Este protocolo describe la preparación de tejido nervioso ciático entero de rata para la estimulación electrofisiológica ex vivo y el registro en un baño salino perfundido de dos compartimentos, regulado ambientalmente.
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Artículo de método
Preparación del nervio ciático de rata para neurofisiología ex vivo
En este artículo
Resumen
Resumen
Las preparaciones ex vivo permiten el estudio de muchos procesos neurofisiológicos de forma aislada del resto del cuerpo, preservando al mismo tiempo la estructura del tejido local. Este trabajo describe la preparación de los nervios ciáticos de rata para la neurofisiología ex vivo, incluida la preparación tampón, los procedimientos en animales, la configuración del equipo y el registro neurofisiológico. Este trabajo proporciona una visión general de los diferentes tipos de experimentos posibles con este método. El método descrito tiene como objetivo proporcionar 6 h de estimulación y registro en el tejido nervioso periférico extraído en condiciones estrechamente controladas para una consistencia óptima en los resultados. Los resultados obtenidos utilizando este método son potenciales de acción compuestos de fibra A (CAP) con amplitudes de pico a pico en el rango de milivoltios durante toda la duración del experimento. Las amplitudes y formas de CAP son consistentes y confiables, lo que las hace útiles para probar y comparar nuevos electrodos con modelos existentes, o los efectos de las intervenciones en el tejido, como el uso de productos químicos, alteraciones quirúrgicas o técnicas de estimulación neuromoduladora. Se probaron tanto electrodos de manguito convencionales disponibles comercialmente con contactos de platino-iridio como electrodos de elastómero conductor hechos a medida y dieron resultados similares en términos de respuesta de fuerza-duración del estímulo nervioso.
Introducción
La comprensión actual de la función nerviosa fundamental según lo modelado in silico carece de varios aspectos, especialmente con respecto a los efectos de la compartimentación del tejido nervioso fuera del soma, el axón y las dendritas. Las interacciones axon-mielina todavía son poco conocidas, como lo demuestra el hecho de que incluso los modelos nerviosos computacionales detallados como MRG1 (para nervios de mamíferos) que capturan adecuadamente la respuesta de estimulación eléctrica convencional, no capturan otros comportamientos observados experimentalmente, como el arrastre de bloque de alta frecuencia2 o ....
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Protocolo
Todos los cuidados y procedimientos de los animales se realizaron bajo licencias apropiadas emitidas por el Ministerio del Interior del Reino Unido en virtud de la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) (1986) y fueron aprobados por la Junta de Bienestar Animal y Revisión Ética del Imperial College de Londres.
1. Preparación de tampones
NOTA: Esta parte del protocolo se puede llevar a cabo mucho antes que el resto del protocolo, excepto para los pasos finales que implican la preparación de Krebs-Henseleit Buffer modificado (mKHB) a una concentración de 1x.
- Preparar una solución de....
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Resultados
Los resultados representativos que se pueden obtener con este protocolo son los potenciales de acción compuestos consistentes de las fibras nerviosas de tipo A dentro del nervio ciático. Estos potenciales de acción suelen tener una amplitud de pico a pico de aproximadamente 1 mV en el electrodo y, por lo tanto, 100 mV una vez amplificados (Figura 2). Las amplitudes de estimulación y los anchos de pulso similares deben producir amplitudes CAP similares. Los electrodos conductores del manguito.......
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Discusión
En este trabajo, describimos un protocolo para preparar los nervios ciáticos de rata para la neurofisiología ex vivo. La extracción de tejidos toma aproximadamente 30 minutos, incluida la manipulación de animales, la anestesia, el sacrificio y la disección, mientras que la limpieza de los nervios, la colocación en el baño y la implantación de electrodos deben requerir 30 minutos adicionales antes de que se pueda iniciar el registro. La preparación del búfer se puede llevar a cabo en 30 minutos, aunque esto se pu.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses.
DECLARACIÓN DE ACCESO ABIERTO:
A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia creative common Attribution (CC BY) (cuando lo permita UKRI, 'Open Government License' o 'Creative Commons Attribution No-derivatives (CC BY-ND) license may be stated instead) a cualquier versión de Manuscrito Aceptado por el Autor que surja.
INTERCAMBIO DE DATOS:
Los datos brutos utilizados en las figuras de este artículo serán puestos a disposición por los autores, sin reservas indebidas.
Agradecimientos
Los autores reconocen al Dr. Gerald Hunsberger de GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, King of Prussia, PA, EE.UU., y Galvani Bioelectronics (Stevenage, Reino Unido) por compartir su técnica original de preparación nerviosa con nosotros. Los autores reconocen a Robert Toth por el diseño del baño nervioso de doble cámara. Los autores reconocen la financiación de la subvención Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) del Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas (EPSRC). Los autores reconocen al High Performance Embedded and Distributed Systems Centre for Doctoral Training (HiPEDS CDT) del Imperial College de Londres por financiar a Adrien Rapeaux (EP....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Botella de vidrio de 1 L | VWR International Ltd | 215-1595 | Vidrio de borosilicato |
| Matraz graduado de vidrio de 1 L | VWR International Ltd | 612-3626 Vidrio de | borosilicato Botella |
| vidrio de 2 L | VWR International Ltd | 215-1596 | Vidrio de borosilicato |
| Matraz graduado de vidrio de 2 L | VWR International Ltd | BRND937254 | Vidrio |
| de borosilicatoAdaptador, neumático, 8 mm a 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | Adaptador recto push-to-fit entre la manguera de oxígeno y el tubo de dispersión de gas |
| Alkoxy | Farnell | 1971829 | ACC15 Recubrimiento conformado Alkoxy para la disección Preparación de placas de Petri |
| Anestésico | Chanelle | N/A | Anestésico inhalatorio de isoflurano, botella de 250 ml |
| Vaso de precipitados, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Vidrio de borosilicato |
| Manguito nervioso bipolar | Cortec GMBH | N/A | Diámetro interior de 800 micras, salida perpendicular, sin terminación de conector |
| Cabezas de cabra | N/A | N/A | Cabezas de laboratorio húmedas estándar para la fijación de pinzas a varillas |
| Cloruro de calcio dihidratado | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g en botella de plástico |
| Bombona de carbógeno | BOC | N/A | Tubo de centrífuga de tamaño F |
| , volumen de 15 ml | VWR International Ltd | 734-0451 | Tubos Falcon |
| Manguito nervioso de elastómero conductor | N/A | /A | Manguito nervioso de alta capacidad de carga para estimulación, consulte el protocolo para la referencia de fabricación |
| Conector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | Estos deben soldarse a un cable terminado con pinzas de cocodrilo (consulte entrada 11) |
| Conectores de pinza de cocodrilo | RS UK | 212-1203 | Estos deben soldarse a un cable terminado con conectores TermiMate (ver entrada 10) |
| Agua desionizada | N/A | N/A | Obtenida de un dispensador de agua desionizada |
| Pinzas en ángulo de 45 grados | InterFocus Ltd | 91110-10 | Pinzas finas, rango de estudiantes |
| Pinzas estándar Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Pinza de la gama Student |
| Tubo de dispersión de gas, porosidad 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucosa anhidra, en polvo | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g en botella |
| de plástico Pinzas | N/A | N/A | Pinzas estándar de laboratorio húmedo montadas en varillas |
| Agitador de calentamiento | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostáticos | N/A | N/A | Cualquier hemostático de >12 cm de longitud es adecuado |
| Alfileres de insectos, acero inoxidable, tamaño 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Ordenador portátil | N/A | N/A | Cualquier ordenador portátil apto para laboratorio con al menos 2 puertos USB sin utilizar es adecuado |
| Filtro de ruido de línea | Digitimer | N/A | Eliminador de ruido humbug (filtro de ruido de línea de 50 Hz) |
| Bajo nivel de ruido Preamplificador, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Preamplificador de voltaje de bajo ruido |
| Sal de sulfato de magnesio | VWR International Ltd | 291184P | 500g en botella de plástico |
| Scripts de MATLAB | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Scripts de inicialización, calibración y estimulación para el estimulador personalizado |
| Software de MATLAB | Mathworks | N/A Paquete | estándar |
| Microscopio de luz, PL-2000 | Fotónico | N/A Fuente | luz con cuellos de cisne. El producto se puede obtener de un proveedor externo |
| Microscopio, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Microscopio estereoscópico |
| Aceite mineral, no tóxico | VWR International Ltd | 31911.A1 | Aceite para baño nervioso |
| Baño | N/A | N/A | Baño nervioso mecanizado de plexiglás, consulte el protocolo para obtener más detalles. |
| Osciloscopio | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. El producto se puede obtener de proveedores de terceros |
| Manguera de oxígeno, 1 metro | BOC | N/A Terminaciones | de 1/4" NPT |
| Regulador de oxígeno | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | /A |
| Bomba peristáltica P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | El producto puede obtenerse de un proveedor externo |
| Placa de Petri, vidrio | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Sal de cloruro de potasio | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g en botella de plástico |
| Sal de sulfato de dihidrógeno de potasio | Merck | 1.04873.0250 | 250 g en botella de plástico |
| Rata Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 gramos, hembra | |
| Electrodo de referencia, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Electrodo de referencia de cloruro de plata |
| Varilla | N/A | N/A | Varillas de laboratorio húmedas estándar con accesorios para soportes |
| Báscula | Sartorius | N/A | M-Báscula de potencia, para el pesaje de polvos. El producto puede obtenerse de proveedores externos |
| Tijeras borde recto de 12 cm | InterFocus Ltd | 91400-12 | Terminación roma-roma, rango de estudiantes |
| Dispositivo de adquisición de señal | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 ADC multicanal |
| Grasa de silicona, no tóxica | Farnell | 3821559 | para el sellado de la mampara de la bañera |
| Tubo de silicona, interior de 2 mm diámetro | N/A | N/A | N/A Tubo |
| de silicona, 5 mm diámetro interior | N/A | N/A | N/A Alambre |
| plata | Alfa Aesar | 41390 | 0,5 mm, recocido |
| Sal de bicarbonato de sodio | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g en botella de plástico |
| Sal de cloruro de sodio | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg en botella |
| de plásticoTijeras de muelle en ángulo de 2 mm de borde | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Soporte | N/A | N/A | Soportes de laboratorio húmedos estándar con casquillos para varillas |
| Estimulador | Digitimer | DS3 | DS3 o Estimulador personalizado (ver referencias) |
| Pulga agitadora | VWR International Ltd | 442-0270 | Para usar con el agitador de calor |
| Punta de jeringa, roma, 1 mm de diámetro | N/ A | N/A | N/A |
| Punta de jeringa, roma, 2 mm de diámetro | N/A | N/A | N/A |
| Jeringa, plástico, 10 mL de volumen | N/A | La jeringa N/A | debe tener un accesorio Luer |
| Lock Cinta, resistente al agua | N/A | N/A | Para asegurar la tubería y el cableado al banco de trabajo |
| Termómetro | VWR International Ltd | 620-0806 | termómetro de vidrio |
| Alimentación USB Fuente de alimentación del estimulador | Bank RS UK | 135-1000 | cargue completamente antes del experimento. No es necesario si se utiliza la válvula DS3 |
| , cerradura Leuer, 3 vías | VWR International Ltd | 229-7440 | Para conectar la jeringa al tubo de alimentación del baño y al sifón de cebado |
Referencias
- McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).
- Pelot, N. A., Grill, W. M.
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Reimpresiones y permisos
