El presente protocolo describe un método simple para aislar preadipocitos del tejido adiposo en embriones de pollos de engorde. Este método permite el aislamiento con alto rendimiento, cultivo primario y diferenciación adipogénica de preadipocitos. La tinción de aceite Rojo O y la tinción de lípidos /ADN midieron la capacidad adipogénica de las células aisladas inducidas con medios de diferenciación.
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Artículo de método
Aislamiento de preadipocitos de embriones de pollos de engorde
En este artículo
Resumen
Resumen
Los preadipocitos primarios son un valioso sistema experimental para comprender las vías moleculares que controlan la diferenciación y el metabolismo de los adipocitos. Los embriones de pollo brindan la oportunidad de aislar los preadipocitos desde la etapa más temprana del desarrollo adiposo. Esta célula primaria se puede utilizar para identificar factores que influyen en la proliferación de preadipocitos y la diferenciación adipogénica, lo que los convierte en un modelo valioso para estudios relacionados con la obesidad infantil y el control del exceso de deposición de grasa en aves de corral. El rápido crecimiento del tejido adiposo postnatal desperdicia efectivamente el alimento al asignarlo lejos del crecimiento muscular en pollos de engorde. Por lo tanto, los métodos para comprender las primeras etapas del desarrollo del tejido adiposo pueden proporcionar pistas para regular esta tendencia e identificar formas de limitar la expansión adiposa temprano en la vida. El presente estudio fue diseñado para desarrollar un método eficiente para el aislamiento, el cultivo primario y la diferenciación adipogénica de preadipocitos aislados del tejido adiposo en desarrollo de embriones comerciales de pollos de engorde (tipo carne). El procedimiento se ha optimizado para producir células con alta viabilidad (~ 98%) y una mayor capacidad para diferenciarse en adipocitos maduros. Este método simple de aislamiento, cultivo y diferenciación de preadipocitos embrionarios apoya los análisis funcionales del crecimiento y desarrollo de la grasa en los primeros años de vida.
Introducción
La obesidad es una amenaza para la salud mundial tanto para adultos como para niños. Los niños con sobrepeso u obesidad tienen aproximadamente cinco veces más probabilidades de ser obesos como adultos, lo que los coloca en un riesgo significativamente mayor de enfermedad cardiovascular, diabetes y muchas otras comorbilidades. Alrededor del 13.4% de los niños estadounidenses de 2 a 5 años de edad tienen obesidad1, lo que ilustra que la tendencia a acumular exceso de grasa corporal puede ponerse en marcha muy temprano en la vida. Por razones muy diferentes, la acumulación de exceso de tejido adiposo es una preocupación para los pollos de engorde ....
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Protocolo
Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Tennessee. Los huevos de pollo de engorde comerciales recién fertilizados (Cobb 500) se obtuvieron de un criadero local. Los huevos se incubaron a 38 °C con un 60% de humedad relativa hasta las disecciones en los días embrionarios 16-18 (E16-E18). El tejido adiposo se recogió del depósito subcutáneo (femoral).
1. Preparación para el aislamiento y la cultura
- Prepara la campana de cultivo y los instrumentos.
- Antes de comenzar las disecciones, configure un área de trabajo en la c....
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Resultados
Los preadipocitos primarios son morfológicamente similares a los fibroblastos, con formas irregulares en forma de estrella y un núcleo central (Figura 2A-C). Las células se adhieren fácilmente al plástico de cultivo de tejidos y comienzan a proliferar poco después de la unión. Se diferencian rápidamente y acumulan gotas lipídicas (Figura 3D) cuando se les proporcionan ácidos grasos en los medios. La viabilidad (98%, basada en la.......
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Discusión
Aunque varios protocolos bien descritos han reportado el aislamiento de preadipocitos 14,15,16,17, se ha optimizado el aislamiento para preadipocitos embrionarios, que pueden usarse para análisis funcionales del crecimiento y desarrollo de grasa en la vida temprana en pollitos de engorde. Este protocolo produce progenitores de adipocitos embrionarios de alta viabilidad con alto potencial de dif.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a UT AgResearch y al Departamento de Ciencia Animal por apoyar y optimizar este protocolo. Este trabajo fue financiado por una subvención del USDA.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pipeta | de 1 mL Eppendorf | Z683825 | Pipeta monocanal, 100 - 1000 y micro; L |
| 1 mL Punta de pipeta | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Matraz | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehído | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| Placa de 6 pocillos | Falcon | 353046 | Placa de |
| ensayo de 96 pocillos | Costar | 3632 | |
| Placa de 96 pocillos, fondo negro | Costar | 3603 | AdipoRed |
| Lonza | PT-7009 | Adipotricina | |
| B | Gibco | 15290026 | |
| Limpiaparabrisas de sobremesa (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Arriba & | Subir NDC 1167300334 | 20% Solución de trabajo |
| Contador de celdas | Corning | 6749 | |
| Filtro de celdas, 40 µ m | SPL | 93040 | |
| Centrífuga | Eppendorf | 5702 | |
| Suero de pollo | Gibco | 16110082 | |
| Tubos de centrífuga cónicos, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Tubos de centrífuga cónicos, 50 mL | Pinza curva Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| 100 mm | Tijeras quirúrgicas | Roboz Surgical RS-5137 | |
| 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Millipore | agua destilada | SYNSV0000 | Diseñado según sea necesario |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Etanol | Decon Labs | 2701 | 70% Solución de trabajo |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Microscopio fluorescente | EVOS | M7000 | |
| Lector de placas fluorescentes | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds Reynolds Wrap Papel de aluminio de alta resistencia, 125 SQ. FT. | ||
| Recipiente de congelación | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatina | Millipore | 4055 | Solución de trabajo al 2% |
| Hematocitómetro (cámara de recuento) | Corning | 480200 | 0,1 mm de profundidad |
| Incubadora | Fisher Scientific | 6845 | |
| Esterilizador de instrumentos | VWR | B1205 | |
| Ácido linoleico-Oleico ácido-albúmina | Sigma | L9655 | 1x solución de trabajo |
| Microscopio | Evos | AMEX1000 | |
| Pipeta multicanal | Thermo Scientific | 4661070 | Pipetas de 12 canales, 30 - 300 µ L |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Aceite Rojo O | Sigma | O-0625 | |
| Agitador Orbital | IKA | KS130BS1 | |
| Toalla de papel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicilina/Steptomicina (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x solución de trabajo |
| Placas de Petri, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Placas de Petri, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Agitador de placas | Tampón | 200 | |
| RBC | Roche | 11814389001 | |
| Reactivo Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Vaso de precipitados pequeño, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Lector de placas de espectrofotómetro | Biotek | Synergy H1 | |
| Gasa estéril | McKesson Pinzas rectas McKesson | 762703 | |
| 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Tijeras rectas, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 | Frasco Corning | 430639 | Incubadora de cultivo de tejidos tratada con cultivo de |
| tejidos | Thermo Scientific | ||
| Colador de tejidos, 250 µ m | Pierce | 87791 | |
| Tinte Azul | Trypan Gibco | 15250061 | |
| Tripsina | Gibco | 15400054 | 0.1% Pinzas de solución de trabajo |
| , 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Tipo 1 Colágeno | Gibco | 17100017 | |
| Baño de agua | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Papel de filtro Whatman Grado 1 Whatman | 1001-110 |
Referencias
- Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
- Siegel, P. B. Evolutio....
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Reimpresiones y permisos
