El objetivo de este manuscrito es describir el modelo de ratón KitV558Δ/+ y las técnicas para la disección y el procesamiento exitosos de especímenes de ratón.
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Artículo de método
Técnicas moleculares e inmunológicas en un modelo de ratón genéticamente modificado de tumor del estroma gastrointestinal
En este artículo
Resumen
Resumen
El tumor del estroma gastrointestinal (GIST) es el sarcoma humano más común y generalmente es impulsado por una sola mutación en el receptor KIT. En todos los tipos de tumores, se han desarrollado numerosos modelos de ratón para investigar la próxima generación de terapias contra el cáncer. Sin embargo, en GIST, la mayoría de los estudios in vivo utilizan modelos de ratón de xenoinjerto que tienen limitaciones inherentes. Aquí, describimos un modelo de ratón inmunocompetente y genéticamente modificado de tumor del estroma gastrointestinal que alberga una mutación KitV558Δ / + . En este modelo, el KIT mutante, el oncogén responsable de la mayoría de los GIST, es impulsado por su promotor endógeno que conduce a un GIST que imita la apariencia histológica y el infiltrado inmune visto en los GIST humanos. Además, este modelo se ha utilizado con éxito para investigar tanto terapias moleculares como inmunes dirigidas. Aquí, describimos la cría y el mantenimiento de una colonia de ratones KitV558Δ / + . Además, este documento detalla el tratamiento y la obtención de GIST, el drenaje del ganglio linfático mesentérico y el ciego adyacente en ratones KitV558Δ / + , así como la preparación de muestras para análisis moleculares e inmunológicos.
Introducción
GIST es el sarcoma más común en humanos con una incidencia de aproximadamente 6.000 casos en los Estados Unidos de América1. El GIST parece originarse en las células marcapasos gastrointestinales llamadas células intersticiales de Cajal, y generalmente es impulsado por una sola mutación en la tirosina quinasa KIT o PDGFRA2. La cirugía es el pilar del tratamiento para el GIST y puede ser curativa, pero los pacientes con enfermedad avanzada pueden ser tratados con el inhibidor de la tirosina cinasa (TKI), imatinib. Desde su introducción hace más de 20 años, imatinib ha transformado el paradigma de tratamiento en GIST, mejorando la supervivencia en enfermedad avanzada de 1 a más de 5 años 3,4,5. Desafortunadamente, imatinib rara vez es curativo debido a mutaciones KIT adquiridas, por lo que se necesitan nuevos tratamientos para este tumor.
Los modelos de ratón son una importante herramienta de investigación en la investigación de nuevas terapias en cáncer. Se han desarrollado e investigado múltiples modelos de xenoinjerto subcutáneo y xenoinjerto derivado del paciente en GIST 6,7. Sin embargo, los ratones inmunodeficientes no representan completamente el GIST humano, ya que los GIST albergan perfiles inmunes diferenciales dependiendo de su mutación oncogénica, y la alteración del microambiente tumoral gastrointestinal mejora los efectos de la terapia TKI 8,9. El ratón KitV558Δ/+ tiene una deleción heterocigota de la línea germinal en el exón Kit 11, que codifica el dominio yuxtamembrana, el sitio más comúnmente mutado en GIST10 humano. Los ratones KitV558Δ/+ desarrollan un GIST cecal único con penetrancia del 100%, y los tumores tienen histología, señalización molecular, infiltración inmune y respuesta a la terapia similares a GISThumanos 8,11,12,13. Aquí, describimos la cría, el tratamiento y el aislamiento y procesamiento de muestras en ratones KitV558Δ / + para su uso en investigación molecular e inmunológica en GIST.
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Protocolo
Todos los ratones fueron alojados en condiciones libres de patógenos en la Universidad de Pensilvania de acuerdo con las pautas de los NIH y con la aprobación de la Universidad de Pensilvania IACUC. La eutanasia se realizó siguiendo los procedimientos operativos estándar de Recursos Animales de Laboratorio de la Universidad de Pensilvania.
1. KitV558Δ / + cría de ratones
- Retrocruce los ratones KitV558Δ/+ más de 10 veces sobre un fondo C57BL/6J utilizando ratones C57BL/6J. Para hacer esto, críe los ratones machos KitV558Δ / + con ratones hembra C57BL / 6J en una proporción de 1: 2.
NOTA: El genotipo homocigoto Kit V558Δ/V558Δ es letal en el útero. Es posible criar ratones hembra KitV558Δ / + con ratones machos C57BL / 6J, pero el tamaño de la camada es aproximadamente la mitad que el visto en ratones hembras de tipo salvaje C57BL / 6J. Además, los ratones hembra KitV558Δ / + producen camadas limitadas después de los 4 meses de edad. - Genotipar a las crías a los 7-14 días de edad mediante el recorte de los dedos de los pies para confirmar la presencia del genotipo KitV558Δ/+ . Utilice la imprimación delantera: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; reportero 1: CCTCGACAACCTTCCA; imprimación inversa: TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT; y reportero 2: TCTCCTCGACCTTCCA para genotipado.
2. KitV558Δ/+ tratamiento de ratón
- La edad y el sexo coinciden con los ratones KitV558Δ / + antes del tratamiento. Use los ratones emparejados por edad y sexo en cohortes, ya que los tumores de ratones hembra KitV558Δ / + son más grandes que los de ratones machos. Tratar a los ratones a las 8-12 semanas de edad, momento en el que se establecen los tumores (Figura 1).
- Administrar inhibidores de la tirosina cinasa por vía oral o por inyección intraperitoneal (i.p.); Los tumoresKit V558Δ/+ son sensibles a los inhibidores de la tirosina cinasa. Proporcionar imatinib en una dosis de 600 mg/L en agua potable o inyecciones i.p. de 45 mg/kg dos veces al día. Medir la reducción de peso del tumor utilizando básculas digitales después de la disección del tumor como se muestra en el paso 3, que es de aproximadamente el 50% a la semana 1 y el 80% a las 4 semanas después del tratamiento con imatinib (Figura 2).
3. KitV558Δ / + cosecha de órganos de ratón
- Sacrificar ratones por narcosis de CO2 a un caudal del 60% de volumen de la cámara por minuto. Deje a los ratones en la cámara durante al menos 2 minutos después de que la respiración haya cesado, luego realice una dislocación cervical para confirmar la muerte.
- Esterilice todos los instrumentos, use guantes durante todo el procedimiento y mantenga un campo estéril. Preparar la piel con etanol al 70%. Haga una incisión vertical de 2 cm en la línea media con tijeras y entre en la cavidad abdominal. Lisa bruscamente cualquier adherencia intraabdominal.
- Para extirpar el ganglio linfático mesentérico drenante, siga los pasos que se describen a continuación.
- Identifique el ciego y levante su mesenterio de manera superior. Aproximadamente a mitad de camino a la base del mesenterio colónico, identifique el ganglio linfático mesentérico y diseccionarlo bruscamente. El ganglio linfático es blanquecino y de aproximadamente 0,5 cm x 0,5 cm de tamaño.
- Divida el tejido de los ganglios linfáticos en tercios para el aislamiento de proteínas, histología y suspensión de células individuales, según sea necesario. Para suspensiones unicelulares, coloque el tejido de los ganglios linfáticos en 20 ml de medios libres de suero (RPMI) y manténgalo en hielo.
- Para el aislamiento del GIST y el ciego, siga los pasos que se describen a continuación.
- El ciego en los ratones KitV558Δ /+ es reemplazado principalmente por un GIST. Divida cuidadosamente la unión ileocólica de la base del tumor. Para recoger el ciego, divida el colon de nuevo, 2 cm proximal a la base del tumor.
- En el 50%-60% de los ratones KitV558Δ/+ , la cabeza del tumor contiene una tapa de tejido cecal, que generalmente contiene líquido seroso, pero rara vez puede contener pus (Figura 3). Diseccionar bruscamente el tejido de la tapa lejos del tejido tumoral.
- Divida el tejido tumoral y / o el ciego en tercios para el aislamiento de proteínas, histología y suspensión de una sola célula, según sea necesario. Para suspensiones unicelulares, coloque el tejido tumoral o el ciego en HBSS con 2% de FCS, suficiente para cubrir la muestra y mantenerla en hielo.
4. Análisis de Western blot del tejido GIST
- Preparar tampón de lisis tisular que contenga 50 mM TrisHCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% detergente no desnaturalizante, 2 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 10 mM NaF y 20 μl/ml de mezcla inhibidora de la proteinasa.
- Prepare una solución salina tamponada 1x Tris con Tween 20 al 1% (TBST) combinando 1800 ml de agua desionizada, 2 ml de Tween 20 y 200 ml de solución salina tamponada tris (TBS) 10 veces.
- Resuspenda el tejido del paso 3.4.3 en un tubo FACS en 5 ml/g de tampón de lisis tisular y homogeneizar dos veces con un homogeneizador mecánico a 15.000 rpm durante 15 s sobre hielo. Incubar lisado durante 30 min sobre hielo.
- Transfiera el lisado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrífuga a velocidad máxima durante 20 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga.
- Ejecute lisados en un gel de gradiente de 4% a 15%, luego transfiera a una membrana de nitrocelulosa, como se describe en14.
- Lave la membrana una vez en 1x TBS durante 5 min y luego bloquee la membrana en leche al 5% durante 1 h. Nuevamente, lave la membrana una vez en 1x TBS durante 10 min.
- Incubar membrana en anticuerpo primario diluido 1:1000 en BSA al 5% a 4 °C durante la noche. Lave la membrana 3x en 1x TBST durante 10 min cada una. Incubar blot con anticuerpo secundario diluido 1:2500 en leche al 2,5% durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lave la membrana una vez en 1x TBS durante 5 min. Agregue suficiente sustrato HRP para cubrir la membrana, generalmente 200-500 μL, y use un generador de imágenes digital para detectar y cuantificar la quimioluminiscencia.
5. Inmunohistoquímica del tejido GIST
- Fije el tejido del paso 3.3.2 o 3.4.3 en paraformaldehído al 4% a 4 °C durante la noche. Almacene el tejido en 70% de EtOH hasta que esté listo para el procesamiento. Incrustar y sección bloques de 5 μm de espesor en portaobjetos de vidrio, como se describe15,16.
- Detección inmunohistoquímica completa mediante un kit básico de inmunodetección, como se describió anteriormente17.
6. Suspensión unicelular del ganglio linfático mesentérico
- Vierta el medio RPMI con una muestra de ganglios linfáticos del paso 3.3.2 sobre un filtro de 100 μm. Mueva el filtro a un nuevo ganglio linfático cónico de 50 ml y puré con el extremo blando de una jeringa de plástico de 3 ml. Filtro de lavado con 20 mL de soporte RPMI.
- Centrifugar el filtrado a 450 x g a 4 °C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
- Resuspend pellet en 20 mL de 1% FBS en PBS (bead buffer) y vierte sobre un filtro de 40 μm. Recoger el filtrado celular. Cuente las células con un hemocitómetro.
- Centrifugar el filtrado a 450 x g a 4 °C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante. Resuspend en tampón de perlas a 6 x 107 células/ml para citometría de flujo.
7. Suspensión unicelular de GIST
- Prepare el tampón de colagenasa agregando 250 mg de colagenasa IV, una tableta de inhibidor de la proteasa libre de EDTA y 100 μL de DNasa I a 50 ml de HBSS. Girar durante 10 min a temperatura ambiente hasta que se disuelva.
- Coloque GIST en un plato estéril y agregue 2.5 ml de tampón de colagenasa. Picar el tumor usando un bisturí estéril y tijeras hasta que el tumor esté en fragmentos finos. Use una pipeta de orificio grande para aspirar el tumor y la colagenasa en un tubo de 50 ml.
- Incubar en una incubadora de agitación a 100 rpm a 37 °C durante 30 min. Reacción de enfriamiento con 2 mL de FBS.
- Vierta la colagenasa con una muestra de GIST sobre un filtro de 100 μm y triture el tumor con el extremo blando de una jeringa de plástico de 3 ml y recójala en un tubo de 50 ml. Filtro de lavado con 20 mL de HBSS. Centrifugar el filtrado a 450 x g, 4 °C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet en 20 ml de tampón de perlas y vierta sobre un filtro de 40 μm. Recoge el filtrado y cuenta las células usando un hemocitómetro. Centrifugar el filtrado a 450 x g, 4 °C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante. Resuspend en tampón de perlas a 6 x 107 células/ml para citometría de flujo.
8. Suspensión unicelular de ciego
- Prepare el tampón de colagenasa como en el paso 7.1. Usando tijeras, divida el ciego longitudinalmente para exponer la mucosa interna. Cortar en secciones de 0,5 cm y colocar en un tubo de 50 ml con 5 ml de HBSS con 2% de FBS. Agitar vigorosamente durante 30 s, centrifugar a 450 x g durante 20 s, luego aspirar el sobrenadante.
- Añadir 5 mL de HBSS con 2 mM de EDTA. Incubar en una incubadora de agitación a 37 °C a 100 rpm durante 15 min. Centrífuga a 450 x g durante 20 s. Aspirar el sobrenadante.
- Agregue 5 ml de HBSS. Agitar vigorosamente durante 30 s, centrifugar a 450 x g durante 20 s, luego aspirar el sobrenadante. Repite una vez más.
- Añadir 5 ml de tampón de colagenasa. Incubar en una incubadora de agitación a 37 °C durante 30 min a 100 rpm. Agitar vigorosamente cada 10 min. Reacción de enfriamiento con 2 mL de FBS.
- Vierta la colagenasa con una muestra de ciego sobre un filtro de 100 μm y triture con el extremo blando de una jeringa de plástico de 3 ml. Filtro de lavado con 20 mL de HBSS. Recoger filtrado.
- Centrifugar el filtrado a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante. Resuspenda la bolita en 20 ml de tampón de perlas y vierta sobre un filtro de 40 μm. Recolecte el filtrado y cuente las células usando un hemocitómetro.
- Centrifugar el filtrado a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante. Resuspend en tampón de perlas a 6 x 107 células/ml para citometría de flujo.
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Resultados
El modelo de ratón KitV558Δ/+ permite la investigación terapéutica en un modelo de ratón inmunocompetente. Los ratones KitV558Δ/+ tienen una vida útil promedio de 8 meses debido a la obstrucción intestinal progresiva (Figura 4). Los tumores de ratones KitV558Δ/+ expresan marcadores canónicos de GIST incluyendo la tirosina quinasa KIT y el canal transmembrana DOG1 (
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Discusión
El modelo de ratón KitV558Δ/+ es una poderosa herramienta de investigación en el análisis molecular e inmunológico de GIST. Aunque la estrategia de mejoramiento requiere un solo cruce, el uso de cohortes de ratones KitV558Δ / + en experimentos que analizan la respuesta tumoral requiere una reproducción extensa. Los ratones deben ser emparejados por edad y sexo para garantizar pesos tumorales similares, y el 10% de los ratones mueren antes de las 8 semanas de edad cuando se establec...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Los ratones KitV558Δ/+ fueron modificados genéticamente y compartidos por el Dr. Peter Besmer10. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01 CA102613 y T32 CA251063.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Filtro de 100 micras | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x tampón de lisis RBC | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| jeringa de 3 ml | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4– 15% Mini-PROTEAN TGX Geles de Proteínas Prefabricadas, 10 pocillos, 30 y micro; l | Bio-Rad | 4561083 | |
| de paraformaldehído al 4% | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| filtro de 40 micras | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| filtro de 70 micras | EMSCO | 1194-2350 | |
| anticuerpo AKT (C67E7) | Señalización celular | 4691 | |
| Ratones C57BL/6J | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenasa IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Mini inhibidor completo de la proteasa libre de EDTA | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Contador de células automatizado | Thermo Fisher Scientific | ||
| Bisturíes desechables | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 anticuerpo | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK anticuerpo (p44/42) | Señalización celular | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogeneizador | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | Centro Celular | ||
| Mesilato de imatinib | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT anticuerpo (D13A2) | Señalización celular | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotipado | Transnetyx | ||
| Tubos de microcentrífuga (1,5 ml) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Kit de inmunodetección de ratón sobre ratón, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Membrana de nitrocelulosa, precortada, 0,45 y micro; m | Rio-Rad | 1620145 | |
| Leche en polvo descremada | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Sustituto | Sigma Aldrich | 74385 | |
| anticuerpo p-AKT (S473) | Señalización celular | 4060 | |
| anticuerpo p-ERK (p44/42) | Señalización celular | 9101 | |
| anticuerpo p-KIT (Y719) | Señalización celular | 3391 | |
| PMSF Inhibidor de la proteasa | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Tubos de prueba de poliestireno de fondo redondo (FACS) | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | de la Universidad de Pensilvania | ||
| Fluoruro de sodio (NaF) | Sigma Aldrich | ||
| Ortovanadato de sodio (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Tampón Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS (10x) | Centro de células | ||
| Placa de cultivo de tejidos (100 mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific BP1757500 | ||
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| plataforma vivaCT 80 | Scanco medical |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
