Inducción del rescate de pólipos en colonias de coral para obtener micropropagados individualizados para uso experimental de laboratorio

Los corales escleractinos o constructores de arrecifes son cnidarios capaces de formar esqueletos de carbonato, crear arrecifes y ecosistemas estructuralmente complejos que se pueden encontrar desde ambientes de aguas profundas a poco profundas¹. Los arrecifes de coral tropicales albergan una gran biodiversidad y proporcionan servicios ecosistémicos esenciales, como la protección costera y el mantenimiento de la pesca². La mayoría de los corales constructores de arrecifes de aguas poco profundas dependen de una relación mutualista con las algas de la familia Symbiodiniaceae, que proporcionan la energía que los corales requieren para construir sus esqueletos. La simbiosis entre el coral y las algas puede romperse por el estrés ambiental, causando el blanqueamiento del coral 3,4,5,6. Las anomalías recientes de temperatura han causado importantes eventos de blanqueamiento de corales en todo el mundo, lo que ha llevado a la mortalidad masiva de corales y a la degradación permanente de los arrecifes ^7,8,9,10,11. Como este fenómeno se basa en la expulsión de simbiontes por mecanismos celulares asociados al estrés post calor, como la apoptosis, la autofagia y la exocitosis, el blanqueamiento de corales puede describirse como un proceso celular que tiene consecuencias a escala ecosistémica ^5,6,12, lo que significa que tener cultivos in vitro de células o tejidos de coral sería aplicable para estudiar de cerca este fenómeno.

Debido a la importancia de los arrecifes de coral y las principales amenazas a las que se han enfrentado, particularmente en las últimas dos décadas², los corales se han convertido en el foco de la investigación con fines de protección y restauración en todo el mundo¹³. Sin embargo, el desarrollo de enfoques y sistemas experimentales que sean confiables, reproducibles y ofrezcan un impacto ambiental mínimo para estudiar los corales es una lucha importante en este campo.

La micropropagación se define como la proliferación in vitro del genotipo de un organismo mediante el cultivo de su material biológico en vasos controlados^14,15. El cultivo de células, tejidos y órganos ha sido crucial para la biología vegetal y animal en las últimas décadas. Permite la reproducción masiva de organismos en laboratorios, la evaluación rápida de diferentes tratamientos (como fármacos y fármacos), y el estudio directo de la función celular 14,15,16,17. En general, los modelos in vitro han sido útiles para complementar y profundizar los estudios de diferentes organismos en condiciones físicas y químicas mejor controladas. Debido a las ventajas de las técnicas de cultivo in vitro, se han desarrollado, optimizado y utilizado diferentes tecnologías de cultivo de células animales y tejidos como herramientas importantes en muchos campos de investigación, donde se han estudiado y comercializado múltiples líneas celulares para numerosas aplicaciones 16,17,18.

Se han realizado muchos avances en el conocimiento del cultivo de células y tejidos desde el primer cultivo de tejidos animales en 1882¹⁷, como el uso de medios naturales y sintéticos, la invención de líneas celulares establecidas y el desarrollo de medios 3D para cultivar una multitud de tipos de células de una mejor manera^{16,17, 18,19}. Sin embargo, el campo de la biología celular se ha centrado principalmente en un grupo selecto de organismos modelo, mientras que muchos taxones aún no tienen cultivos in vitro bien establecidos de células, tejidos u órganos²⁰. Por ejemplo, en la investigación de corales, no se han utilizado ampliamente líneas celulares inmortalizadas para la investigación, lo que limita la investigación de células de coral al uso de cultivos celulares primarios. Estos cultivos tienen una viabilidad limitada a unas pocas semanas²¹, sin que los estudios registren la supervivencia de células individuales de todos los tejidos de coral durante más de 13 días hasta principios de 2021²². El primer informe de líneas celulares de coral sostenibles que se publicó fue con células de Acropora tenuis que vivieron hasta 6 meses, y la utilidad de estas células para futuras investigaciones aún no se ha explorado²³.

Para superar las limitaciones en el cultivo de cultivos de células de coral y mantener un cultivo de laboratorio que preserve la organización tisular general de los corales, recientemente se ha propuesto el uso de pólipos aislados como modelo para la investigación de la biología del coral^24,25. Los pólipos son las unidades anatómicas de los corales, y cada uno de ellos tiene una boca ubicada en el centro de su disco oral y está conectado a otros pólipos por el coenosarc en su región aboral²⁶. La separación de pólipos vivos ocurre naturalmente por el proceso de rescate de pólipos, en el que el estrés agudo causa la digestión del coenosarc entre los pólipos, que luego puede desprenderse del esqueleto de la colonia 25,27,28. Se ha informado que este fenómeno ocurre en una variedad de taxones, incluidos los octocorales^29,30,31, los corales negros³² y los corales escleractinos 25,27,28,32,33, y se ha relacionado con múltiples factores estresantes ambientales, como la falta de calcio en el agua^24,34, el aumento de la acidez³⁵, condiciones hiperosmóticas 25,27,32,36, altas temperaturas ^36,37, inanición 33, exposición al aire^25,30 y contaminación por insecticida^28,38. El rescate de pólipos se ha reportado, por ejemplo, en corales pocilloporrid¹⁹, que están ampliamente distribuidos en todo el mundo y se usan comúnmente como modelos en la investigación de corales. Especies pertenecientes a este grupo, como Pocillopora damicornis y Styllophora pistillata, han generado aproximadamente 30-40 micropropagagas a partir de un fragmento de 5 mm²⁵. Este número enfatiza la ventaja de usar el rescate de pólipos como método para la micropropagación de corales, ya que crea la posibilidad de generar muchos individuos genéticamente idénticos a partir de un pequeño trozo de coral. El uso de pólipos aislados para la investigación también tiene las mismas ventajas que los cultivos celulares en cuanto a la posibilidad de ser cultivados en entornos de laboratorio controlados, como matraces y placas de Petri. Además, las plataformas microfluídicas para mantener pólipos vivos han demostrado que estos micropropagados se pueden mantener en entornos relativamente baratos y fáciles de reproducir, con flujo de agua controlado, superficie y temperatura^24,25. Estas plataformas de microfluídica también se pueden utilizar para visualizar estructuras de coral vivas bajo un microscopio directamente^24,25.

En el presente artículo, resumimos y demostramos las técnicas que se han desarrollado para aislar pólipos de coral individuales de sus colonias, mostrando cómo mantenerlos en condiciones de laboratorio para el cultivo a largo plazo. Los métodos discutidos incluyen el rescate de pólipos a través de condiciones hiperosmóticas por evaporación y bombeo de agua de mar de alta salinidad e incubación en agua de mar libre de calcio.

Para el presente estudio, una colonia perteneciente a la especie de coral Pocillopora verrucosa fue recolectada del arrecife Al Fahal (22.305118 N; 38.964568 E) por SCUBA mediante buceo con martillo y cincel. El género de la colonia fue identificado morfológicamente, y su especie fue clasificada como P. verrucosa en base a trabajos publicados previamente, incluyendo Pocillopora del Mar Rojo, indicando que, desde un punto de vista genético, la especie presente en esta área es P. verrucosa^39,40. El arrecife Al Fahal no es parte de un área ambiental protegida, y no se necesitaron permisos especiales para la recolección de corales. La colonia se mantuvo en un acuario de 300 L durante un mes antes de ser fragmentada y tener sus pólipos "rescatados". El acuario se mantuvo a 26 ° C con dos calentadores de acuario, tres bombas y dos fuentes de luz (ver Tabla de materiales), manteniendo un ciclo de luz de 12 h. La temperatura del acuario se mantuvo conectando cada uno de los dos calentadores a un controlador de temperatura. La emisión de luz se programó para comenzar a las 6 AM y terminar a las 6 PM, produciendo una curva de irradiancia que alcanzó su punto máximo a las 12 PM con 230 fotones μmol m⁻²s⁻¹.

1. Rescate de pólipos por alta salinidad después de la evaporación del agua

NOTA: Este método fue adaptado de Shapiro et ^al.25. Si se utilizan especies diferentes a Pocillopora verrucosa, se debe tener en cuenta el tamaño de los pólipos antes de determinar el tamaño del fragmento a cortar.

1. Cortar fragmentos pequeños (de menos de 1 cm de longitud) de una colonia de coral utilizando alicates de corte diagonales (ver Tabla de Materiales).
   NOTA: Adaptar las herramientas de corte según la especie de coral que se utilice. Los alicates diagonales son útiles para cortar corales con ramas delgadas. En el estudio actual, se cortó un fragmento para cada tratamiento, pero el número y el tamaño de los fragmentos pueden variar según el número de pólipos deseados. El tamaño de los fragmentos cortados no debe exceder la profundidad del agua después de la evaporación, por lo que los corales permanecen completamente dentro del agua después de que se realiza el proceso.
2. Coloque los fragmentos cortados en pequeñas placas de Petri llenas de 12 ml de agua de mar a las que se ha aclimatado la colonia de coral. Esto puede ser agua de mar artificial (ver Tabla de Materiales) o agua de mar filtrada a la misma salinidad en la que se insertó la colonia de coral antes de la fragmentación.
   NOTA: Es importante cubrir el fragmento completamente con agua. Si 12 ml en una placa de Petri no es suficiente para cubrir el fragmento cortado, optimice el recipiente y el volumen en consecuencia. En el presente estudio, el agua utilizada se recolectó del Mar Rojo, y su salinidad fue de 40 PSU, medida por un medidor multiparamétrico (ver Tabla de Materiales).
3. Deje la placa abierta durante ~ 24 h a temperatura ambiente para que el agua pueda evaporarse y su salinidad pueda aumentar gradualmente. Cuando la digestión de los tejidos sea observable entre pólipos, continúe con el Paso 1.4.
   NOTA: Después de que haya pasado el tiempo de incubación, la salinidad del agua debe ser aproximadamente un 40% más alta que al principio, y los pólipos deben estar listos para separarse del esqueleto.
4. Usando una pipeta de transferencia de 1 ml, cree un flujo suave cerca del tejido de coral. El flujo ayudará lentamente al desprendimiento completo de los pólipos que ya han digerido el tejido que los rodea del esqueleto.
   NOTA: Cuando el flujo de agua se crea con la pipeta, los pólipos separados o grupos de pólipos deben salir del esqueleto como escamas. Si una sustancia turbia se desprende en su lugar, indica la muerte o desintegración del tejido, lo que significa que los corales se incubaron durante demasiado tiempo o en una condición demasiado estresante (en este caso, alta salinidad). Es muy importante hacer un flujo suave de agua para separar los pólipos, ya que un flujo más fuerte puede causarles daños físicos.
5. Intercambie lentamente el agua de la placa de Petri con agua isosmótica (use la misma agua que en el Paso 1.2.) usando una pipeta. Un intercambio de agua del 50% durante 10 minutos es suficiente para aclimatar los pólipos a una condición de salinidad no estresante.
   NOTA: Como se utilizaron colonias de coral de la especie pocilloporid Pocillopora verrucosa del Mar Rojo, se llevaron a cabo pruebas para determinar bajo qué condiciones específicas rescatarían los corales de este entorno único. Es importante destacar la alta salinidad del Mar Rojo en comparación con la mayoría de los otros entornos de arrecifes.

2. Rescate de pólipos por suministro de agua de mar de alta salinidad

NOTA: Este método fue adaptado de Chuang et ^al.27.

1. Prepare 3 L de agua de mar de alta salinidad agregando NaCl al agua de mar hasta que la salinidad aumente en un 85%, medida por una sonda de salinidad.
   NOTA: En el estudio actual, se preparó un agua de mar de alta salinidad de 74 PSU a partir de 40 PSU de agua de mar del Mar Rojo.
2. Cortar pequeños fragmentos de coral como se describe en el Paso 1.1.
3. Coloque los fragmentos cortados en un recipiente de 10 L lleno de 3 L de agua de mar isosmótica (en este caso, agua de mar con salinidad no estresante para los corales, la misma que se usa en el Paso 1.2) conectada a una bomba peristáltica (ver Tabla de Materiales).
   NOTA: Para un mejor mantenimiento de la salud del coral, se pueden agregar controladores de temperatura, bombas de aire y luces para simular las mismas condiciones del acuario a las que la colonia estuvo expuesta anteriormente. Durante la incubación en el presente trabajo, los fragmentos de coral se mantuvieron en recipientes a 26 °C, bajo un ciclo de luz diario de 12 h. El movimiento del agua y la homogeneización de la temperatura se mantuvieron mediante bombas de aire.
4. Llene el recipiente que contiene fragmentos de coral con el agua de mar de alta salinidad preparada en el Paso 2.1 utilizando la bomba peristáltica durante 24 h a una velocidad de 126 ml / h. Agregue un total de 3 L de agua a una salinidad creciente de aproximadamente el 40%.
   NOTA: El agua de alta salinidad se puede producir simplemente agregando NaCl al agua de mar hasta alcanzar la salinidad prevista.
5. Cree un flujo de agua suave con una pipeta para liberar los pólipos del esqueleto (Paso 1.4.).
6. Intercambie lentamente el agua en la que están contenidos los pólipos por agua isosmótica (Paso 1.5.). A continuación, continúe con el Paso 4 o el Paso 5.

3. Rescate de pólipos mediante la incubación de agua de mar libre de calcio

NOTA: Este método fue adaptado de Pang et ^al.24.

1. Preparar una solución de agua de mar artificial libre de calcio (CaFSW) añadiendo 26,29 g de NaCl, 0,872 g de KCl, 2,16 g de MgSO₄, 11,94 g de MgCl₂, 3,42 g de Na₂SO₄ y 0,286 g de NaHCO₃ (ver Tabla de Materiales) a 1 L de agua desionizada.
   NOTA: Esta solución se ajustó a partir de protocolos anteriores para ser más adecuada para corales adaptados a una salinidad de 40 PSU. Para los corales adaptados a otras condiciones de salinidad, use la misma proporción de sales pero ajuste la masa total de solutos para obtener la salinidad que se adapte mejor a los corales en uso.
2. Cortar pequeños fragmentos de corales como se describe en el Paso 1.1.
3. Sumergir los fragmentos de coral en placas de Petri rellenas con el CaFSW preparado previamente (Paso 3.1.) e incubarlos en incubadoras orbitales a una velocidad de rotación de 80 rpm durante 3 h.
   NOTA: Una vez más, es importante cubrir el fragmento completamente con agua. Si una placa de Petri no es suficiente para cubrir el fragmento, optimice el recipiente y el volumen de acuerdo con la necesidad experimental.
4. Transfiera los fragmentos a placas de Petri o placas de 6 pocillos llenas con 20% de Medios de Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco y 100 mg / ml de solución de ampicilina (ver Tabla de Materiales) preparada con agua de mar artificial de 40 PSU. Incubar los fragmentos a 26 °C y 80 rpm, intercambiando los medios todos los días hasta que la digestión del tejido sea observable entre los pólipos y los pólipos individuales comiencen a desprenderse del esqueleto.
   NOTA: En la mayoría de los casos, la digestión del tejido se completa dentro de las 20 h de la incubación en este medio, y no se necesitan intercambios.
5. Transfiera los pólipos al agua de mar esterilizada para la recuperación inicial utilizando una pipeta. Después de 1 h de incubación, continúe con el Paso 4 o el Paso 5.

4. Mantenimiento de pólipos en placas de Petri

1. Una vez que los pólipos se devuelven al agua de mar filtrada con salinidad no estresante, seleccione pólipos viables observando la integridad del tejido y el movimiento causado por el flujo ciliar bajo un estereomicroscopio.
2. Coloque los pólipos seleccionados en una placa de Petri de vidrio o plástico y cubra la placa de Petri con una red de plancton (tamaño de malla de 200 μm, consulte la Tabla de materiales) para que los pólipos no floten lejos de la placa.
   NOTA: El tamaño de la red de malla puede variar según el tamaño de los pólipos. Es importante tener en cuenta que las redes deben tener poros que sean más pequeños que los pólipos y permitan el intercambio de agua y la penetración de la luz.
3. Coloque la placa de Petri dentro de un acuario con las condiciones adecuadas para las especies de coral utilizadas.
   NOTA: En el presente estudio, las condiciones fueron 40 PSU de agua de mar filtrada a 26 °C y un ciclo de luz de 12 h.
4. Abra las placas de Petri al menos una vez a la semana para renovar el agua y limpiar los platos. Este paso es importante para eliminar el crecimiento excesivo de algas que pueden competir o dañar los pólipos de coral al liberar localmente compuestos tóxicos.

5. Mantenimiento de pólipos en incubadoras

1. Seleccione pólipos viables como se describe en el paso 4.1.
2. Coloque los pólipos en matraces de celdas de superficie de 75 cm² llenos de 50 ml de agua de mar isosmótica utilizando pipetas de transferencia.
   NOTA: En el trabajo actual, el agua de mar filtrada recolectada del Mar Rojo se utilizó para el mantenimiento de pólipos. Se puede utilizar agua con las mismas características que la utilizada en el Paso 1.2.
3. Cierre los matraces y muévalos a las incubadoras. Ajuste las incubadoras a ciclos de luz de 12 h a 26 °C y 40 rpm. Intercambie el 50% del volumen de agua cada 4 días y transfiera el contenido a matraces limpios cuando / si se llenan de algas o biopelículas en las paredes.
   NOTA: Las imágenes fueron capturadas con un sistema de zoom totalmente apocromático equipado con una cámara HD (ver Tabla de Materiales) para los resultados representativos.

El rescate de pólipos fue inducido en fragmentos de coral pertenecientes a una sola colonia de la especie P. verrucosa siguiendo tres métodos diferentes (Figura 1). El rescate inducido por la alta salinidad después de la evaporación del agua se completó después de 24 h de incubación de fragmentos de coral en placas de Petri a temperatura ambiente llenas de agua inicialmente a 40 PSU, que luego alcanzó una salinidad final de 59 PSU una vez finalizado el proceso (Figura 2A-C, I). El rescate por suministro de agua salada también se alcanzó después de 24 h de incubación en agua inicialmente a 40 PSU que alcanzó una salinidad de 52 PSU después de 12 h y 59 PSU al final del proceso, después de 24 h (Figura 2D-F, I). En ambos experimentos, un aumento en la salinidad fue responsable de la inducción de la digestión de los tejidos por los pólipos. Después de 12 h, la condición de alta salinidad causó la contracción de los pólipos junto con el adelgazamiento gradual del coenosarc, causando finalmente el desprendimiento final de los pólipos después de 24 h. La inducción de rescate a través de la incubación en agua de mar libre de calcio se completó después de una incubación de 3 horas en CaFSW seguida de una incubación de 20 horas en el medio DMEM al 20% (Figura 2G-H). El tejido se separó del esqueleto en los tres métodos después de empujarlo con una pipeta hasta que se generaron pólipos de coral individualizados (Figura 3A-C) y "bolas de tejido".

Después del desprendimiento, los pólipos de los tres métodos se recolectaron y se les permitió recuperarse en agua de mar antes de asignarse a placas de Petri cubiertas con redes o matraces celulares. Los pólipos obtenidos de la evaporación y los métodos de suministro de agua se mantuvieron en placas de Petri dentro de acuarios y sobrevivieron durante 6 semanas y 8 semanas, respectivamente (Figura 3D y Figura 3F). Estos micropropagados conservaron la anatomía habitual de los pólipos, presentando tentáculos, discos basales y bocas1. Los pólipos obtenidos a través de la incubación en agua de mar libre de calcio tuvieron una vida útil corta, sobreviviendo hasta 1 día, después de lo cual su tejido se disoció. Los pólipos obtenidos del método de evaporación de agua de mar mantenidos en matraces de cultivo celular dentro de incubadoras sobrevivieron hasta 3 semanas sin disociación de tejidos (Figura 3F). En todos los casos, a pesar de que los pólipos no podían adherirse al sustrato, estaban visualmente sanos y mantenían su color, con células de zooxantelas aún visibles dentro de sus tejidos1.

Figura 1: Representación esquemática de las tres metodologías diferentes probadas para la inducción de rescate de pólipos (izquierda) seguida de la ilustración de dos métodos para mantener los pólipos adquiridos en condiciones de laboratorio (derecha). (A) Representación de la metodología para el rescate de pólipos por evaporación de agua. B) Representación de la metodología para el rescate de pólipos mediante el suministro de agua de mar de alta salinidad. (C) Representación de la metodología para el rescate de pólipos mediante la incubación de agua de mar libre de calcio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imágenes del proceso de rescate de pólipos inducido por tres metodologías diferentes utilizando fragmentos de la especie coralina P. verrucosa. (A-C) Un fragmento de coral a las 0 h, 12 h y 24 h después de la incubación, respectivamente, en una placa de Petri utilizando el método de evaporación de agua. (D-F) Un fragmento de coral a las 0 h, 12 h y 24 h después de la incubación, respectivamente, utilizando el método de suministro de agua de mar de alta salinidad. (G,H) Fragmentos de coral expuestos al método de incubación de agua de mar libre de calcio antes y después, respectivamente. Las incubaciones en agua de mar artificial libre de calcio fueron durante 3 h y en DMEM al 20% durante 21 h. (I) Representación gráfica de los valores de salinidad en la fuente de alimentación del agua de mar a lo largo del tiempo durante la evaporación del agua y los métodos de inducción de rescate del suministro de agua de mar de alta salinidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes de pólipos de P. verrucosa obtenidas de los tres procedimientos de inducción de rescate demostrados. (A-C) Las imágenes de los pólipos obtenidos de los métodos de evaporación, suministro de agua salada y agua de mar libre de calcio, respectivamente, se capturaron inmediatamente después de que se separaron del esqueleto. (D) La imagen de un pólipo de coral obtenida del método de evaporación después de sobrevivir 6 semanas en una placa de Petri. (E) La imagen de un pólipo de coral obtenida del método de suministro de agua salada después de sobrevivir 8 semanas en una placa de Petri. (F) La imagen de un pólipo de coral obtenida del método de evaporación después de sobrevivir 3 semanas en un matraz de cultivo celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.