y AEG con una concentración de 125,27 μg/g DW ± 4,19 μg/g DW. Los MRM cromatográficos se muestran en la Figura 4. Para ilustrar un resultado negativo para BMAA y sus isómeros en una muestra, la fracción unida de las especies Microcystis flos-aquae recolectadas de Walka Water Works (NSW, Australia) se presenta cromatográficamente en la Figura 5. Mientras que la fracción unida no contenía BMAA, 2,4-DAB y/o AEG, su fracción libre contenía los tres isómeros, con concentraciones de 79,86 μg/g DW ± 1,59 μg/g DW, 1.156,15 μg/g DW ± 8,46 μg/g DW y 433,83 μg/g DW ± 8,92 μg/g DW, respectivamente.

Así, mediante el uso de este protocolo, Violi et al.38 confirmaron la presencia de isómeros BMAA en cianobacterias de agua dulce del este de Australia y determinaron qué cianobacterias tenían capacidades productoras de toxinas.

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Figura 1: La estructura química de BMAA y sus isómeros 2,4-DAB y AEG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Diagrama de referencia resumido del protocolo de extracción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Cromatograma LC-MS/MS de un patrón de calibración que contiene D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA y AEG para la identificación de isómeros basada en la retención, indicada por los picos resaltados. Clave: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z a 6,4 min (rojo), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z a 6,4 min (verde), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z a 7,4 min (naranja) y BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z a 7,8 min (azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Cromatograma LC-MS/MS para detectar D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA y AEG en especies de Merismopedia recolectadas en el lago Liddell (NSW, Australia), indicadas por los picos resaltados. Clave: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z a 6,4 min (rojo), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z a 6,4 min (verde), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z a 7,4 min (naranja) y BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z a 7,8 min (azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Cromatograma LC-MS/MS de un control negativo para 2,4-DAB, BMAA y AEG en una fracción unida de especies de Microcystis flos-aquae recolectadas de Walka Water Works (NSW, Australia). Clave: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z a 6,4 min (rojo - pico resaltado), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z a 6,4 min (verde), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z a 7,4 min (naranja) y BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z a 7,8 min (azul). Las líneas discontinuas representan los tiempos de retención para 2,4-DAB, AEG y BMAA faltantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Concentraciones de BMAA, AEG y 2,4-DAB en aislados de cianobacterias. Las concentraciones ± error estándar de la media (n = 3). ND denota no detectado. La concentración más alta de cada isómero detectado se resalta en verde. El cuadro es una versión modificada de Violi et al.38. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

El protocolo de extracción descrito aquí para el análisis de NPAA se aplica al análisis de cualquier aminoácido en muestras biológicas. Para las guías de aislamiento y cultivo de cepas de cianobacterias, se pueden consultar los métodos presentados en el estudio de Violi et al.38. El primer paso en el protocolo lleva la muestra a un punto en el que se puede lograr la normalización entre muestras contra el peso seco. El segundo paso es la lisis celular para liberar los analitos y se puede realizar utilizando una variedad de técnicas, incluidas interrupciones / lisis mecánicas como la sonicación de la sonda como se describe en este protocolo, ciclos de congelación / descongelación, molienda y molienda de perlas, e interrupciones no mecánicas como enzimática, detergente y / o lisis química. Se sabe que la interrupción mecánica es ventajosa sobre la no mecánica, ya que permite una mayor capacidad de la muestra para lisarse, al tiempo que permite que los enlaces intracelulares y las proteínas permanezcan intactos41, aunque la matriz de la muestra puede dictar el método óptimo para la lisis celular.

La precipitación de proteínas es el tercer paso crítico de este protocolo cuando se extraen aminoácidos para su análisis. El TCA es el disolvente más utilizado; sin embargo, también se han utilizado ácido perclórico, acetona, metil terc-butil éter (MTBE), metanol y/o acetonitrilo 8,42, donde cada disolvente de extracción está destinado a extraer y precipitar diferentes sustratos. El modelo descrito aquí extrae el NPAA BMAA y sus isómeros de una matriz cianobacteriana, y aunque se ha utilizado una gama de disolventes diferentes, los dos más comunes son 10% TCA en agua (acuosa) y 10% TCA en acetona. En general, la precipitación de proteínas con TCA se usa comúnmente para extraer aminoácidos para fraccionar aminoácidos libres de los aminoácidos unidos a proteínas. Además, la extracción de TCA permite determinar el contenido total de proteínas, reducir los contaminantes para la fracción libre y reducir la actividad de las proteasas con una degradación mínima de proteínas43. La extracción con TCA de la fracción libre funciona enjuagando inicialmente las sustancias solubles orgánicas, dejando atrás proteínas y compuestos insolubles como los restos de la pared celular en el precipitado, que luego es seguido por la extracción por hidrólisis térmica de los aminoácidos unidos a proteínas (fracción unida) utilizando un ácido fuerte.

El fraccionamiento de la fracción libre con 10% de TCA acuoso más sonicación produce la precipitación proteica más extensa en comparación con otros disolventes orgánicos44 y las mejores recuperaciones de aminoácidos42. Algunos estudios optan por usar un ácido combinado con un solvente orgánico (es decir, 10% -20% de TCA en acetona 43) para precipitar más moléculas, incluyendo péptidos / biomoléculas más pequeños, minimizar la degradación de proteínas y reducir contaminantes como las sales43. Otra ventaja del 10% de TCA en acetona es su velocidad de secado más rápida en la preparación del pellet para hidrólisis, minimizando el residuo de humedad para evitar la modificación de aminoácidos. Sin embargo, el 10% de TCA acuoso más sonicación tiene mejores eficiencias de extracción de aminoácidos libres en comparación con el 10% de TCA en acetona44 solo. Además, la precipitación acuosa de TCA al 10% tiene limitaciones como un largo tiempo de secado, no poder precipitar todas las proteínas o péptidos/biomoléculas pequeños, y dependiendo del analito de interés (es decir, proteínas o aminoácidos), requerir aditivos y agentes reductores para prevenir la oxidación y degradación45,46.

Este protocolo utiliza una combinación de 10% de TCA acuoso y 10% de TCA en acetona para aumentar la precipitación de proteínas, garantizar que se precipiten péptidos / biomoléculas más pequeños, permitir tiempos de secado de pellets más rápidos y aumentar la eficiencia de extracción, aprovechando ambas propiedades de extracción con solvente. Sin embargo, la combinación de 10% de TCA acuoso y 10% de TCA en acetona puede precipitar pequeños péptidos/biomoléculas en la fracción libre después de que el 10% de TCA en sobrenadante de acetona se combine con la fracción libre acuosa. En este caso, los precipitados deben transferirse a la fracción unida para la hidrólisis.

La segunda mitad de este protocolo implica la liberación de aminoácidos (es decir, BMAA) del pellet de proteína a través de la hidrólisis ácido-vapor a temperaturas elevadas en un ambiente libre de oxígeno. El factor predominantemente limitante para el paso de hidrólisis es que requiere mucho tiempo y es laborioso prepararlo. La incubación nocturna impide una preparación y análisis de muestras rápidos y eficientes en el tiempo. Además, la transferencia cuantitativa del pellet de un tubo de centrífuga a un vial de carcasa (paso 3.4) es un proceso arduo que requiere diligencia y paciencia para garantizar un punto preciso de normalización al peso seco. Los posibles problemas que el usuario puede enfrentar son la transferencia incompleta del pellet, las proteínas precipitadas húmedas que se adhieren a las puntas de la pipeta y al tubo original, y las partículas sólidas del pellet que bloquean la punta de la pipeta. Una sugerencia práctica para facilitar la transferencia del pellet es quitar aproximadamente 0.3-0.5 mm del extremo de la punta de la pipeta con un par de tijeras, lo que permite extraer partículas de pellets más grandes y liberarlas en el vial de la cáscara. Este método de transferencia es una práctica común para la extracción de proteínas para todos los análisis de aminoácidos. Sin embargo, se deben investigar modificaciones para mejorar la eficiencia y precisión de la transferencia cuantitativa del pellet al vial de la cáscara.

Se pueden emplear dos formas de técnicas de hidrólisis para liberar aminoácidos de su estado unido a proteínas: hidrólisis en fase líquida e hidrólisis ácido-vapor. La hidrólisis en fase líquida, que implica la adición de HCl 6 M a la muestra, que luego se coloca en un horno a 110 °C durante la noche, es una alternativa a la hidrólisis ácido-vapor descrita en este protocolo. Las técnicas de extracción que emplean hidrólisis en fase líquida pueden requerir un procesamiento adicional, como la desalinización, especialmente si se elige la derivatización AQC, ya que requiere condiciones básicas para el marcado40. La hidrólisis ácido-vapor evita la desalinización y permite al usuario la libertad de elegir la técnica de derivatización tras la reconstitución del pellet final antes de la filtración. Además, independientemente del método de hidrólisis elegido, las muestras pueden requerir un procesamiento adicional, como SPE para purificación de matriz y concentración 29,47,48, dependiendo de la elección de la técnica de derivatización y / o análisis analítico (por ejemplo, fase inversa LC-MS / MS vs. cromatografía líquida de interacción hidrófila [HILIC] LC-MS / MS 37 ). La reconstitución del pellet final en 20 mM HCl en este protocolo es apropiada para la derivatización utilizando reactivos PCF48a través de un kit de hidrólisis de aminoácidos disponible comercialmente39 (ver Tabla de materiales). Tanto AQC como PCF derivarán todos los aminoácidos, proteínas y no proteínas de origen presentes en la muestra, y la selectividad de los analitos se obtiene mediante el uso de LC-MS/MS y su combinación de coincidencia de tiempo de retención y selección cuidadosa del cuantificador y calificador MRMs38. 

Los protocolos actuales de hidrólisis no están optimizados para la liberación de BMAA, 2,4-DAB y AEG, sino para los 22 aminoácidos proteicos basados en los métodos existentes para la hidrólisis de proteínas 32, donde la incubación por más de 18 h resulta en la degradación y modificación de ciertos aminoácidos, afectando el análisis LC-MS/MS y, por lo tanto, las concentraciones obtenidas32. Beach et al.49 investigaron la hidrólisis a lo largo del tiempo (0,5-120 h) para optimizar la hidrólisis para analizar BMAA y los aminoácidos proteinogénicos. Encontraron que aunque hubo una liberación rápida temprana de BMAA durante las primeras 0,5 h de la hidrólisis, los niveles de BMAA continuaron aumentando a medida que aumentaba el tiempo de hidrólisis, sin degradación, incluso después de 5 días49. También hay diferentes puntos de vista y preguntas sobre la verdadera naturaleza de BMAA unido y sus isómeros, con algunos estudios que sugieren que en lugar de BMAA enlazar 50,51 o incorporarse erróneamente a las proteínas14, la asociación BMAA-proteína es superficial52. Sin embargo, el consenso actual en el análisis de BMAA "unido" requiere el paso de hidrólisis validado y ampliamente aceptado que rompe los péptidos / proteínas para liberar aminoácidos y, por lo tanto, BMAA y sus isómeros.

Las tasas de recuperación de 20 aminoácidos proteicos se determinaron en un estudio realizado por Sedgwick et al.42 utilizando la extracción de TCA, resultando en aproximadamente un 100% de recuperación. En el caso de BMAA y sus isómeros de matrices de algas, los estudios que comparan la eficiencia de la extracción de BMAA utilizando varios disolventes de extracción han encontrado que el 10% de TCA es el más eficiente para BMAAlibre 27. Las tasas de recuperación para el BMAA unido a proteínas extraído mediante hidrólisis en fase líquida se establecieron en estudios de Glover et al.25 y de Faassen et al.53, donde la precisión se determinó mediante métodos de recuperación con picos, con una tasa media de recuperación de BMAA de 108,6% y 70%, respectivamente. Faassen et al. describieron procedimientos para experimentos de recuperación de picos e ilustraron cómo la recuperación difiere dependiendo de la etapa del proceso de extracción del pico que se realizó53. Faassen et al. determinaron adicionalmente la eficiencia del protocolo ácido-vapor presentado aquí, con tasas de recuperación de 83,6% para los isómeros BMAA aumentados antes de la extracción y 68,6% para los que se dispararon antes de la hidrólisis24. Estas recuperaciones, métodos de extracción y análisis fueron validados por Banack 26, con tasas de recuperación del 94%-106% para BMAA en una matriz de cianobacterias y una %Desviación Estándar Relativa (%RSD) entre 5.6% y20%, cumpliendo con los criterios de precisión de la FDA54. Se recomienda que cada laboratorio establezca inicialmente sus tasas de recuperación y precisión antes de utilizar este protocolo a través de experimentos de recuperación de picos. Los métodos de recuperación presentados en Faassen et al.53 y Glover et al.25 pueden seguirse como guía.

Se pueden utilizar formas alternativas de técnicas de hidrólisis en lugar de la hidrólisis de horno durante la noche para una extracción más rápida del analito unida a proteínas. Por ejemplo, un extractor de microondas podría reducir significativamente el tiempo de hidrólisis de 24 h a tan solo 10 min55. La hidrólisis por microondas para aminoácidos utiliza los mismos principios que el método térmico convencional, utilizando una guantera para preparar y ensamblar el recipiente de microondas en un ambiente libre de oxígeno y agregando HCl 6 M. Una vez hermético, el recipiente que contiene la muestra sufre radiación de microondas. La hidrólisis por microondas se ha utilizado para extraer aminoácidos de diversas matrices de muestra56,57,58; sin embargo, la hidrólisis por microondas aún no se ha desarrollado y validado para el análisis de BMAA.

En conclusión, la precipitación acuosa de proteína TCA al 10% es el método óptimo para extraer aminoácidos no proteicos libres de matrices cianobacterianas27, y la hidrólisis térmica proporciona una extracción confiable y reproducible de la fracción unida a proteínas. Este protocolo para extraer el NPAA BMAA y sus isómeros de cianobacterias está validado y ampliamente aceptado. Las direcciones futuras para optimizar aún más la extracción de BMAA se centrarán en el paso de hidrólisis, que se realiza de acuerdo con las especificaciones de los 22 aminoácidos proteicos. Sin embargo, el protocolo de extracción presentado aquí aún debe considerarse eficiente y efectivo para analizar BMAA y sus isómeros a través de LC-MS / MS.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

D.P.B., K.J.R. y S.M.M. cuentan con el apoyo de la Fundación Ian Potter, y J.P.V. recibe un Programa de Capacitación en Investigación del Gobierno de Australia, Stipend.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Viales de 1 ml de cáscara de vidrioSHIMADZUREST-24663
TCA al 10%diluido (p/v) a 10% de TCA acuoso;
TCA al 100%Disuelva el TCA en agua de acuerdo con la siguiente proporción 2,2 g:1 mL (TCA:H2O)
1000 µ Micropipeta LEpendorf/Sigma-AldrichZ683809
TCA al 13,3 %Diluir al 100 % (p/v) a 13,3 % de TCA acuoso;
Tubos de 2 mLMERCKBR780546-500EA
20 mM HClChem-Supply Pty Ltd7647-01-0Fabricado en stock
20-200 µ Micropipeta LEpendorf/Sigma-AldrichZ740441
6 M HClChem-Supply Pty Ltd7647-01-0Fabricado en stock
70% etanolSupelco1.11727Diluido 70:1 Etanol:
agua-80 ° C CongeladorMartin CHRIST 102142Alpha 2-4 Ldplus
AccQ-Tag Ultra Kit de derivatización Waters186003836
AcetonaChem-Supply Pty Ltd34967-2.5L
Escala analítica Equilibrador
Evaporador centrífugoThermo Scientific13442549DNA120-115 SpeedVac
Centrífugaconcentradora MERCKEP022620100-1EA
D5-2,4-DABIsótopos CDND-7568
Horno
Ez:faastTM Kit de análisis de aminoácidosPhenomenexCEO-8492
Soporte
Falcon Tubos FalconMERCKT2318-500EATubos de centrífuga Greiner
Tubos de filtroSigma-AldrichCLS8161-100EA Filtros detubo de centrífuga Corning Costar Spin-X (tamaño de poro 0,22 μ m)
Grabador de
Frasco de hidrólisis & TapaEldex Laboratories/WatersWAT007568 &
Hielo y contenedor
Toallita de papel sin pelusaKimwipes/Sigma-AldrichZ188956
Milli-Q water18.2 MΩ. cm
Grifo de nitrógeno con manguera
Micropipeta P1000 MERCKEP3123000063
P1000 Puntas de pipetaMERCKZ740127
P200 MicropipetaMERCKEP3123000055-1EA
P200 Puntas de pipetaMERCK
ParafilmMERCKP7793Película de sellado
EPI - auriculares
EPI - guantes
Sonda sonicadorQSONICA SonicatorsQ125 SonicatorAsegúrese de que todos los EPI adecuados (es decir, auriculares con cancelación de ruido)
Espátula de transferencia de muestras Ácido
tricloroacético (TCA)Sigma-AldrichT6399-1KG
Pinzas
Bomba de vacío con manguera
Solución deSolución de solución de estándar de secadode tubovidrioWAT007569 Z740125 con cancelación de ruidode horno

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