Las matrices de hidrogel permiten un mayor rendimiento para los efectos de detección de los componentes de la matriz y la terapéutica en modelos tumorales 3D

Summary

El presente protocolo describe una plataforma experimental para evaluar los efectos de las señales mecánicas y bioquímicas en las respuestas quimioterapéuticas de las células de glioblastoma derivadas de pacientes en cultivos miméticos de matriz 3D utilizando un dispositivo de iluminación UV hecho a medida que facilita la fotoreticulación de alto rendimiento de hidrogeles con características mecánicas sintonizables.

Abstract

Las interacciones célula-matriz median procesos fisiológicos complejos a través de señales bioquímicas, mecánicas y geométricas, influyendo en los cambios patológicos y las respuestas terapéuticas. Se espera que la contabilidad de los efectos de la matriz más temprano en la cartera de desarrollo de fármacos aumente la probabilidad de éxito clínico de las nuevas terapias. Existen estrategias basadas en biomateriales que recapitulan microambientes tisulares específicos en cultivos celulares 3D, pero la integración de estos con los métodos de cultivo 2D utilizados principalmente para la detección de fármacos ha sido un desafío. Por lo tanto, el protocolo presentado aquí detalla el desarrollo de métodos para el cultivo 3D dentro de matrices de biomateriales miniaturizados en un formato de placa de múltiples pocillos para facilitar la integración con las tuberías de detección de fármacos existentes y los ensayos convencionales para la viabilidad celular. Dado que se espera que las características de la matriz críticas para preservar fenotipos clínicamente relevantes en células cultivadas sean altamente específicas de tejidos y enfermedades, será necesario un cribado combinatorio de los parámetros de la matriz para identificar las condiciones apropiadas para aplicaciones específicas. Los métodos descritos aquí utilizan un formato de cultivo miniaturizado para evaluar las respuestas de las células cancerosas a la variación ortogonal de la mecánica de la matriz y la presentación del ligando. Específicamente, este estudio demuestra el uso de esta plataforma para investigar los efectos de los parámetros de la matriz en las respuestas de las células de glioblastoma derivado del paciente (GBM) a la quimioterapia.

Introduction

El costo esperado de desarrollar un nuevo medicamento ha aumentado constantemente en la última década, con más de $ 1 mil millones en estimaciones actuales¹. Parte de este gasto es la alta tasa de fracaso de los medicamentos que ingresan a los ensayos clínicos. Aproximadamente el 12% de los candidatos a medicamentos finalmente obtienen la aprobación de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de los Estados Unidos (EE. UU.) en 2019. Muchos medicamentos fallan en la Fase I debido a toxicidad imprevista², mientras que otros que pasan los ensayos de seguridad pueden fallar debido a la falta de eficacia

Protocol

Las líneas celulares GBM derivadas de pacientes (GS122 y GS304) fueron proporcionadas por el profesor David Nathanson (nuestro colaborador), quien desarrolló estas líneas bajo un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de UCLA (IRB # 10-000655). Las células se proporcionaron desidentificadas para que las líneas celulares no pudieran vincularse de nuevo a los pacientes individuales.

1. Preparación de la solución de hidrogel

1. Prepare la solución tamponada con HEPES disolviendo el polvo de HEPES a 20 mM en la solución salina equilibrada (HBSS) de Hank. Ajuste el pH a 7 después de la solvatación compl....

Results

Las mediciones de AFM confirmaron el control preciso de la mecánica del hidrogel en función de la irradiancia UV (mW/cm²) durante la foto-reticulación utilizando una matriz led personalizada controlada por Arduino (Figura 2A). La formulación de hidrogel utilizada en este protocolo se puede encontrar en la Tabla 2. El espaciado de los LED en la plantilla proporcionada coincide con el espaciado para cada otro pozo de una placa de 384 pocillos, lo que permite la form.......

Discussion

El trabajo actual presenta métodos para generar cultivos miniaturizados en 3D dentro de ha basados en HA, al tiempo que altera la rigidez de la matriz y los péptidos disponibles para el compromiso con la integrina. Esta técnica permite el estudio sistemático de cómo los parámetros de la matriz afectan a los fenotipos celulares (por ejemplo, la viabilidad de las células cancerosas expuestas a la quimioterapia) con un mayor rendimiento. Los enfoques anteriores, incluido el presentado en este documento, han ajustado la rigi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Resistencias de 1,1 kOhm, 6 W	Digikey	35601k1ft
1,7 mL tubo de microcentrífuga	Genesse Scientific	21-108
15 mL tubo cónico	Fisher Scientific	14-959-70C
365 nm LED	Digikey	ltpl-c034uvh365
384 placa de pocillos	Bio Greiner One	781090
40 µ filtro de células m	MTC bio	C4040
Polietilenglicol terminado en tiol de 4 brazos (20 kDa)	Laysan Bio	4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTs	Digikey	2n5550ta
Resistencias de 80 Ohm, 0.125 W	Digikey	erjj-6enf80r6v
Polietilenglicol terminado en norbornene de 8 brazos (20 kDa)	Jenkem Technology	A7025-1
Accutase	Tecnologías Celulares Innovadoras	AT104500	disociación celular  reactivo
AFM Sondas	Novascan		0,01 N/m Constante de resorte nominal, 2,5 y micro; m SiO2 partícula
Arduino IDE	Arduino	1.8.19
Arduino Nano	Makerfire	Mini Nano V3.0 ATmega328P Placa
bFGF	Peprotech	100-18B	20 ng/mL
CCK8	Abcam	ab228554
Centrífuga	Termocientífica	sorvall legend xtr
CP100ST	Gilson	F148415	Puntas de pipeta para pipeta de desplazamiento positivo
Cubis Semi-Micro Balance	Sartorius	MSA225S100DI
DMEM - F12 (50-50)	Life Technologies		11330057 1x
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100
DPBS Ca (-) mg (-)	Genesse Scientific	25-508
EGF	Peprotech	AF100-15	50 ng/mL
Etanol, Anhidro	Fisher Scientific	A405P	Agregue agua desionizada para diluir al 70%
Fisherbrand Clase B Viales roscados de vidrio ámbar	Fisher Scientific	03-339-23C
Fisherbrand Papel de pesaje	Fisher Scientific	09-898-12B
G21 Suplemento	Gemini Bio	400-160	50x
Hanks Solución salina equilibrada	Thermo Fisher Scientific	14175095
HCl, ACS, 12M	Sigma Aldrich	S25838A	Agregue agua desionizada para diluir a 1 M
Sal sódica de heparina de la mucosa intestinal porcina	Sigma Aldrich	H3149-100Ku	25 µ g/mL
HEPES	Sigma Aldrich	H7006-100G
Pistola de aire caliente	Wagner	HT1000
Péptido de sialoproteína de unión a integrina (IBSP)	Genscript	Pedido personalizado	GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Litio fenil-2,4,6 trimetilbenzoilfosfinato (LAP) , >95%	Sigma Aldrich	900889-1G
Placa de agitación magnética	Thermo Microcentrífuga Scientific	SP194715
	Thermo Scientific	Sorvall legend micro 21R
Microman E pipeta monocanal	Gilson	FD10004	Pipeta de desplazamiento positivo
Puntas de		micropipeta	Varios tamaños
Micropipeta mLine	Sartorio
N-acetilcisteína	Sigma Aldrich	A7250-10G
Nanowizard 4	Bruker		AFM microscopio
NaOH	Fisher Scientific	ss255-1	Agregue agua desionizada para diluir a 1 M
Normoicin	Invivogen	ant-nr-1	500x
Osteopontin Peptide	Genscript	Pedido personalizado	GCGYGTVDVDPDGRGDSLAYG
Pipet Aid	Drummond	4000102
Portaobjetos de microscopio liso	Globe Scientific	1301
Aislador de silicona Press-To-Seal, 12-4,5 mm de diámetro x 2 mm de profundidad	Grace Bio Labs	664201-A	Cortado para que se hagan 8 moldes individuales a partir de una sola hoja
Procesamiento	Procesamiento	3.5.4
Repetidor M4	Eppendorf	4982000322
Puntas	de pipeta repetidorasSartorio	30089430	tamaños de 1 mL
Péptido RGD	Genscript		GCGYGRGDSPG
Scoth Tape Pipetas
Serológicas	Genesse Scientific	12-102,12-104	5,10 mL Pipetas
Pasta de Soldadura	Digikey	315-NC191LT15T5-ND
Alambre de Soldadura
Recto pinza de disección	VWR Scientific	82027-408
Synergy H1 Lector de placas	Biotek
T-75 Matraz tratado para cultivo celular	Genesee Scientific	25-209
Temozolomida	Sigma Aldrich	T2577	Normalmente se utiliza a partir de 10 y micro; M a 100 y micro; M
Tenascin-C Peptide	Genscript		GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV
Ácido hialurónico tiolado (700 kDa), 6-8% modificado	Lifecore Biomedical	HA700K5
VWR Spinbar, Flea Micro	VWR	58948-375