Summary
ここでは、網膜静脈閉塞(RVO)の研究におけるフルオレセイン血管造影(FA)および光干渉断層撮影(OCT)画像の3つのデータ解析プロトコルを紹介します。
Abstract
眼科イメージングツールの進歩は、神経血管損傷の動物モデルを扱う研究者に前例のないレベルのアクセスを提供します。この優れた翻訳可能性を適切に活用するためには、これらの画像から定量的なデータを引き出す再現性のある方法を考案する必要があります。光干渉断層撮影(OCT)イメージングは、マイクロメートルの分解能で網膜組織像を解決し、血管血流の機能的差異を明らかにすることができます。ここでは、網膜静脈閉塞(RVO)の最適化されたマウスモデルにおける血管傷害後の病理学的損傷を特徴付けるために使用する非侵襲的血管読み出しについて説明します。これらの読み出しには、網膜形態のライブイメージング分析、毛細血管虚血の網膜内層の混乱(DRIL)測定、および網膜浮腫と血管密度のフルオレセイン血管造影測定が含まれます。これらの技術は、診療所で網膜疾患の患者を検査するために使用される技術に直接対応しています。これらの方法を標準化することで、動物モデルと眼科疾患の臨床表現型との直接かつ再現性のある比較が可能になり、血管損傷モデルの翻訳力が向上します。
Introduction
神経血管疾患は、死亡率と罹患率の主な原因である虚血性脳卒中、および視力喪失につながる網膜血管疾患の原因となる主要な医療問題です1,2。神経血管疾患をモデル化するために、網膜静脈閉塞(RVO)のマウスモデルを採用しています。このモデルは非侵襲的であり、臨床現場で網膜血管疾患のある人を検査するために使用されるものと同様のin vivoイメージング技術を利用しています。したがって、このモデルを使用すると、このモデルを利用した研究の翻訳の可能性が高まります。すべてのマウスモデルと同様に、モデルの再現性を最大化することが重要です。
網膜血管疾患は、70歳未満の人々の視力喪失の主な原因です。RVOは、糖尿病性網膜症に次いで2番目に多い網膜血管疾患です3。RVOに特徴的な臨床的特徴には、虚血性損傷、網膜浮腫、およびニューロン喪失の結果としての視力喪失が含まれる3,4。主要血管のレーザー光凝固を用いたRVOのマウスモデルが開発され、ヒトRVO 5,6,7で観察される主要な臨床病理を再現するために改良されています。眼科イメージングの進歩により、ヒトで使用される非侵襲的診断ツール、すなわちフルオレセイン血管造影(FA)および光干渉断層撮影(OCT)の複製も可能になりました6。フルオレセイン血管造影は、小さな蛍光色素であるフルオレセインの注射を使用して、血液網膜関門(BRB)の破壊による漏出、および閉塞部位を含む網膜の血流動態の観察を可能にします8,9。OCTイメージングは、網膜の高解像度断面画像の取得および網膜層の厚さおよび組織の研究を可能にする10。FA画像の分析は歴史的に主に定性的であり、研究間の直接的で再現性のある比較の可能性を制限しています。最近、OCTイメージングにおける層の厚さを定量化するための多くの方法が開発されましたが、現在標準化された分析プロトコルはなく、OCT画像取得のサイトはさまざまです11。これらのツールを適切に活用するためには、標準化された定量的で複製可能なデータ分析方法論が必要です。本論文では、RVO-フルオレセイン漏出、OCT層の厚さ、および網膜層の混乱のマウスモデルにおける病理学的損傷を評価するために使用される3つの血管読み出しを紹介します。
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Protocol
このプロトコルは、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚眼科研究協会(ARVO)の声明に従います。げっ歯類の実験は、コロンビア大学の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認および監視されました。
注:イメージングは、体重約23gの生後2か月のC57BL / 6J雄マウスで行われました。
1. 網膜イメージング用試薬の調製
- 注射可能なフルオレセイン溶液の調製。
注:フルオレセインは非常に光に敏感です。光から保護し、準備後すぐに使用してください。- フルオレセインを滅菌生理食塩水中で1%の濃度に希釈する。
- ケタミン/キシラジンの調製
- ケタミンとキシラジンを滅菌生理食塩水で次の濃度に希釈します:ケタミン(80-100 mg / kg)とキシラジン(5-10 mg / kg)。.
- 滅菌生理食塩水
- 滅菌生理食塩水を入れた26 G針で5 mLシリンジを準備します。
2. OCTおよびフルオレセインイメージング
- 網膜イメージング顕微鏡のライトボックス、OCTマシン、および加熱されたマウスプラットフォームの電源を入れます。
- コンピュータの電源を入れ、イメージングプログラムを開きます。
- 各目にフェニレフリンとトロピカミドを1滴加えます。
- 150μLの麻酔(ケタミン(80-100 mg / kg)とキシラジン(5-10 mg / kg))を腹腔内(IP)に注射します。.つま先をつまんで麻酔の深さを決定し、動物が反応しなくなるまで待ちます。眼科用軟膏または人工涙液を両眼に塗ります。
- プラットフォームにマウスを合わせます。
- 網膜眼底の視界が明確で焦点が合うまで、プラットフォームの高さと角度を調整します。眼底の写真を撮ります。
- イメージングおよび OCT ソフトウェアを開きます。OCT プログラムで、微調整を 5 に調整します。
- 火傷から75μm離れた場所でOCT画像を撮影します。網膜の他の3つの象限についても繰り返します。
- 100 μLの1%フルオレセインIPを注入します。
- カメラを488nmフィルターに切り替えます。カメラゲインを5に増やします。
- フルオレセイン注射のちょうど5分後に眼底の写真を撮ります。
注意: フルオレセインは網膜の光損傷を悪化させる可能性があるため、最大設定でカメラの光に目を長時間さらさないでください。5分の待機時間が経過し、マウスがイメージングの準備ができるまで、光源をオフのままにします。
3.アフターケア
- 1 mLの滅菌生理食塩水IPを注入します。潤滑剤点眼薬を両眼に塗ります。眼科用軟膏または人工涙液を両眼に塗ります。
- 麻酔から回復するマウスを観察します。完全に回復したとき、通常は約40分後にのみ、他の動物と一緒にケージに戻ります。
4.除外基準の評価
- 処置後24時間で撮影した眼底画像を開き、除外基準を評価します。次の基準のいずれかが特定されている場合は、目を除外します。
- 画像のオクルージョンがゼロかどうかを評価する
- 閉塞した血管の数について画像を評価します。
注:閉塞が成功すると、通常、火傷の上または周囲に紫色の色素沈着、火傷を通る非常に薄いまたは不連続な血管、火傷領域の外側のかすかなまたは存在しない血管の外観、および低酸素症による網膜の変色があります。レーザーによる白い火傷を通して血管全体が見える場合、容器は閉塞に失敗しました。血管が部分的に塞がれているように見えることもありますが、火傷の外で途切れていないように見える場合は、血管が閉塞していない可能性があります。 - あいまいな場合は、FAイメージングを同時に使用してオクルージョンを評価します。これらの画像では、オクルージョンは血管の連続性の切れ目として表示され、多くの場合、周囲の血管が先細りになっています。
- オクルージョンがゼロの場合は、RVOが無効と見なされるため、分析から目を除外します。
注:オクルージョンは通常、RVOの48〜72時間後に解決され、オクルージョンの存在はこれらの時点で除外基準として使用しないでください。
- 閉塞した血管の数について画像を評価します。
- 眼底とOCTの画像を評価して、網膜剥離が過剰になるかどうかを調べます
注:網膜下液の蓄積はRVOの誘導後に一般的であり、RPEからの神経網膜の分離を引き起こします。過度の網膜剥離の除外基準は次のように定義されます:OCTは完全に表示できないか、一部のレイヤーが非常に歪んで表示されます。画質が悪く、外側の網状およびRPE層の解像度が低下します。神経網膜と脈絡膜の間の分離は、OCT視野が許容するものよりも大きい。眼底画像では、網膜のトーンはほぼ完全に白くなり、紫色のしみがあります。網膜の一部が歪んで焦点が合っていないように見えることがあります。これは、網膜が剥離しており、網膜の他の部分とは異なる焦点距離にあるためです。- 眼からの画像の評価が網膜の末梢または完全な剥離を決定する場合は、分析から眼を除外します。
- 角膜白内障の証拠がある画像を除外する
注:角膜白内障は、マウスの角膜に不透明な白い点として表示されます。白内障は通常、動物が麻酔をかけられている間の目の潤滑が不十分なために発生し、目の軟膏をたっぷりと塗るように注意することで大幅に回避できます。白内障は、一般に、動物を検査することによって画像化する前に識別することができる。白内障を発症したマウスは、イメージングプロセスを経ることなくデータセットから除外する必要があります。イメージングでは、白内障はカメラから網膜を覆い隠し、OCTは歪んで見えます。 - 過度の出血がないか画像を評価する
注:過度の出血は、画像内の赤い液体の量として識別でき、通常は網膜の背景、血管、および火傷を覆い隠します。赤い液体のこれらの領域は、成功したRVOで通常の紫色の斑点よりも明るく不透明な赤になります。出血はOCTイメージングで神経節細胞層に現れ、出血の下の他の網膜層を視覚化する能力を妨げます。- 画像に過度の出血があると判断された場合は、分析から目を除外します。
5. フルオレセイン画像処理
- フルオレセイン画像を画像処理ソフトウェアで開きます。
- 画像を複製する
- 選択ツールを使用して、主要な血管を注意深くトレースします。
- 主な血管は、視神経乳頭から放射状に広がる太い静脈と動脈です。これらの船舶から分岐している船舶は無視してください。
- 漏れによって血管の輪郭が閉塞部位の近くに見られない場合は、血管のおおよその位置で漏れを追跡します(厚さを維持し、最後に見える点を次の可視点に接続します)。
- 最初の画像では、背景のみを残して選択範囲を削除します。このマスクされた画像を保存します。
- 選択範囲を2番目の画像に移動し、選択範囲を反転して削除し、血管を分離します。このマスクされた画像を保存します。
- ImageJ で 2 つの画像を開きます。背景画像を開き、積分密度を測定します。
- 船舶の画像を開き、船舶の輪郭を選択して、平均強度を測定します。
- 背景の積分密度を血管の平均強度で割り、眼の漏れ率を生成します。
- 実験コホートの各眼のこの漏れ率を記録します。
- バックグラウンドをさらに制御するには、実験眼を無傷の対照眼の平均漏出率に正規化します。
注:FA画像中のフルオレセイン漏れの標準化された定量化を作成するために、この計算では、バックグラウンド密度(漏れが存在する場所)と主要な血管の明るさの比率を使用して、画像ごとの明るさの変化を制御し、確実に定量化できる結果を作成します。損傷を受けていない目は漏れがなく、理論的には比率がゼロである必要があります。したがって、これらの損傷を受けていないコントロールアイから計算された比率はバックグラウンドノイズを表し、この値は実験値をさらに正規化するために使用されます。
6.網膜層の厚さ
- OCT画像を画像処理ソフトウェアで開きます。
- 神経節細胞層、内網状層、内顆粒層、外網状層、感光体層、RPE層の境界をトレースします。各層の平均厚さを測定します。
- 網膜の他の3つの象限からのOCT画像についても繰り返します。4つの象限にわたる平均層の厚さを平均して、眼の各網膜層の平均厚さを求めた。
- 実験コホートの各眼について繰り返します。
7.網膜内層の混乱(DRIL)
- OCT イメージを ImageJ で開きます。
- ラインツールを使用して、外側の網状層の上部の境界が不明瞭になる距離を測定します。
メモ: DRIL と、イメージングアーティファクトが原因でレイヤーの視認性が悪い領域を区別することが重要です。OCTの画質が悪いと、十分な画像解像度が得られない場合、DRIL分析の目が無効になる場合があります。DRILを含む画像には、通常、明確に解像度および整理された他の領域または網膜層があり、十分な画質の良い指標となる可能性があります。- もしあれば、混乱が始まる緯度から外側の網状層の上部境界が再び見えるようになる緯度まで水平に測定します。外側の網状層が垂直方向に上下にシフトしても、完全に水平に測定します。
- 混乱のない領域で区切られた複数の混乱領域が存在する場合があります。これらを個別に測定し、距離の合計を計算します。
- 解体の長さを各OCT画像に見える網膜の全長で割って、画像に対する解体の比率を求めます。
- 網膜の他の3つの象限からのOCT画像の測定と計算を繰り返します。
- 4つのOCT画像から混乱の比率の平均を取ります。この数値は、網膜全体の平均的な混乱を表します。実験コホートの各眼について繰り返します。
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Representative Results
これらの分析方法により、FAおよびOCTイメージングによってキャプチャされた網膜病理の定量化が可能になります。代表的なデータが抽出される実験では、無傷の対照として機能するか、RVO手順を受け、Pen1-XBir3治療点眼薬またはPen1-生理食塩水ビヒクル点眼薬のいずれかを投与されたC57BL / 6J雄マウスを使用しました。RVO損傷モデルでは、光活性化色素12であるローズベンガルの尾静脈注射に続いて、麻酔をかけたマウスの各眼の主要静脈にレーザー照射(532 nm)を行いました。視神経中枢から平均375μmの距離で3つのレーザーパルスを照射し、光凝固を誘導し、血管12を閉塞させた。RVO手順の効果的な使用はAvrutsky et al.12で実証されており、RVOメソッドの最適化に関する詳細はColón Ortiz et al.13で詳しく説明されています。図1Aは、両方のグループのFAおよびOCT画像の例を示しています。光凝固プロセスによる閉塞形成および安定化の可変性のために、異なる程度の損傷が観察され得る。一部の網膜では、RVO手順によって引き起こされる損傷により、眼科の病状が導入され、網膜画像が分析に適さなくなります。取得後、最適な分析と信頼性の高い結果を確保するために、最初に画像を除外基準について評価する必要があります。図1Bに描かれているこれらの除外基準には、網膜剥離、出血、および白内障が含まれる。眼底およびOCT画像の例で観察できるように、これらの病状は明確なOCTイメージングを妨げ、網膜をデータ分析に適さないものにします。さらに、一部の網膜には安定した閉塞が含まれていない可能性があります。これらの画像は虚血性低酸素損傷を正確にモデル化していないため、分析から除外する必要があります。
血液網膜関門の破壊は、RVO14,15の病因に寄与する。血管からの漏出量を評価することは、傷害誘発性血管透過性の有用な指標である。FAイメージングはこの漏れの可視化を可能にするが、循環速度の違いなどの多くの要因がFA画像の生の強度に影響を与え、一貫した定量化を行う16,17。私たちの方法は、網膜で観察される強度を主要な血管系の平均強度に正規化することによって、この変動を制御します。これにより、各網膜画像の漏出率が得られ、他の画像と比較して分析することができます。図2Aは、この計算に使用されたマスクされた画像を示しており、主要な血管系を網膜の他の領域から分離しています。フルオレセインを定量化できるため、損傷の重症度と治療効果の比較、および損傷の経時変化に伴う漏出の変化の研究が可能になります(図2B)が、定性的報告だけでは実証するには微妙すぎる効果である可能性があります。
OCTイメージングにより、個々の網膜層および網膜全体の厚さに対するRVOの影響を分析できます。 図3A は、OCT画像における網膜の層の描写を示す。各層の境界をトレースすると(図3B)、いくつかの解析手段が可能になります。各網膜層の厚さの定量化は、最初の浮腫反応が網膜内層により深い影響を与えるため、有用であることが証明されています。トレースはまた、網膜の総厚さの研究および網膜の内側層と外側の分離分析を可能にする。 図3C は、網膜層の初期炎症性腫脹および最終的な変性菲薄化が観察され得るRVO損傷の経時変化の分析を提供する。各層の厚さを経時的にプロットすると、内叢状層と内顆粒層の異なるダイナミクスが明らかになり、内顆粒層は最初の損傷に対してはるかに大きな反応を経験しますが、内叢状層は、最初の浮腫が安定してベースラインに戻った後、より深刻な菲薄化を示します(図3D).これにより、さまざまな時点での応答のドライバーをより正確に理解できます。また、腫れの緩和と最終的な変性に対するカスパーゼ阻害剤の有効性をテストし、分析により、個々の層で異なる効果が明らかになりました。
網膜内層の混乱(DRIL)は、糖尿病性網膜症における虚血の診断尺度として、ならびにRVO18,19における視力の予測尺度として使用される別のOCT特徴である。OCTイメージングでは、DRILは、外プレキシフォーム層12の上部境界の消失として現れ、外側プレキシフォーム層と内顆粒層を一緒にブレンドします(図4A)。図 4B は、DRIL の領域が強調表示された OCT 画像の 2 つの例を示しています。DRILは網膜全長の割合で表し、4つのOCT断面で平均します。この測定により、実験グループを定量的に比較することができます。図4Cは、RVOにおける網膜損傷の軽減における阻害剤の有効性を調べるために、2つの実験群の網膜解体を比較した分析例を示す。
図1:フルオレセイン血管造影(FA)および光干渉断層撮影(OCT)イメージングから得られた画像 。 (A)RVO後24時間および無傷の対照からの網膜からのFAおよびOCT画像の例。(B)異なる除外基準の眼底およびOCTイメージング:過度の網膜剥離、出血、角膜白内障、および閉塞なし。OCT取得距離は緑色のガイドラインで示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:フルオレセイン漏出の定量 。 (A)FA画像の血管への分離と分析のためのバックグラウンド (B)術後24時間および48時間で、10 mgのPen1-XBir3阻害剤点眼薬(N = 17)またはPen1-生理食塩水ビヒクル点眼薬(N = 13)のいずれかを投与されたC57BL / 6J網膜静脈閉塞(RVO)マウスの眼からのフルオレセイン漏出定量。背景画像の強度読み取り値は、船舶の画像からの平均強度読み取り値に正規化されます。RVOマウスの強度測定値の平均は、損傷していない対照に対してさらに正規化されています。エラーバーはSEMで平均を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:OCT画像における網膜層の厚さの定量化 。 (A)個々の網膜層が標識された損傷のない網膜:神経節細胞層、内網状層、内顆粒層、外網状層、感光体層、RPE、脈絡膜。(B)無傷対照およびRVO C57/BL6マウスの24時間後から採取されたOCT画像の層痕跡の例。(C)RVO後4時間、24時間、48時間、72時間、および8日でのC57BL / 6Jマウス網膜のOCTイメージングで観察された総網膜厚さおよび網膜内厚さの変化の定量化。(D)RVO手順直後およびRVO後24時間で、10 mgのPen1-XBir3阻害剤点眼薬(N = 14)またはPen1-生理食塩水ビヒクル点眼薬(N = 15)のいずれかを投与されたC57BL/6Jマウスの網膜の24時間、48時間、および8日後のC57BL/6Jマウス網膜の内叢状および内顆粒層の厚さ変化の定量化。エラーバーはSEMで平均を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:RVO後のOCT画像で観察された網膜内層(DRIL)の混乱の定量化。 OCT画像では、DRILは、内側の核層と外側の網状層の間の明確な線引きの喪失によって示されます。(A)OCTイメージングにおけるDRILの有無にかかわらず網膜の切片の例。(B)RVOの24時間後のC57BL/6Jマウスの2つの領域のOCTイメージングにおけるDRILの領域、白線で示した。DRILは、網膜の形状に従うのではなく、画像全体で水平に測定されます。(C)RVO手順後に2.5 mgのPen1-XBir3阻害剤点眼薬(N = 19)またはPen1-生理食塩水ビヒクル点眼薬(N = 21)のいずれかを投与されたC57BL / 6Jマウスの眼について、RVO後24時間および48時間でDRILが観察された網膜長の割合の定量化。エラーバーはSEMで平均を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
非侵襲的なげっ歯類網膜イメージングは、病理学を研究し、介入を開発するための道を提示します。以前の研究では、RVOのマウスモデルが開発および最適化されており、変動性を制限し、マウス網膜の一般的な臨床病理の信頼性の高い翻訳を可能にしています5,7,13。眼科イメージング技術の開発により、実験動物におけるFAやOCTなどの臨床in vivoイメージング技術の使用がさらに可能になり、マウスモデルをヒト疾患のプロファイルと比較する能力が付与されます6,12,15。しかし、これらの画像から抽出できる情報とモデルの全体的な翻訳の可能性を最大化するには、画像を分析するための標準化された再現性のある厳密な定量的方法が必要です。ここでは、損傷の重症度を定量的に表現できる分析方法を紹介し、マウス間および実験グループ間でより正確で信頼性の高い比較を可能にします。これらの分析には、FA画像の漏れの定量化、平均層厚の定量化、およびOCT画像のDRILの領域の定量化が含まれます。
分析を成功させるための重要な要素は、取得した画像の品質にあります。OCT画像の解像度が低いと、個々の層の追跡が困難になり、網膜内部の混乱と画質の悪さを区別できなくなる可能性があります。イメージングするときは、プラットフォーム上のマウスの位置に注意し、眼底画像に焦点が合っていること、視神経が比較的中央にあること、網膜断面が画像全体で水平であることを確認することが重要です。動物が麻酔されている間、目の一貫した潤滑も、特に同じ動物が数日間画像化される場合に重要です。潤滑が不十分な場合、角膜白内障を引き起こす可能性があり、網膜が不明瞭になり、イメージングに適さなくなります。RVOイメージングではさまざまな網膜の病状が発生する可能性があり、画像は分析に適していません。これらには、過度の網膜剥離と過度の出血が含まれ、イメージングの品質を大幅に損なうとともに、RVOのモデルとして使用するには深刻すぎる程度の損傷も表します。さらに、損傷後すぐにすべての閉塞した血管が完全に再灌流する可能性があり、RVO損傷を正確にモデル化しないため、除外基準として使用する必要があります。ただし、成功した閉塞は損傷後48〜72時間で自然に解消し、除外基準としての閉塞の存在は、手順後24時間以前に最もよく使用されることに注意することが重要です。Colón Ortizら13は、RVO手順用に最適化されたモデルで、変動性を制限し、損傷を較正するためのベストプラクティスを詳述しています。除外基準の特定と判断も、画像分析の重要なステップです。これは主に評価者の裁量に委ねられているため、評価者が治療群を知らされず、病状の重症度の判断において一貫性を実践することが重要です。これらの方法の適用には、特に複数の時点で同じマウスを画像化する慣行において、いくつかの制限が存在する。イメージングのためにマウスを麻酔できる頻度には限界があり、最適な時間経過を決定するために時間ポイントのテストと調整が必要です。私たちの研究では、4時間、24時間、48時間、および8日の画像時点を使用しており、初期損傷、急性炎症反応、および長期損傷の段階を捉えていることがわかっています12。さらに、特定のマウス系統は、様々な糖尿病マウスモデルを含む角膜白内障を発症しやすく、多数の除外または不完全な時間経過をもたらす可能性がある20,21。このようなマウス系統を利用する研究では、角膜の感度に応じて実験群のサイズまたはイメージング時点を調整する必要があるかもしれません。
フルオレセイン血管造影イメージングは、漏出などの網膜の病状や血流の変化したRVO6のパターンを観察および等級付けするために主に定性的に使用されてきました。近年、血管面積や屈曲度の計算16や画像強度の線形回帰分析17など、動物モデルにおけるFAの定量的解析の開発が進められている。眼底背景からの主要な血管のセグメンテーションは以前に用いられてきたが、充填および減衰ダイナミクスのピクセル分析において、異なるマウスにおける画像強度の変動性を証明している17。さらに、フルオレセインプールの解釈においてバイアスの可能性が指摘された17。ここで説明する定量的方法は、主要な網膜血管系からのフルオレセインの漏出を対象としており、RVO損傷に関与していることが実証されているBRBの破壊を示しています11,12,14。漏出の代替分析は、網膜フラットマウント22上の色素漏出を定量化する。ただし、侵襲的な死後分析は、漏出が複数の時点で研究される単一のマウス内のRVO損傷のタイムラインの研究にはあまり適していません。網膜疾患のさまざまな段階でのフルオレセイン漏出領域の分析は、以前に臨床研究で使用されており、他の観察された疾患病理と相関しています23。この方法では、FA画像を同様に活用してin vivoで血管漏れを研究することができ、RVO損傷のタイムライン内での漏れダイナミクスの研究が可能になります。漏れ領域の選択は地域の評価者の選択に依存するため、主観性を介してより大きな変動性をもたらす可能性があります。さらに、ここで説明するRVO損傷モデルの研究では網膜全体の漏出が調査されるため、代わりにマスキング技術を使用して計算することを選択しました。この漏出法は、DRILやOCT層トレース解析で明らかになったRVO損傷とは異なる側面を反映しており、これらの測定値との相関により、より正確な疾患プロファイルを作成することができます。
OCT画像の評価には2つの手法を提示する。急性炎症とそれに続く網膜層の変性は、RVO損傷の特徴です6,12。ここで詳述されているOCT層追跡方法論は、個々の層の正確な研究を可能にし、網膜の異なる領域におけるダイナミクスのより微妙な効果と違いを明らかにします。この解析技術は、OCTイメージングにおける網膜層の厚さの定量化に一般的に使用される他のプロトコルに基づいています。この方法は、層の厚さを推定するために使用される領域内のプロトコル間の変動、ならびに画像11全体で行われた測定の数に対処する。菲薄化は各網膜層内で均一ではないため、より少ない点測定を使用する方法では、損傷の影響の全体像が得られる可能性は低いです。網膜層の厚さに関する複数の測定戦略のメタアナリシスでは、OCT画像のより広い領域にわたって平均化するプロトコルは、疾患の重症度とのより高い相関とより高い再現性を示したことが報告されました11。画像全体で平均化することにより、この方法は、長期のRVO損傷に存在する網膜菲薄化のより正確な表現をキャプチャします。研究はまた、OCT画像が撮影される場所の点で異なります-多くの研究は視神経のイメージングを中心としています。対照的に、提示された方法はオクルージョンに対して中心となる。人間のOCTイメージングの分析における最近の開発は、特徴を分類および定量化するための機械学習アルゴリズムの使用です24。このような解析は、動物の網膜イメージング解析の有望な将来の方向性となる可能性があります。
さらに、毛細血管虚血の臨床的尺度であるDRILのげっ歯類モデルへの翻訳を提示します。ヒトでは、DRILは視力喪失と網膜の厚さの違いの予測因子であることがわかり、高い診断感度と特異度を示しています18,19。無秩序な網膜の割合を測定することによってマウスのDRILを定量化すると、閉塞した静脈の割合、RVO後7日目のERG b波振幅、およびRVO後8日目の網膜菲薄化との相関が示されています12。DRIL測定の代替法は、網膜低酸素症および虚血性損傷を測定するためのHYPOX-4の使用である。HYPOX-4は、低酸素マーカーであるピモニダゾールアニメ塩酸塩と蛍光プローブを結合して、網膜低酸素症を検出します25。HYPOX-4を使用するほとんどのプロトコルは侵襲的であり、網膜フラットマウント分析が必要であり、損傷タイムラインの構築にはあまり適していない可能性がありますが、HYPOX-4プローブを使用したin vivoイメージングプロトコルが最近試験的に導入されました25。DRIL分析は、各OCT画像の単一の測定が網膜層追跡などの分析よりも時間効率が高いため、網膜損傷の迅速な読み取りとしても役立ちます。しかしながら、これらの措置は互換性がなく、異なる網膜病理を明らかにすることに留意すべきである。むしろ、DRILを効果サイズまたは介入効果の初期読み出しとして使用でき、その後、網膜層のより微妙な効果を徹底的に分析するためにレイヤートレーシングを採用できる、それらを協調して使用する必要があります。
これらの方法は本質的に直交しており、各実験対象に対する疾患プロファイルの作成を可能にする。これらの各方法で報告された病状は異なるため、比例して拡大することは保証されておらず、病理のより全体像を取得することで、RVO損傷のさまざまな症状構成をより厳密に調査できます。各実験動物のイメージングから抽出できる情報量を最大化する能力は、重要な結論を引き出すために必要な動物の数を減らし、実験プロセスの効率を高めます。最近改良されたRVOプロトコルにこれらの方法を適用することで、動物モデルへの臨床表現型の翻訳の再現性と研究が向上します。RVOモデルの研究を超えて、これらの方法の使用は、FAおよびOCTイメージングを使用する網膜疾患の他のモデルへの応用があります。このようなマウスモデルの例としては、加齢黄斑浮腫(AMD)26、糖尿病黄斑浮腫(DME)23、脈絡膜新生血管(CNV)27、実験的自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)28、未熟児網膜症(ROP)15などがあります。これらの方法は、他の種におけるこれらの疾患のモデルを研究する際にFAおよびOCTイメージングを使用する研究にさらに一般化することができる。これらの定量化は、疾患メカニズムのより微妙な変化にも敏感であり、図3Dや図4Cなどの治療効果の評価に役立ちます。有用性は、薬物化合物の忍容性試験における毒性試験におけるイメージングの使用にも及ぶ。これらの解析プロトコルの標準化と再現性は、動物モデルの翻訳妥当性を向上させ、網膜血管疾患の病因と病態生理学の理解を深めるのに役立ちます。
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Disclosures
著者は、競合する経済的利益はないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラム(NSF-GRFP)助成金DGE - 1644869(CKCOへ)、国立眼研究所(NEI)5T32EY013933(AMPへ)、国立神経障害・脳卒中研究所(RO1 NS081333、R03 NS099920からCMT)、および国防総省陸軍/空軍(DURIPからCMT)の支援を受けました。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AK-Fluor 10% | Akorn | NDC: 17478-253-10 | light-sensitive |
Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
Image J | NIH | ||
InSight 2D | Phoenix Technology Group | OCT analysis software | |
Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
Phoenix Micron IV | Phoenix Technology Group | Retinal imaging microscope | |
Phoenix Micron Meridian Module | Phoenix Technology Group | Laser photocoagulator software | |
Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module | Phoenix Technology Group | OCT imaging software | |
Phoenix Micron StreamPix Module | Phoenix Technology Group | Fundus imaging and acquisition targeting | |
Photoshop | Adobe | ||
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Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
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