Técnicas moleculares e inmunológicas en un modelo de ratón genéticamente modificado de tumor del estroma gastrointestinal

Summary

El objetivo de este manuscrito es describir el modelo de ratón Kit^V558Δ/+ y las técnicas para la disección y el procesamiento exitosos de especímenes de ratón.

Abstract

El tumor del estroma gastrointestinal (GIST) es el sarcoma humano más común y generalmente es impulsado por una sola mutación en el receptor KIT. En todos los tipos de tumores, se han desarrollado numerosos modelos de ratón para investigar la próxima generación de terapias contra el cáncer. Sin embargo, en GIST, la mayoría de los estudios in vivo utilizan modelos de ratón de xenoinjerto que tienen limitaciones inherentes. Aquí, describimos un modelo de ratón inmunocompetente y genéticamente modificado de tumor del estroma gastrointestinal que alberga una mutación Kit^{V558Δ / +} . En este modelo, el KIT mutante, el oncogén responsable de la mayoría de los GIST, es impulsado por su promotor endógeno que conduce a un GIST que imita la apariencia histológica y el infiltrado inmune visto en los GIST humanos. Además, este modelo se ha utilizado con éxito para investigar tanto terapias moleculares como inmunes dirigidas. Aquí, describimos la cría y el mantenimiento de una colonia de ratones Kit^{V558Δ / +} . Además, este documento detalla el tratamiento y la obtención de GIST, el drenaje del ganglio linfático mesentérico y el ciego adyacente en ratones Kit^{V558Δ / +} , así como la preparación de muestras para análisis moleculares e inmunológicos.

Introduction

GIST es el sarcoma más común en humanos con una incidencia de aproximadamente 6.000 casos en los Estados Unidos de América¹. El GIST parece originarse en las células marcapasos gastrointestinales llamadas células intersticiales de Cajal, y generalmente es impulsado por una sola mutación en la tirosina quinasa KIT o PDGFRA². La cirugía es el pilar del tratamiento para el GIST y puede ser curativa, pero los pacientes con enfermedad avanzada pueden ser tratados con el inhibidor de la tirosina cinasa (TKI), imatinib. Desde su introducción hace más de 20 años, imatinib ha transformado el paradigma de tra....

Protocol

Todos los ratones fueron alojados en condiciones libres de patógenos en la Universidad de Pensilvania de acuerdo con las pautas de los NIH y con la aprobación de la Universidad de Pensilvania IACUC. La eutanasia se realizó siguiendo los procedimientos operativos estándar de Recursos Animales de Laboratorio de la Universidad de Pensilvania.

1. Kit^{V558Δ / +} cría de ratones

1. Retrocruce los ratones Kit^V558Δ/+ más de 10 veces sobre un fondo C57BL/6J utilizando ratones C57BL/6J. Para hacer esto, críe los ratones machos Kit^{V558Δ / +} c....

Results

El modelo de ratón Kit^V558Δ/+ permite la investigación terapéutica en un modelo de ratón inmunocompetente. Los ratones Kit^V558Δ/+ tienen una vida útil promedio de 8 meses debido a la obstrucción intestinal progresiva (Figura 4). Los tumores de ratones Kit^V558Δ/+ expresan marcadores canónicos de GIST incluyendo la tirosina quinasa KIT y el canal transmembrana DOG1 (

Discussion

El modelo de ratón Kit^V558Δ/+ es una poderosa herramienta de investigación en el análisis molecular e inmunológico de GIST. Aunque la estrategia de mejoramiento requiere un solo cruce, el uso de cohortes de ratones Kit^{V558Δ / +} en experimentos que analizan la respuesta tumoral requiere una reproducción extensa. Los ratones deben ser emparejados por edad y sexo para garantizar pesos tumorales similares, y el 10% de los ratones mueren antes de las 8 semanas de edad cuando se establec.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filtro de 100 micras	EMSCO	1194-2360
1x tampón de lisis RBC	Life Technologies	00-4333-57
jeringa de 3 ml	Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences	14823435
4– 15% Mini-PROTEAN TGX Geles de Proteínas Prefabricadas, 10 pocillos, 30 y micro; l	Bio-Rad	4561083
de paraformaldehído al 4%	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
filtro de 40 micras	EMSCO	1194-2340
5M NaCl	Sigma Aldrich	S6546
filtro de 70 micras	EMSCO	1194-2350
anticuerpo AKT (C67E7)	Señalización celular	4691
Ratones C57BL/6J	The Jackson Laboratory
Collagenasa IV	Sigma Aldrich	C5138
Mini inhibidor completo de la proteasa libre de EDTA	Thomas Scientific	C852A34
Countess II Contador de células automatizado	Thermo Fisher Scientific
Bisturíes desechables	Thermo Fisher Scientific/Exel International	14-840-00
Dnase I	Thomas Scientific	C756V81
Dog1 anticuerpo	abcam	ab64085
EDTA	Sigma Aldrich	E9884
ERK anticuerpo (p44/42)	Señalización celular	9102
FBS	Thomas Scientific	C788U23
FIJI software	FIJI		https://imagej.net/software/fiji
Fisherbrand 850 Homogeneizador	Thermo Fisher Scientific	15-340-169
HBSS	Centro Celular
Mesilato de imatinib	Selleck Chemicals	S1026
KIT anticuerpo (D13A2)	Señalización celular	3074
KitV558Δ/+ Genotipado	Transnetyx
Tubos de microcentrífuga (1,5 ml)	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Kit de inmunodetección de ratón sobre ratón, Basic	Vector Laboratories	BMK-2202
Membrana de nitrocelulosa, precortada, 0,45 y micro; m	Rio-Rad	1620145
Leche en polvo descremada	Thermo Fisher Scientific	NC9121673
Nonidet P 40 Sustituto	Sigma Aldrich	74385
anticuerpo p-AKT (S473)	Señalización celular	4060
anticuerpo p-ERK (p44/42)	Señalización celular	9101
anticuerpo p-KIT (Y719)	Señalización celular	3391
PMSF Inhibidor de la proteasa	Thermo Fisher Scientific	36978
Proeinase K	Thermo Fisher Scientific	BP170050
Tubos de prueba de poliestireno de fondo redondo (FACS)	Falcon/Thermo Fisher Scientific	14-959-2A
RPMI			de la Universidad de Pensilvania
Fluoruro de sodio (NaF)	Sigma Aldrich
Ortovanadato de sodio (Na3VO4)	Sigma Aldrich	S6508
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	Tampón Thermo Fisher Scientific	34076
TBS (10x)	Centro de células
Placa de cultivo de tejidos (100 mm2)	Thermo Fisher Scientific/Falcon	08-772E
TrisHCL	Thermo Fisher Scientific BP1757500
Tween 20	Rio-Rad	1706531
plataforma vivaCT 80	Scanco medical