Name: Producción de virus de la enfermedad de Newcastle recombinante de alto título a partir de líquido alantoico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Aprenda a producir virus de la enfermedad de Newcastle recombinante de alto título a partir de líquido alantoico mediante filtración tangencial. Este protocolo garantiza títulos superiores a 6 × 10⁹ unidades formadoras de placas/mL para estudios in vivo seguros.

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J.G.E.Y recibió una beca de doctorado de la Facultad de Veterinaria de Ontario y una beca de posgrado de Ontario. Este trabajo fue financiado por Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants a SKW (subvención # 304737) y LS (subvención # 401127).

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<li>Kortekaas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+immunity+provided+by+a+paramyxovirus+vaccine+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector.</a> Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).</li>
<li>Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+paramyxoviruses%3A+mechanism+of+action%2C+preclinical+and+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Molekuliarnaia+Biologiia%22%5BJournal%5D)">Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies.</a> Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).</li>
<li>Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+%28NDV%29%3A+brief+history+of+its+oncolytic+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains.</a> Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).</li>
<li>Matuszewska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+vascular+normalization+with+an+oncolytic+virus+enhances+immunotherapy+in+a+preclinical+model+of+advanced-stage+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer.</a> Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).</li>
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<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Newcastle+disease+virus+%28NDV%29+expressing+a+membrane-anchored+spike+as+a+cost-effective+inactivated+SARS-CoV-2+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine.</a> Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Newcastle+disease+virus+mediated+dendritic+cell+activation+and+cross-priming+tumor-specific+immune+responses+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo.</a> International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).</li>
<li>Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+at+the+forefront+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy.</a> Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).</li>
<li>Ricca, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+immunity+to+oncolytic+virus+potentiates+its+immunotherapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy.</a> Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).</li>
<li>Zamarin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+oncolytic+virotherapy+overcomes+systemic+tumor+resistance+to+immune+checkpoint+blockade+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy.</a> Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).</li>
<li>Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+therapy+resistance%3A+an+update+on+oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+improvements+of+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy.</a> Biomedicines. 7 (3), (2019).</li>
<li>Santry, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+high-titer+Newcastle+disease+virus+for+use+in+preclinical+mouse+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer.</a> Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).</li>
<li>Cassel, W. A., Murray, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ten-year+follow-up+on+stage+II+malignant+melanoma+patients+treated+postsurgically+with+Newcastle+disease+virus+oncolysate%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Oncology+and+Tumor+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate.</a> Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).</li>
<li>Plitt, T., Zamarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy+with+Newcastle+disease+virus%3A+rationale+for+new+immunotherapeutic+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Investigations%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations.</a> Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).</li>
<li>Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Newcastle+disease+virus+by+Vero+cells+grown+on+cytodex+1+microcarriers+in+a+2-litre+stirred+tank+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor.</a> Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, (2010).</li>
<li>Blom, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+chromatographic+reduction+of+ovalbumin+for+egg-based+influenza+virus+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification.</a> Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).</li>
<li>Hegde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture-based+influenza+vaccines%3A+A+necessary+and+indispensable+investment+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+and+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).</li>
<li>Fulber, J. P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+development+for+Newcastle+disease+virus-vectored+vaccines+in+serum-free+vero+cell+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures.</a> Vaccines. 9 (11), 1335(2021).</li>
<li>Ungerechts, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+oncolytic+viruses+into+the+clinic%3A+clinical-grade+production%2C+purification%2C+and+characterization+of+diverse+oncolytic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16018(2016).</li>
<li>Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+recombinant+Newcastle+disease+virus+from+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments. (80), e50830(2013).</li>
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<li>van Vloten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+high-titer+OrfV+for+preclinical+studies+in+vaccinology+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 23, 434-447 (2021).</li>
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<li>Mita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiproinflammatory+effects+of+iodixanol+%28OptiPrep%29-based+density+gradient+purification+on+human+islet+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Antiproinflammatory effects of iodixanol (OptiPrep)-based density gradient purification on human islet preparations.</a> Cell Transplantation. 19 (12), 1537-1546 (2010).</li>
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<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+purification+of+Citrus+yellow+vein+clearing+virus+by+sucrose+cushion+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient purification of Citrus yellow vein clearing virus by sucrose cushion ultracentrifugation.</a> Journal of Plant Pathology. 98 (1), 159-161 (2016).</li>
<li>Zhao, H., Peeters, B. P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+viral+vector%3A+Effect+of+genomic+location+of+foreign+gene+on+gene+expression+and+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.</a> Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).</li>
<li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy.</a> Journal of Virology. 90 (11), 5343-5352 (2016).</li>
<li>Chen, T. -F., Jang, J. -W., Miller, J. A. STABLE AND FILTERABLE ENVELOPED VIRUS FORMULATIONS STABILE UND FILTERBARE EINGEHÜLLTE VIRUSFORMULIERUNGEN FORMULATIONS DE VIRUS ENVELOPPÉS FILTRABLES ET STABLES (84). EUROPEAN PATENT SPECIFICATION. , Designated Contracting States: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR 1-14 (2007).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+amino+acid+sequence+diversity+at+the+F+protein+cleavage+site+of+Newcastle+disease+virus+in+fusogenic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity.</a> PLOS ONE. 12 (9), 0183923(2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Los virus utilizados como agentes terapéuticos en estudios preclínicos deben ser altamente purificados para evitar toxicidad cuando se administran in vivo15. Si no se eliminan los agentes adventicios o contaminantes, esto puede conducir a reacciones adversas graves que nieguen el efecto terapéutico del agente viral28. Como el VEN se produce en huevos de gallina embrionados, existen varias proteínas contaminantes del huevo, como la ovoalbúmina, que deben eliminarse ...

El virus de la enfermedad de Newcastle, también conocido como ortoavulavirus aviar-1, es un paramixovirus aviar envuelto con el potencial de ser utilizado como un virus oncolítico o una vacuna vectorizada viral 1,2,3,4,5,6,7. Más recientemente, el VEN diseñado para expresar la proteína espiga del SARS-CoV-2 se ha caracterizado como una vacuna intranasal efectiva en modelosde desafío de ratón y hámster 7,8,9. Cuando se usa como inmunoterapia contra el cáncer, resulta en el reclutamiento de células inmunes innatas, específicamente células asesinas naturales, producción de interferón tipo I y la generación de células T antitumorales específicas 10,11,12,13. Además de estas potentes propiedades inmunoestimulantes, el VEN tiene un fuerte perfil de seguridad y un sistema de genética inversa bien establecido14,15. Estas características deseables han impulsado la evaluación del VEN en numerosos ensayos clínicos preclínicos y humanos (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Para avanzar aún más en este vector viral inmunoestimulador altamente prometedor, se necesitan métodos detallados para producir y purificar el VEN ultrapuro de alto título que se puede administrar de manera segura in vivo.
Como el VEN es un paramixovirus aviar, se amplifica con mayor frecuencia en los huevos de gallina embrionados. Si bien existen sistemas basados en células disponibles para propagar el VEN, la mayoría no ha podido producir títulos similares a los logrados en los huevos de gallina embrionados18. Sin embargo, existen algunos inconvenientes en la producción de VEN en los huevos, incluido el hecho de que la producción a base de huevos es larga y no fácilmente escalable, el abastecimiento de grandes cantidades de huevos de gallina SPF puede ser problemático, y existe el potencial de contaminación con alérgenos de huevo 13,18,19,20 . Recientemente, un grupo ha demostrado que las células Vero cultivadas en suspensión en medio libre de suero pueden soportar la replicación del VEN a títulos comparables a los logrados en los óvulos, antes de la purificación21. Sin embargo, esto requirió el paso en serie del virus para adaptar el virus a las células Vero, y la optimización de un método para purificar el VEN de las células Vero en suspensión todavía se requiere21.
Como se destacó anteriormente, los métodos utilizados para purificar el virus de alto título e in vivo varían según el virus en cuestión22. Existe un sistema de genética inversa bien establecido disponible para la generación de VEN recombinante. Este proceso, que implica el uso de un clon de ADNc, plásmidos ayudantes y un virus ayudante que expresa ARN polimerasa T7, ha sido descrito previamente en detalle15,23. Este protocolo se puede aplicar al VEN lentogénico o mesogénico. El virus descrito en este protocolo es un NDV mesogénico recombinante que codifica la proteína verde fluorescente (GFP) de la medusa Aequorea victoria insertada entre los genes virales P y M como una unidad de transcripción individual, ya que este ha sido descrito previamente como el sitio óptimo para la inserción de transgenes extraños24.
Los métodos cerrados describen la purificación del VEN en función de su tamaño, que varía de 100 a 500 nm, y su densidad15. Esto ha permitido la generación de existencias de VEN de alto título de grado in vivo en aproximadamente 3 semanas, desde que se reciben los huevos hasta que se tienen un título final. Se describen las técnicas utilizadas con frecuencia en la producción a gran escala de virus a base de huevos, como la filtración de flujo tangencial, la filtración de profundidad y la ultracentrifugación por gradiente de densidad, lo que permite la traducción de estos métodos a una producción a mayor escala. Las técnicas descritas anteriormente para la purificación del VEN se han mejorado mediante la incorporación de un tampón estabilizador de virus, el uso de iodixanol durante la ultracentrifugación del gradiente de densidad y la descripción de diversas medidas de control de calidad para garantizar la calidad de grado in vivo 15. Esto ha permitido que la purificación del VEN de grado in vivo alcance títulos tan altos como 3 × 1010 PFU / ml de 0.8 a 1.0 L de líquido alantoico.

<table><tbody><tr><td>0.25% Tripsina</td><td>HyClone</td><td>SH30042.02</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Jeringa de punta deslizante</td><td>BD 309659</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL Jeringa Luer-Lok</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>10% Povidona Solución de Yodo</td><td>LORIS</td><td>109-08</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubos Cónicos</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14955240</td><td></td></tr><tr><td>18G x 1 1/2 in Aguja de llenado romo</td><td>BD</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>18G x 1 1/2 pulgadas Aguja deslizante de precisión</td><td>BD 305196</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 G x 5/8 pulgadas Aguja</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>03446I-100</td><td></td></tr><tr><td>30% Acrilamida/Bis Solución 37.5:1</td><td>BioRad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehído-PBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Jeringa Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>96 Placa de cultivo de tejidos - fondo plano</td><td>Greiner Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético, Glacial</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Froggabio</td><td>A87-500G</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488 Cabra-Anti-Ratón</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-14 Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>B08861</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Lejía (5%)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>36-102-0599</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de punta ancha sin dentar</td><td>Thermo-Fisher</td><td>09-753-50</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114405-25G</td><td></td></tr><tr><td>Centramate Soporte de casete</td><td>PALL</td><td>CM018V</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+</td><td>BioRad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Azul Brillante R-259</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP101-50</td><td></td></tr><tr><td>DF1 Celdas</td><td>ATCC</td><td>CRL-12203</td><td></td></tr><tr><td>Gel Dietético Recuperación</td><td>ClearH2O, INC</td><td>72-01-1062</td><td></td></tr><tr><td>Digital 1502 Incubadora de huevos Sportsman</td><td>Berry Hill</td><td>1502W</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125-500G</td><td></td></tr><tr><td>Vela</td><td>de huevos Berry Hill</td><td>A46</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70%)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP82031GAL</td><td></td></tr><tr><td>solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), pH 8.0, 0.5 M en H2O</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>Accesorios en T roscados hembra, nylon, 1/8 in NPT(F)</td><td>Cole-Parmer</td><td>06349-50</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de punta fina de alta precisión</td><td>Thermo-Fisher</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>ZEISS AXIO</td><td></td><td>No es necesario si no se realiza IFA o si el NDV no codifica una proteína fluorescente</td></tr><tr><td>Sistema de liofilización Freezone 4.5</td><td>LABCONCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GiBOX Gel Imager</td><td>Imágenes de singenes</td><td></td><td>de geles de agarosa</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcriptasa inversa de ADNc de alta capacidad</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>alto contenido de glucosa Medio esencial modificado de Dulbecco</td><td>Cytiva</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Kit de humedad</td><td>Berry Hill</td><td>3030</td><td></td></tr><tr><td>Iodixanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>60% (p/v) solución de iodixanol en agua (estéril)</td></tr><tr><td>L-lisina Monoclorhidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62929-100G-F</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lok Macho y Hembra a 1/8 en rosca de tubería nacional, NPT</td><td>Cole-Parmer</td><td>41507-44</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Drive</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-07522-20</td><td>Bomba peristáltica con pantalla digital</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Cabezal de bomba de carga fácil para tubos de precisión</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-07514-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Tubo de silicona (Platino) L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>96420-16</td><td>BioPharm Silicona curada con platino</td></tr><tr><td>MC Pro 5 Termociclador</td><td>Eppendorf</td><td>EP950040025</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>BioRad</td><td>1658000EDU</td><td>SDS-PAGE ropa de fundición y funcionamiento</td></tr><tr><td>Mouse-Anti-NDV</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-11633</td><td>Clon 6H12</td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Abcam</td><td>AB7481</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo-Fisher</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Omega Membrana LV Centramate Cassette, 100K</td><td>PALL</td><td>OS100T02</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Optima XE-90</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>OWL Easycast B1A Mini sistema de electroforesis de gel</td><td>Thermo-Fisher</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10X Solution</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>Poly(etilenglicol) Promedio Mn 20,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81300-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PowePac 300</td><td>BioRad</td><td></td><td>Modelo 1655050 - para electroforesis en gel de agarosa</td></tr><tr><td>Q5 High Fidelity 2X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>QIA Amp Viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td></td></tr><tr><td>RedSafe</td><td>Thermo-Fisher</td><td>50999562</td><td></td></tr><tr><td>Slide-a-lyzer Cassette de diálisis (extra fuerte), 10,000 MWCO 0,5-3 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>66380</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sodio</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (pellets)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S318-10</td><td></td></tr><tr><td>Huevos libres de patógenos específicos</td> El proveedor de <td>CFIA</td><td>NA</td><td>variará según la ubicación</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Supracap 50 Filtro de profundidad</td><td>PALL</td><td>SC050V100P</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>Rotor Thermo-Fisher</td><td>08-951-5</td><td></td></tr><tr><td>Sw41Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td>Utilizado en el paso del protocolo 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7</td></tr><tr><td>Rotor SX4750</td><td>Beckman Coulter</td><td>369702</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador SxX4750 para tubos de fondo concial</td><td>Beckman Coulter</td><td>359472</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga ultratransparentes de pared delgada ( 9/16 pulgadas x 3 1/2 pulgadas)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Abrazadera de tornillo</td><td>para tubos PALL</td><td>88216</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Manómetros de utilidad</td><td>Cole-Parmer</td><td>68355-06</td><td></td></tr></tbody></table>

producción de virus de la enfermedad de newcastle recombinante de alto título a partir de líquido alantoico

Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

El virus de la enfermedad de Newcastle (VEN), también conocido como serotipo 1 del ortoavulavirus aviar, es un virus de ARN monocatenario de sentido negativo que se ha desarrollado como un virus oncolítico y una vacuna vectorizada viralmente. El VEN es un agente terapéutico y profiláctico atractivo debido a su sistema genético inverso bien establecido, potentes propiedades inmunoestimulantes y excelente perfil de seguridad. Cuando se administra como un virus oncolítico o una vacuna vectorizada viralmente, el VEN provoca una respuesta inmune antitumoral o antígeno robusta, activando los brazos innato y adaptativo del sistema inmunitario. 
Dadas estas características deseables, el VEN ha sido evaluado en numerosos ensayos clínicos y es uno de los virus oncolíticos mejor estudiados. Actualmente, hay dos ensayos clínicos registrados que involucran el VEN: uno que evalúa una vacuna recombinante vectorizada por el VEN para el SARS-CoV-2 (NCT04871737), y un segundo que evalúa un NDV recombinante que codifica la interleucina-12 en combinación con Durvalumab, un anticuerpo antiPD-L1 (NCT04613492). Para facilitar un mayor avance de este vector viral altamente prometedor, se necesitan métodos simplificados para generar UN VEN (rNDV) recombinante de alto título, de grado in vivo. 
Este documento describe un procedimiento detallado para amplificar el rNDV en huevos de gallina embrionados libres de patógenos especificados (SPF) y purificar el rNDV a partir de líquido alantoico, con mejoras para reducir la pérdida durante la purificación. También se incluyen descripciones de los ensayos de control de calidad recomendados, que deben realizarse para confirmar la falta de contaminantes y la integridad del virus. En general, este procedimiento detallado permite la síntesis, purificación y almacenamiento de VEN de alto título, de grado in vivo, recombinante, lentogénico y mesogénico para su uso en estudios preclínicos.

Recolección de líquido alantoico Como el líquido alantoico se cosecha de huevos de gallina embrionados, debe parecer claro y transparente. Si el fluido aparece opaco y amarillo, esto indica la presencia de contaminantes. La inclusión de este fluido alantoico durante la purificación impedirá el proceso de purificación, ya que la presión aumentará rápidamente y superará los 10 psi, lo que resultará en el cizallamiento del virus y la pérdida del virus infeccioso. El líquido alantoico que parece sanguinol...

Aquí proporcionamos un procedimiento detallado para la producción, purificación y cuantificación del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante de alto título. Este protocolo produce consistentemente > 6 × 109 unidades formadoras de placa/ml, proporcionando cantidades de virus apropiadas para estudios in vivo en animales. Se describen ensayos de control de calidad adicionales para garantizar la seguridad in vivo .

Producción de virus de la enfermedad de Newcastle recombinante de alto título a partir de líquido alantoico

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

Este protocolo describe las técnicas utilizadas para producir el virus de la enfermedad de Newcastle para que pueda administrarse de forma segura a ratones y otros animales como hámsters y ovejas. El uso de la filtración de flujo tangencial permite que los grandes volúmenes de partida se procesen de manera más eficiente en comparación con los procedimientos existentes que utilizan solo procesos de centrifugación. Este es un procedimiento largo que implica varios pasos intrincados, lo que significa que la gestión del tiempo puede ser un problema.Recomendaría identificar todos los posibles pasos de pausa para que la técnica se pueda dividir adecuadamente, minimizando el estrés. Demostrando este procedimiento estará Alex, un asistente de investigación de mi laboratorio. Para la purificación del virus de la enfermedad de Newcastle o NDV, primero, prepare el sistema experimental previamente establecido ejecutando 50 mililitros de PBS a través de él.Detenga la bomba cuando queden aproximadamente cinco mililitros de PBS en el tubo. A continuación, conecte un filtro de profundidad con una clasificación de retención micromolar de uno a tres al tubo. Para ventilar el filtro, retire la segunda tapa en el lado epical del filtro de profundidad y luego comience a ejecutar 50 mililitros adicionales de PBS a través del sistema.Una vez que el PBS comience a fluir a través de la ventilación en la parte superior del filtro, cierre el puerto y continúe fluyendo PBS a través de las líneas. Después de eso, reemplace el recipiente de desechos con un nuevo recipiente de recolección estéril y comience a pasar el líquido alantoico a través del filtro de profundidad. A continuación, configure el sistema de filtración de flujo tangencial o TFF en una confirmación abierta y ejecute como se describe en el manuscrito.Cuando queden unos cinco mililitros de líquido en el depósito, detenga la bomba y agregue líquido alantoico filtrado en profundidad al depósito. A continuación, reanude el flujo de la bomba. Para evitar el cizallamiento del virus, es importante asegurarse de que la presión del sistema no exceda la fuerza de 10 libras por pulgada cuadrada.Para aumentar la ilusión, se debe usar una combinación de la velocidad de la bomba peristáltica y la abrazadera C. Se dejan de 150 a 100 mililitros de líquido alantoico en el depósito, pausa la bomba e intercambia el tampón agregando de 150 a 200 mililitros de tampón ML. Una vez más, detenga la bomba cuando queden de cinco a 10 mililitros de líquido en el depósito, luego use dos abrazaderas en C para cerrar la cintura.Desacople la línea retenida que alimenta el depósito e insértela en un tubo cónico de 50 mililitros. Luego reanude el flujo y haga una pausa cuando queden pocas gotas de líquido en el tanque del depósito. A continuación, retire las abrazaderas C de las líneas de residuos y vuelva a conectar la línea de alimentación retenida al tanque del depósito.Mientras tanto, para prepararse para la ultracentrifugación del gradiente de densidad de iodixanol, primero agregue un tubo de ultra centrífuga de pared delgada de 0.5 mililitros de 40% de iodixanol a un tubo de ultra centrífuga de pared delgada de 13.2 mililitros. Luego prepare la columna con adiciones sucesivas de 2.5 mililitros de iodixanol al 20% y 2.5 mililitros de iodixanol al 10%. Antes de la ultracentrifugación, agregue cuidadosamente de seis a 6,5 mililitros de la solución de virus aludida desde el sistema TFF a la columna de iodixanol sin alterar el gradiente.Después de la ultracentrifugación, retire los tubos con un par de pinzas estériles. La banda objetivo debe ser una banda grande entre los gradientes de 10 y 20%. A continuación, suspenda el tubo sobre la parte superior de un vaso de precipitados con un soporte de retorta.Después de eso, conecte una aguja de 1.5 pulgadas de calibre 18 a una jeringa de cinco mililitros, luego perfore el costado del tubo de la ultracentrífuga con la aguja y retire la banda objetivo extendiendo lentamente el émbolo. Después de extraer el iodixanol de la solución del virus como se describe en el manuscrito, use una jeringa para inyectar cuidadosamente el virus en un casete de diálisis. Para concentrar la solución de virus, retire el cassette de diálisis del tampón de diálisis y colóquelo en una pequeña bolsa de plástico sellable.Luego agregue de 15 a 25 mililitros de polietilenglicol al 40% a la bolsa para que el cassette de diálisis quede completamente sumergido. Después de la diálisis, enjuague brevemente el cassette de diálisis con PBS. A continuación, llene una jeringa equipada con una aguja de 1,5 pulgadas de calibre 18 con aire, inserte la jeringa en el cassette de diálisis y empuje el émbolo.Gire el aparato para eliminar el virus sin eliminar el aire introducido. Para desalojar el virus residual que se adhiere a la membrana, masajee cuidadosamente la membrana con los dedos enguantados sin dañarla. Para facilitar el proceso de desalojo, retire parte del exceso de aire en el cassette de diálisis.Para los ensayos de control de calidad, primero, diluya la solución del virus 100 veces agregando 10 microlitros a 990 microlitros de PBS en un tubo de 1.5 mililitros. Luego continúe la dilución en serie agregando 100 microlitros de la dilución anterior a 900 microlitros de PBS. Para los ensayos de infección, agregue 20 microlitros de cada ilusión a cada pocillo de una placa de 96 pocillos.Antes de examinar el efecto citopático de la proteína de fluorescencia verde, o realizar un ensayo de inmunofluorescencia indirecta, incube la placa a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante al menos 48 horas. Mediante el uso de este protocolo, se obtuvo un NDV altamente purificado como lo demuestra la electroforesis en gel de poliacrilamida con sulfato de sodio de las proteínas virales. La infectividad del virus purificado por este método también se verificó mediante la dosis de infección de cultivo de tejidos del 50% o el ensayo TCID50 realizado en 96 placas de pozos.El TCID50 se determinó a partir del número de pocillos positivos para cada dilución utilizando la calculadora Spearman-Karber. El ensayo de infección reveló la diferencia entre los efectos citopáticos del VEN lentogénico y mesogénico en células DF en diferentes condiciones después de 10 y 24 horas de incubación. El ensayo immuno florence también fue efectivo en el estudio de la infección de las células Vero por el VEN lentogénico.Al preparar el sistema experimental, asegúrese de que las líneas estén cebadas de manera efectiva, ya que cualquier hidróxido de sodio residual inactivará el virus. También es importante mantener la integridad de la membrana, ya que comprometer esto afectará significativamente la purificación y el rendimiento del virus.

production-high-titer-recombinant-newcastle-disease-virus-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Rescate de virus de gripe A a partir del ADN plásmido es una técnica experimental básica y esencial que permite a los investigadores de la gripe para generar virus recombinantes para estudiar múltiples aspectos de la biología de los virus de la influenza, y para ser utilizado como vectores potenciales o vacunas.

Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido

En este artículo se describe la identificación del serotipo del virus adeno-asociado 3 (AAV3) como el vector más eficiente para orientar las células humanas del cáncer de hígado.

De alta eficiencia de transducción de las células de cáncer de hígado por recombinante serotipo del virus adeno-asociado 3 Vectores

Recombinante virus adeno-asociado (rAAVs) vectores son cada vez más valioso...

Producción y Titulación de recombinantes adeno-asociado vectores virales

Aquí se describe un protocolo basado solamente en la infección de células, lo que mejora la eficiencia de la producción recombinante de parvovirus por más de 100 veces en comparación con otros protocolos en uso. Este protocolo se basa en el uso de un nuevo adenovirus 5-basado auxiliar que contiene el VP parvovirus unidad de transcripción (Ad-VP).

Producción eficiente de parvovirus recombinante con la ayuda de derivados de adenovirus-Systems

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Propagation and Harvest of Influenza Virus from a Fertilized Chicken Egg

Rescate de arenavirus recombinantes a partir de ADNc clonado, un enfoque conocido como la genética inversa, permite a los investigadores estudiar la función de los productos específicos de genes virales, así como la contribución de los diferentes dominios y residuos específicos, a diferentes aspectos de la biología de los arenavirus . Del mismo modo, las técnicas de genética inversa en líneas celulares aprobados por la FDA (Vero) para el desarrollo de vacunas ofrece nuevas posibilidades para la...

Generación de Arenavirus recombinante para el Desarrollo de Vacunas de la FDA aprobados células Vero

Virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) se ha estudiado ampliamente en los últimos años con el fin de desarrollar nuevos vectores para la vacunación y la terapia, entre otros. Estos estudios han sido posible debido a las técnicas para rescatar virus recombinante a partir de cDNA, tales como las que se describen aquí.

Rescate del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante a partir de cDNA

Los huevos de gallina fértiles se utilizan ampliamente para producir grandes cantidades del virus de la influenza A humana, ya que proporcionan un sistema conveniente y rentable para demostrar altos rendimientos de virus.

Propagación del virus de la influenza en embrionados de pollo Huevos

Aquí proporcionamos un procedimiento detallado para la producción a gran escala de vectores AAV de grado de investigación utilizando células HEK 293 adherentes cultivadas en pilas celulares y purificación por cromatografía de afinidad. Este protocolo produce consistentemente &gt;1 x 1013 genomas vectoriales / ml, proporcionando cantidades vectoriales apropiadas para estudios con animales grandes.

Producción de vectores de virus adenoasociados en pilas celulares para estudios preclínicos en modelos animales grandes

A medida que el campo de la terapia génica continúa evolucionando, existe una creciente necesidad de métodos innovadores que puedan abordar estos desafíos. Aquí, se presenta un método único, que agiliza el proceso de generación de vectores AAV de alto rendimiento y alta pureza utilizando una plataforma de fábrica de células, cumpliendo con los estándares de calidad para estudios in vivo .

Un procedimiento simplificado y estandarizado para generar vectores de virus adenoasociados de alta calidad y alto título utilizando una plataforma de fábrica de células

Este artículo presenta un método simplificado para la preparación de 4 unidades de hemaglutinación de antígeno para las pruebas serológicas del virus de la enfermedad de Newcastle. Al determinar con precisión el título de hemaglutinación del antígeno, combinado con un método de valoración inversa más riguroso y un proceso de ajuste bien definido, mejora la eficiencia de la prueba, reduce los falsos positivos y mejora la vigilancia de la enfermedad en las aves de corral.

Optimización de la preparación de antígenos para el ensayo de inhibición de la hemaglutinación de la serología del virus de la enfermedad de Newcastle

Aprenda a producir virus de la enfermedad de Newcastle recombinante de alto título a partir de líquido alantoico mediante filtración tangencial. Este protocolo garantiza títulos superiores a 6 × 10⁹ unidades formadoras de placas/mL para estudios in vivo seguros.

Producción de virus de la enfermedad de Newcastle recombinante de alto título a partir de líquido alantoico

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