Producción de virus de la enfermedad de Newcastle recombinante de alto título a partir de líquido alantoico

Summary

Aquí proporcionamos un procedimiento detallado para la producción, purificación y cuantificación del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante de alto título. Este protocolo produce consistentemente > 6 × 10⁹ unidades formadoras de placa/ml, proporcionando cantidades de virus apropiadas para estudios in vivo en animales. Se describen ensayos de control de calidad adicionales para garantizar la seguridad in vivo .

Abstract

El virus de la enfermedad de Newcastle (VEN), también conocido como serotipo 1 del ortoavulavirus aviar, es un virus de ARN monocatenario de sentido negativo que se ha desarrollado como un virus oncolítico y una vacuna vectorizada viralmente. El VEN es un agente terapéutico y profiláctico atractivo debido a su sistema genético inverso bien establecido, potentes propiedades inmunoestimulantes y excelente perfil de seguridad. Cuando se administra como un virus oncolítico o una vacuna vectorizada viralmente, el VEN provoca una respuesta inmune antitumoral o antígeno robusta, activando los brazos innato y adaptativo del sistema inmunitario.

Dadas estas características deseables, el VEN ha sido evaluado en numerosos ensayos clínicos y es uno de los virus oncolíticos mejor estudiados. Actualmente, hay dos ensayos clínicos registrados que involucran el VEN: uno que evalúa una vacuna recombinante vectorizada por el VEN para el SARS-CoV-2 (NCT04871737), y un segundo que evalúa un NDV recombinante que codifica la interleucina-12 en combinación con Durvalumab, un anticuerpo antiPD-L1 (NCT04613492). Para facilitar un mayor avance de este vector viral altamente prometedor, se necesitan métodos simplificados para generar UN VEN (rNDV) recombinante de alto título, de grado in vivo.

Este documento describe un procedimiento detallado para amplificar el rNDV en huevos de gallina embrionados libres de patógenos especificados (SPF) y purificar el rNDV a partir de líquido alantoico, con mejoras para reducir la pérdida durante la purificación. También se incluyen descripciones de los ensayos de control de calidad recomendados, que deben realizarse para confirmar la falta de contaminantes y la integridad del virus. En general, este procedimiento detallado permite la síntesis, purificación y almacenamiento de VEN de alto título, de grado in vivo, recombinante, lentogénico y mesogénico para su uso en estudios preclínicos.

Introduction

El virus de la enfermedad de Newcastle, también conocido como ortoavulavirus aviar-1, es un paramixovirus aviar envuelto con el potencial de ser utilizado como un virus oncolítico o una vacuna vectorizada viral 1,2,3,4,5,6,7. Más recientemente, el VEN diseñado para expresar la proteína espiga del SARS-CoV-2 se ha caracterizado como una vacuna intranasal efectiva en modelos^de desafío de ratón y hámster

Protocol

Todo el trabajo que involucra el uso de animales fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Guelph de acuerdo con el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. Todo el trabajo se realiza en un laboratorio de Nivel 2 de Bioseguridad (BSL2) en Canadá, donde el VEN mesogénico es un patógeno del grupo de riesgo 2. Todos los pasos involucrados en la amplificación y purificación del VEN deben realizarse en un gabinete de seguridad biológica Tipo IIA para fines de seguridad y esterilidad.

1. Amplificación del VEN utilizando huevos de gallina embrionados libres de patógenos especificados

1. Inocul....

Results

Recolección de líquido alantoico
Como el líquido alantoico se cosecha de huevos de gallina embrionados, debe parecer claro y transparente. Si el fluido aparece opaco y amarillo, esto indica la presencia de contaminantes. La inclusión de este fluido alantoico durante la purificación impedirá el proceso de purificación, ya que la presión aumentará rápidamente y superará los 10 psi, lo que resultará en el cizallamiento del virus y la pérdida del virus infeccioso. El líquido alantoico que parece sanguinol.......

Discussion

Los virus utilizados como agentes terapéuticos en estudios preclínicos deben ser altamente purificados para evitar toxicidad cuando se administran in vivo¹⁵. Si no se eliminan los agentes adventicios o contaminantes, esto puede conducir a reacciones adversas graves que nieguen el efecto terapéutico del agente viral²⁸. Como el VEN se produce en huevos de gallina embrionados, existen varias proteínas contaminantes del huevo, como la ovoalbúmina, que deben eliminarse .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Tripsina	HyClone	SH30042.02
1 mL Jeringa de punta deslizante	BD 309659
10 mL Jeringa Luer-Lok	BD	302995
10% Povidona Solución de Yodo	LORIS	109-08
15 mL Tubos Cónicos	Thermo-Fisher	14955240
18G x 1 1/2 in Aguja de llenado romo	BD	305180
18G x 1 1/2 pulgadas Aguja deslizante de precisión	BD 305196
25 G x 5/8 pulgadas Aguja	BD	305122
2-Mercaptoetanol	Thermo-Fisher	03446I-100
30% Acrilamida/Bis Solución 37.5:1	BioRad	1610158
4% Paraformaldehído-PBS	Thermo-Fisher	J19943-K2
5 mL Jeringa Luer-Lok	BD	309646
96 Placa de cultivo de tejidos - fondo plano	Greiner Bio One	655180
Ácido Acético, Glacial	Thermo-Fisher	A38-212
Agarosa	Froggabio	A87-500G
Alexa-Fluor 488 Cabra-Anti-Ratón	Invitrogen	A11001
Allegra X-14 Centrífuga	Beckman Coulter	B08861
Persulfato de amonio	BioRad	161-0700
Lejía (5%)	Thermo-Fisher	36-102-0599
Pinza de punta ancha sin dentar	Thermo-Fisher	09-753-50
Azul de bromofenol	Sigma-Aldrich	114405-25G
Centramate Soporte de casete	PALL	CM018V
ChemiDoc XRS+	BioRad	1708265
CO2 Incubadora	Thermo-Fisher
Coomassie Azul Brillante R-259	Thermo-Fisher	BP101-50
DF1 Celdas	ATCC	CRL-12203
Gel Dietético Recuperación	ClearH2O, INC	72-01-1062
Digital 1502 Incubadora de huevos Sportsman	Berry Hill	1502W
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125-500G
Vela	de huevos Berry Hill	A46
Etanol (70%)	Thermo-Fisher	BP82031GAL
solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), pH 8.0, 0.5 M en H2O	Thermo-Fisher	BP2482-500
Accesorios en T roscados hembra, nylon, 1/8 in NPT(F)	Cole-Parmer	06349-50
Suero fetal bovino	Gibco	12483-020
Pinza de punta fina de alta precisión	Thermo-Fisher	22-327379
Microscopio fluorescente	ZEISS AXIO		No es necesario si no se realiza IFA o si el NDV no codifica una proteína fluorescente
Sistema de liofilización Freezone 4.5	LABCONCO
GiBOX Gel Imager	Imágenes de singenes		de geles de agarosa
Glicerol	Thermo-Fisher	G33-1
Glicina	Thermo-Fisher	BP381-5
Kit de transcriptasa inversa de ADNc de alta capacidad	Thermo-Fisher	4368814
alto contenido de glucosa Medio esencial modificado de Dulbecco	Cytiva	SH30022.01
Kit de humedad	Berry Hill	3030
Iodixanol	Sigma-Aldrich	D1556	60% (p/v) solución de iodixanol en agua (estéril)
L-lisina Monoclorhidrato	Sigma-Aldrich	62929-100G-F
Luer-Lok Macho y Hembra a 1/8 en rosca de tubería nacional, NPT	Cole-Parmer	41507-44
Masterflex L/S Digital Drive	Cole-Parmer	RK-07522-20	Bomba peristáltica con pantalla digital
Masterflex L/S Cabezal de bomba de carga fácil para tubos de precisión	Cole-Parmer	RK-07514-10
Masterflex Tubo de silicona (Platino) L/S 16	Cole-Parmer	96420-16	BioPharm Silicona curada con platino
MC Pro 5 Termociclador	Eppendorf	EP950040025
Metanol	Thermo-Fisher	A412-4
Mini Protean Tetra Cell	BioRad	1658000EDU	SDS-PAGE ropa de fundición y funcionamiento
Mouse-Anti-NDV	Novus Biologicals	NBP2-11633	Clon 6H12
Suero de cabra normal	Abcam	AB7481
NP-40	Thermo-Fisher	85124
Omega Membrana LV Centramate Cassette, 100K	PALL	OS100T02
Ultracentrífuga Optima XE-90	Beckman Coulter	A94471
OWL Easycast B1A Mini sistema de electroforesis de gel	Thermo-Fisher	B1A
PBS 10X Solution	Thermo-Fisher	BP399-20
Poly(etilenglicol) Promedio Mn 20,000	Sigma-Aldrich	81300-1KG
PowePac 300	BioRad		Modelo 1655050 - para electroforesis en gel de agarosa
Q5 High Fidelity 2X Master Mix	New England Biolabs	M0492S
QIA Amp Viral RNA Mini Kit	Qiagen	52904
RedSafe	Thermo-Fisher	50999562
Slide-a-lyzer Cassette de diálisis (extra fuerte), 10,000 MWCO 0,5-3 mL	Thermo-Fisher	66380
Dodecil Sulfato de Sodio	Thermo-Fisher	BP166-500
Hidróxido de sodio (pellets)	Thermo-Fisher	S318-10
Huevos libres de patógenos específicos	CFIA	NA	variará según la ubicación
Sacarosa	Thermo-Fisher	S5-3
Supracap 50 Filtro de profundidad	PALL	SC050V100P
Tijeras quirúrgicas	Rotor Thermo-Fisher	08-951-5
Sw41Ti	Beckman Coulter	331362	Utilizado en el paso del protocolo 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7
Rotor SX4750	Beckman Coulter	369702
Adaptador SxX4750 para tubos de fondo concial	Beckman Coulter	359472
TEMED	Invitrogen	15524-010
Tubos de centrífuga ultratransparentes de pared delgada ( 9/16 pulgadas x 3 1/2 pulgadas)	Beckman Coulter	344059
Tris Base	Thermo-Fisher	BP152-5
Abrazadera de tornillo	para tubos PALL	88216
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379-1L
Manómetros de utilidad	Cole-Parmer	68355-06