Summary
这项工作描述了通过挤出破碎制造微凝胶，将微凝胶加工成可注射的颗粒水凝胶，并将颗粒水凝胶用作生物医学应用的挤出印刷油墨的简单，适应性强且低成本的方法。
Abstract
颗粒水凝胶是水凝胶微粒（即“微凝胶”）的堵塞组件。在生物材料领域，颗粒水凝胶具有许多有利的性质，包括注射性，微尺度孔隙率以及通过混合多个微凝胶群体的可调性。制造微凝胶的方法通常依赖于油包水乳液（例如，微流体，批量乳液，电喷雾）或光刻，这可能在资源和成本方面提出很高的要求，并且可能与许多水凝胶不相容。这项工作详细介绍了使用挤出破碎法制造微凝胶的简单而高效的方法，并将其加工成对生物医学应用有用的颗粒水凝胶（例如，3D打印油墨）。首先，将块状水凝胶（以光交联透明质酸（HA）为例）通过一系列直径顺序较小的针挤出以形成碎片状的微凝胶。这种微凝胶制造技术快速，低成本且高度可扩展。描述了通过离心和真空驱动过滤将微凝胶卡入颗粒状水凝胶的方法，并可选配用于水凝胶稳定的后交联。最后，由碎片微凝胶制成的颗粒水凝胶被证明为挤出印刷油墨。虽然这里描述的示例使用光交叉链接HA进行3D打印，但这些方法很容易适应各种水凝胶类型和生物医学应用。
Introduction
颗粒状水凝胶是通过水凝胶颗粒（即微凝胶）的填充而制造的，并且是一类令人兴奋的生物材料，具有许多生物医学应用的优势特性1，2，3。由于其颗粒结构，颗粒水凝胶具有剪切变稀和自愈合，允许它们用作挤出印刷（生物）油墨，用于嵌入式印刷的颗粒状载体和注射治疗剂4，5，6，7，8，9。此外，微凝胶之间的空隙空间为细胞运动和分子扩散提供了微尺度的孔隙率8，10，11。此外，多个微凝胶群体可以组合成单个配方，以允许增强的可调性和材料功能8，10，12，13。这些重要的特性推动了近年来颗粒状水凝胶的快速发展。
有一系列方法可用于形成微凝胶以用于颗粒水凝胶制造，每种方法都有其自身的优点和缺点。例如，微凝胶通常由油包水乳液使用液滴微流体4，11，13，14，15，16，17，间歇乳液7，18，19，20，21，22或电喷雾6，23，24，25.这些方法产生具有均匀（微流体）或多分散（间歇乳液，电喷雾）直径的球形微凝胶。这些油包水乳液制造方法存在一些局限性，包括潜在的低通量生产，对低粘度水凝胶前体溶液的需求，以及设置的高成本和资源。此外，这些方案可能需要刺激性油和表面活性剂，必须使用添加处理步骤的程序从微凝胶中清洗，并且可能难以转化为许多实验室中生物医学应用的无菌条件。为了消除对油包水乳液的需求，也可以使用（光）光刻，其中使用模具或光掩模来控制来自水凝胶前体溶液1，26，27的微凝胶的固化。与微流体一样，这些方法的生产吞吐量可能有限，这在需要大量时是一个重大挑战。
作为这些方法的替代方法，散装水凝胶的机械破碎已被用于制造不规则尺寸19，28，29，30，31，32的微凝胶。例如，本体水凝胶可以预先形成并随后通过网状物或筛子以形成碎片状微凝胶，该过程甚至在微凝胶链33，34内的细胞存在下完成。散装水凝胶也已使用诸如用研钵和研杵研磨或通过使用商业搅拌机35，36，37等技术加工成具有机械破坏的微凝胶。其他人还在水凝胶形成过程中使用机械搅拌来制造碎片状微凝胶（即流体凝胶）31。
本文的方法扩展了这些机械破碎技术，并提出了一种以光交联透明质酸（HA）水凝胶为例，通过挤出破碎制造微凝胶的简单方法。挤出破碎仅使用注射器和针头以低成本，高通量且易于扩展的方法制造碎片微凝胶，适用于各种水凝胶19，32。此外，使用离心（低填料）或真空驱动的过滤（高填料）来描述将这些碎片状微凝胶组装成颗粒水凝胶的方法。最后，讨论了这些碎片状颗粒水凝胶的应用，以用作挤出印刷油墨。该协议的目标是引入适用于各种水凝胶的简单方法，并且可以在几乎任何对颗粒水凝胶感兴趣的实验室中实施。
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Protocol
1.使用光交联在注射器内制造散装水凝胶
注：使用光交联在注射器内制造散装水凝胶的概述如图 1所示。该方案使用降冰片烯修饰的透明质酸（NorHA）通过光介导的硫醇烯反应制造本体水凝胶。NorHA合成的详细程序在别处38中描述。然而，该方案高度适应任何光交联的水凝胶。有关详细信息，请参阅讨论。
- 预先确定用于本体水凝胶制剂的聚合物、交联剂和引发剂的所需浓度。在该方案中，水凝胶前体溶液由NorHA（2重量%，〜25%度的降冰片烯修饰），二硫舒酯醇（DTT，6mM）和Irgacure D-2959（I2959，0.05重量%）组成。确保组分（1 mL）完全溶解在微量离心管内的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
注意：在制备水凝胶前体溶液时，可以将高分子量FITC-葡聚糖（2 MDa，0.1 wt.%）添加到溶液中，以可视化稍后使用荧光显微镜在方案中制造的微凝胶。 - 用水凝胶前体溶液加载3 mL注射器。
- 从空的3 mL注射器背面取下柱塞，并在注射器桶的顶部添加一个吸头盖。
- 使用1，000μL移液器将水凝胶前体溶液转移到带有吸头盖的注射器桶中。
- 一只手握住装有水凝胶前体溶液的注射器桶，尖端盖朝下，桶的开口端朝上。另一方面，将注射器柱塞返回到注射器桶背面的开口处。轻轻地将注射器柱塞推入注射器桶中，刚好足以密封注射器枪管背面的开口。
- 小心地将柱塞和注射器枪管握在一起，以确保注射器枪管的背面与柱塞密封，倒置注射器，使柱塞朝下，并且尖端盖现在朝上。取下吸头盖，轻轻地将柱塞推入注射器桶中，直到所有空气从注射器中除去（仅保留水凝胶前体溶液）。
- 将吸头盖重新连接到注射器上。确保将水凝胶前体溶液固定在带有吸头盖的3 mL注射器内。
- 在3 mL注射器内形成本体水凝胶。
- 在打开紫外线灯之前，请确保采取适当的个人防护装备（PPE）和防护措施。这包括戴防紫外线眼镜并封闭灯区以保护他人免受紫外线照射。
- 使用辐射计将紫外光斑固化灯校准到10 mW/cm2 的光强度。
注意：通过注射器桶会有轻微的衰减。在制造之前，使用辐射计确定存在的光衰减百分比。光点固化系统的光强度输出应相应地进行调整，以考虑这种衰减。 - 将装有水凝胶前体溶液的3mL注射器置于UV点固化灯下所需的时间，以完全光交联。对于本文描述的系统，NorHA水凝胶前体溶液以10 mW / cm2的强度暴露于紫外光5分钟，其基于先前的研究39，有足够的时间和光强度来确保完全交联，如光交联振荡剪切流变时间扫描所确定的那样。
注意：为了确保注射器内完全的光交联，注射器可以在光交联期的一半翻转。 - 关闭紫外线灯并取下注射器。确保水凝胶现在在注射器内光交联。这可以通过拉回柱塞并观察水凝胶作为固体块而不是粘性液体的移动来完成。
图1：使用光交联在注射器内制造散装水凝胶的概述。 该图描绘了（A）从注射器中取出柱塞，（B）将吸头盖固定到注射器桶上，（C）向注射器桶中添加水凝胶前体，（D）将柱塞返回到注射器，（E）去除多余的空气并固定吸头盖，以及（F）在注射器内光交联散装水凝胶。 请点击此处查看此图的大图。
2. 使用挤出破碎法制造微凝胶
注：使用挤出破碎法制备微凝胶的概述如图 2所示。
- 从空的3 mL注射器背面取下柱塞。将吸头盖固定在鲁尔锁上。
- 从含有光交联体水凝胶的注射器中取下吸头盖。将水凝胶注射器的顶部与空注射器上的桶的开口对齐。
- 将散装水凝胶通过注射器开口（未连接针头）挤出到空注射器的桶中。正确丢弃现在空的注射器（以前包含水凝胶）到适当的废物流中。
- 握住含有挤出水凝胶的注射器，使吸头盖朝下，桶开口朝上。使用1，000μL移液器，向注射器桶中加入1.5mL PBS。
- 将注射器柱塞与枪管的开口对齐，只需将柱塞推入足以形成密封即可。反转注射器，使柱塞现在朝下，尖端盖朝上，确保将柱塞和注射器桶固定到位，以免水凝胶或PBS泄漏。多次倒置以将碎片水凝胶与加入PBS混合。
- 握住注射器，使吸头盖朝上，柱塞朝下。取下吸头盖。非常轻轻地向上推柱塞，以清除注射器内部的任何空气。
注意：3 mL 注射器的背面可能会有一个凹槽，需要额外的力才能将柱塞推入。非常小心地将柱塞推过凹槽。任何突然或剧烈的力都会导致柱塞移动得太快，并可能排出碎片状的水凝胶悬浮液。 - 通过一系列针挤出碎片水凝胶悬浮液以产生碎片微凝胶。
- 将钝尖18 G针头固定在装有碎片水凝胶和PBS的注射器顶部。从新鲜的3 mL注射器中取出柱塞，并将吸头盖固定在空的注射器桶中。
- 将碎片水凝胶悬浮液通过18G针头挤出到空注射器桶的背面。将空的注射器和针头丢弃到适当的锐器废物流中。
- 握住含有碎片水凝胶悬浮液的注射器，使尖端盖朝下，桶开口朝上。将注射器柱塞与枪管的开口对齐，只需将柱塞推入足以形成密封即可。
- 反转注射器，使柱塞现在朝下，尖端盖朝上，确保将柱塞和注射器桶固定在一起，以免水凝胶或PBS泄漏出来。
- 握住注射器，使吸头盖朝上，柱塞朝下。取下吸头盖。非常轻轻地向上推柱塞，以清除注射器内部的任何空气。请参阅上面的说明，了解如何轻轻地将注射器柱塞向内推，以防止不必要的水凝胶材料排出。
- 使用 23 G、27 G 和 30 G 针重复步骤 2.7.1-2.7.5。在最后一个挤出步骤（30G针头）中，将碎片水凝胶悬浮液挤出到微量离心管中。对于本文描述的体积，最终的碎片水凝胶悬浮液体积将为〜2.5 mL，需要两个1.5 mL微量离心管（体积平均拆分）。
注意：通过针头挤出碎片状的水凝胶悬浮液不应需要过大的力。为了获得最佳的安全措施，建议在化学罩内执行所有挤出破碎步骤，以便在挤出过程中注射器过压时提供保护。此外，该过程可以在生物安全柜/层流罩中轻松执行，以在制造过程中保持无菌性。有关其他疑难解答建议，请参阅讨论。
- 洗涤并分离碎片水凝胶悬浮液。
注意：洗涤碎片微凝胶将有助于去除任何未反应的聚合物和交联剂。此外，离心将有助于通过形成沉淀从悬浮液中分离出微凝胶。- 使用微量离心机，以5，000× g 旋转碎片微凝胶悬浮液5分钟。
- 使用移液器除去上清液。向每个含有碎片微凝胶的微量离心管中加入1mL PBS并涡旋5-10秒。
- 用PBS 3x重复离心和洗涤。
图2：使用挤出破碎法制造微凝胶的概述。 该图描绘了（A）将散装水凝胶挤出到空注射器桶中并添加PBS，（B）用碎片水凝胶将柱塞固定在注射器中，（C）连接18 G针头并将碎片水凝胶悬浮液挤出到空注射器桶中，以及（D）用23 G，27 G和30 G针头重复挤出破碎步骤， 在最终挤出时将碎片水凝胶悬浮液收集在微量离心管中。 请点击此处查看此图的大图。
3. 使用ImageJ表征碎片微凝胶
注：使用ImageJ表征碎片微凝胶的概述如图 3所示，以及描述一批碎片微凝胶中尺寸分布和形状的代表性结果。微凝胶在可视化之前应进行荧光标记。例如，高分子量的FITC-葡聚糖（2 MDa）可以在破碎之前封装在散装水凝胶中，以产生荧光素标记的微凝胶。
- 将20μL碎片微凝胶悬浮液与180μLPBS混合，形成稀释的碎片微凝胶悬浮液。涡旋彻底混合。
- 将50μL稀释的碎片微凝胶悬浮液转移到玻璃显微镜载玻片中。
- 使用落射荧光显微镜以4倍或10倍变焦获取荧光标记微凝胶的图像。
注意：微凝胶悬浮液应足够稀释，以使相邻的微凝胶不相互接触，但浓度足够高，以便在视口中可见数十个微凝胶。微凝胶悬浮液的稀释度可以相应地调整以实现这一点。 - 使用ImageJ分析碎片化的微凝胶颗粒。有关在 ImageJ 中使用 “分析粒子” 功能的其他信息，请参阅 材料表中提供的链接。
- 在ImageJ中打开悬浮液中的微凝胶图像。
- 选择“分析>设置测量值、检查面积、形状描述符和费雷特直径。单击“确定”。
- 选择“ 图像>类型> 8 位”。
- 选择 图像>调整>阈值。调整阈值，使微凝胶被红色蒙版覆盖，背景保持黑色。单击“ 应用”。
注意：如果任何微凝胶略有重叠，请使用 铅笔工具 在微凝胶之间绘制一条细（<5像素）黑线，以在黑白图像中将它们分开。 - 选择“分析>分析粒子”。将“大小”（像素2）设置为 50-无穷大以降低背景杂色。将“圆度”设置为 0.00-1.00。从下拉菜单中选择显示轮廓。选中显示结果、在边上排除和包括孔。将其余框保留为未选中状态。单击“确定”。
- 将打开结果显示，包括区域，形状描述符和每个识别的微凝胶的Feret直径信息。将结果复制并粘贴到电子表格中。
- 确定每个颗粒的等效圆形直径。
- 从比例尺或仪器信息中获取图像刻度（以μm/像素为单位）。在电子表格中创建一列，将每个微凝胶的面积从像素2 转换为 μm2。
- 使用以μm2 为单位的面积来确定以μm为单位的微凝胶的等效圆形直径（即，取面积除以pi的平方根，然后将其加倍）。
- 使用μm/像素刻度将每个微凝胶的Feret直径（即颗粒边界上任何两点之间的最长距离）转换为μm的单位。
- 每个微凝胶的圆度（“Circ.”），长宽比（“AR”），圆度（“圆形”）和坚固性值可以直接从ImageJ中使用。
- 根据需要分析微凝胶群体，考虑直径（等效圆形和费雷特的分布），圆形度，长宽比，圆度和坚固性。
图3：使用ImageJ表征碎片微凝胶颗粒的概述。 该图描绘了（A）创建碎片微凝胶颗粒的稀悬浮液，并使用落射荧光或共聚焦显微镜对悬浮液中的微凝胶进行成像（比例尺= 500μm），（B）转换为ImageJ中的二进制图像并分析颗粒（计数，形状描述符等），以及（C）代表性结果。误差线描述最小值和最大值，并划分了内部四分位数范围。显示n = 100微凝胶的种群大小。 请点击此处查看此图的大图。
4. 将碎片微凝胶组装成颗粒状水凝胶
注意：提出了两种从碎片微凝胶中配制颗粒水凝胶的方法，使用离心和过滤。使用的方法将取决于所需的微凝胶包装（即，过滤包装颗粒更密集）以及是否包括生物组分（即，离心将保留颗粒之间的组分，而在过滤中这些组分可能会丢失）。先前的工作40 彻底描述了由离心机或真空驱动的过滤形成的颗粒水凝胶的比较结果（即力学，孔隙率）。
- 选项1：使用离心法堵塞碎片状微胶囊。
- 从最后一个洗涤步骤中除去PBS上清液后，向每个微量离心管中加入1mLPBS并重悬微凝胶。
- 将碎片水凝胶悬浮液以18，000× g 旋转5分钟。
注意：如果需要，可以使用较慢的离心机速度将微凝胶卡入密度较低的颗粒水凝胶中。 - 取出PBS上清液。
- 获取新鲜的 3 mL 注射器并取下柱塞。使用金属刮刀将碎粒状水凝胶从微量离心管中舀出，并将其转移到空注射器桶的背面。移液器吸头可用于协助将颗粒状水凝胶转移到注射器中。将柱塞放回注射器。现在将碎片状的颗粒水凝胶装入注射器中，即可使用。
- 选项2：使用真空过滤堵塞碎片微凝胶。真空驱动过滤卡住的概述如图 4所示。
- 组装并测试真空驱动的过滤装置。
- 将 Buchner 漏斗固定在过滤瓶内，将过滤器适配器放在漏斗和烧瓶开口之间。
- 使用管道将过滤瓶连接到真空管路。
- 将膜过滤器（0.22μm）放入Buchner漏斗杯中。
- 通过打开拨阀打开真空管路。通过将约0.5 mL PBS移液到膜过滤器上来测试连接，并观察所有PBS是否通过过滤器并收集在过滤瓶的底部。
- 打开真空管路，确保完全密封。涡旋破碎的水凝胶悬浮液，使微凝胶悬浮在PBS中。
- 使用1，000μL移液器，将碎片水凝胶悬浮液转移到膜过滤器（0.22μm）上。转移整个微凝胶悬浮液后，等待〜30秒，让真空将PBS从碎片水凝胶悬浮液中拉出。关闭真空管路。
注意：在拉真空时，碎片水凝胶悬浮液位于膜过滤器上的时间可能会有所不同。有关详细信息和疑难解答建议，请参阅讨论。 - 获取新鲜的 3 mL 注射器并取下柱塞。使用金属刮刀从过滤器中舀出碎片颗粒状水凝胶，并将其转移到空注射器桶的背面。移液器吸头可用于协助将颗粒状水凝胶转移到注射器中。将柱塞放回注射器。将碎片状的颗粒水凝胶装入注射器中，现在可以使用了。
- 组装并测试真空驱动的过滤装置。
图4：通过真空驱动过滤制造紧密包装的碎片颗粒水凝胶的干扰微凝胶概述。 该图描绘了（A）在真空过滤设备上放置膜过滤器，（B）使用移液器将碎片状微凝胶悬浮液转移到过滤器上，（C）拉真空并等待微凝胶堵塞并形成颗粒状水凝胶，（D）关闭真空并使用金属刮刀除去碎片状颗粒状水凝胶，以及（E）使用金属刮刀将颗粒状水凝胶转移到注射器中。 请点击此处查看此图的大图。
5.使用颗粒状水凝胶油墨挤出印刷
注：挤出印刷工艺的概述如图 5所示，包括使用真空驱动过滤卡住的碎片颗粒状水凝胶的星形结构的代表性印刷品。印刷工作流程包括配制油墨，规划印刷设计，然后根据所需的设计41印刷油墨。如果需要，通过在堵塞之前向碎片微凝胶悬浮液中添加过量的DTT（5mM）和I2959（0.05 wt.%），可以使用挤出后的光交联来稳定印刷的颗粒水凝胶结构。这将导致微凝胶之间形成光交叉链接的共价键，从而导致颗粒水凝胶结构的永久稳定。
- 油墨配方
- 在规划过程中，请记住要使用的油墨的属性。为了表征油墨，请完成碎片水凝胶的流变学分析，以帮助为印刷设计过程提供信息。描述颗粒水凝胶流变学表征的方法在别处描述，可以适用于本研究40。
- 从流变分析中，选择打印平台和一系列初始打印参数。
注：由于颗粒状水凝胶油墨的整体高粘度和剪切变稀特性，通常使用基于螺杆的挤出打印机。
- 印刷设计
注：重复主机软件（以下简称3D打印软件）用于3D打印应用（步骤5.2-5.3）。- 通过计算机辅助设计 （CAD） 软件创建打印设计。用户可以从头开始创建新颖的设计或修改预先存在的设计，例如从患者组织扫描或其他用户。有关创建 CAD 设计的更多信息，请参阅以下参考资料41、42、43。
- 要将 CAD 模型处理为 G-Code，请确保 CAD 文件以“.stl”格式保存（补充文件 1），并通过选择顶部面板中的加载按钮或在菜单栏中选择 文件>加载 ）上传到 3D 打印软件。此 G 代码定义了油墨沉积的打印路径。空心圆柱体的示例 .stl 文件已包含在补充文件中。
- 将 STL 文件上传到 3D 打印软件后，导航到 “切片器 ”面板，然后选择“ Slic3r ”作为切片器选项。在这里，可以根据油墨表征和所需的打印结果调整喷嘴直径、层高、打印速度和挤出速率等设置。在该协议中，使用18 G针（内径为838μm）。基于之前的优化39，层高设置为 1 mm，打印速度设置为 8 mm/s，流速设置为 9 μL/s。参数的数值可以通过±20%来调整，以考虑颗粒状水凝胶油墨性质的变化。
注意：重要的是要注意，这些设置和打印设计可能需要通过迭代实验测试进行调整，具体取决于对油墨配方、所需打印分辨率或使用的打印平台的调整。有关这些参数以及使用新型油墨配方表征打印设置的更多信息，请参阅其他参考文献40，44，45，46。
- 使用碎片状颗粒水凝胶挤出印刷
- 对于带有碎片颗粒水凝胶的注射器，请参见4.2.4，以及 图4 和 图5。
- 取下吸头盖，然后用所选的针头代替。
- 将注射器装入所选的打印平台。在这里，使用定制的基于螺丝的挤出打印机。
注：有关构建自定义生物打印机的信息，请参阅其他参考文献44，47。 - 将规划阶段准备好的 G-Code 文件加载到 3D 打印软件中。导航到“ 打印预览” 面板，然后按 “打印”。
- 一旦印刷沉积完成，将碎片状颗粒状水凝胶构建体暴露在紫外光下以进行光交联和稳定。
- 交联完成后，通过在PBS中洗涤样品三次来处理样品。
图5：使用碎片状颗粒水凝胶挤出印刷的概述。 该图描绘了（A）使用刮刀将碎片颗粒水凝胶转移到注射器桶中，（B）连接钝头针头（图中18 G）并将样品推到顶部，（C）表示与计算机软件连接以进行打印的图形，以及（D）完成带有碎片颗粒水凝胶的星形结构的打印。 请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
这些协议的代表性结果如图 3 和 图6所示。挤出破碎产生具有锯齿状多边形形状的微凝胶，直径范围为10-300μm（图3）。此外，圆度范围从0.2（非圆形）到几乎1（完美圆），长宽比范围从1-3（图3）。这些参数描述了由碎裂过程形成的不规则和锯齿状微凝胶形状。
当使用离心或真空驱动的过滤包装在一起时，组装的颗粒水凝胶是剪切变稀和自愈合的，如前面的工作39所述。此外，对于可注射的水凝胶，碎片状颗粒水凝胶具有高形状保真度和机械完整性，如图6所示，如图 6所示，沉积了高度为2cm的空心圆柱体。用这些简单且具有成本效益的方法制造的碎片颗粒水凝胶可用于许多生物医学应用，包括注射治疗药和3D打印油墨。
图 6：协议概述和代表性结果。 该图描绘了（A）碎片，（B）悬浮液中的微凝胶，（C）通过真空驱动的过滤卡住，以及（D）通过针挤出并打印到空心圆筒中的卡住颗粒状水凝胶。 请点击此处查看此图的大图。
补充文件 1：示例 .stl 文件 请单击此处下载此文件。
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Discussion
本文描述了使用挤出碎片微凝胶并通过离心或真空驱动过滤进行包装来制造颗粒水凝胶的方法。与其他微凝胶制造方法（即微流体，间歇乳液，电喷雾，光刻）相比，挤出碎片微凝胶制造非常快速，低成本，易于扩展，并且适用于各种水凝胶系统。此外，该协议具有高度可重复性，具有最小的批次间变异性，其在前面的工作39中具有特征。
该方案使用降冰片烯修饰的透明质酸（NorHA）通过光介导的硫醇烯反应制造本体水凝胶。NorHA合成的详细程序在别处38中描述。然而，许多水凝胶化学成分可用于使用本文所述的方法制造碎片化的微凝胶，如果可以在注射器的桶内形成本体水凝胶。了解本体水凝胶的机械性能（例如，压缩模量）也很有用。该协议中使用的本体水凝胶具有约30 kPa39的本体压缩模量。具有较高压缩模量的本体水凝胶在破碎步骤中需要更多的力来挤出，这可能导致注射器的堵塞或过压增加;因此，建议使用压缩模量小于80 kPa的水凝胶。此外，压缩模量低于10 kPa的本体水凝胶在破碎步骤中可能会变形，使其难以破碎。
该协议针对紫外线点固化灯进行了优化。作为UV光源和UV响应光引发剂的替代品，可见光源也可以与可见光响应光引发剂一起使用，例如水溶性锂苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基膦酸盐（LAP）。引发剂浓度、光强度和样品体积将影响交联时间，具体取决于所使用的聚合物和交联体系。此外，许多灯源可以用作点固化系统的替代方案。
该协议中最关键的步骤是通过越来越小的针规进行连续挤出。在此过程中，建议使用从18 G（838μm内径）到30 G（159μm内径）的针规。在通过针头挤出之前，将PBS添加到碎裂的散装水凝胶中对于显着减少挤出和碎裂所需的力至关重要。不应使用过大的力来挤出水凝胶，因为过大的力会导致注射器中的背加压，并有可能将水凝胶从注射器中冲出。减少挤出所需力的其他策略包括在系列中使用更多的针来逐渐减小碎片尺寸，以及在碎片步骤之间添加额外的PBS。
当使用真空驱动的过滤来干扰碎片微凝胶时，过程中可能存在可变性。一些材料系统可能需要更多（或更少）时间来去除PBS并完全堵塞微凝胶。建议记录单个材料系统所需的时间，以确保整个实验的可重复性。卡住时间还取决于添加到过滤器中的样品的厚度和尺寸。将样品均匀地分布在过滤器上有助于均匀的干扰。
挤出破碎微凝胶制造方法可以适用于许多生物医学应用。例如，治疗药物可以包含在水凝胶前体溶液中，随后封装在碎片化的微凝胶中，以制造剪切变稀，自愈合的颗粒状水凝胶，用于局部治疗递送。此外，碎片状微凝胶可以干燥，以便长期储存和直接灭菌。然而，挤出片段化的一个限制是将细胞掺入微凝胶中。由于挤出破碎过程中的高剪切速率，该方法可能不适合微凝胶内的细胞包封，因为高剪切可能导致细胞活力显着降低。尽管如此，细胞和球状体可以很容易地掺入微凝胶之间，用于 体外 培养和 体内 细胞递送。
碎片状颗粒水凝胶是一种有前途的生物材料，用于生物医学应用。近年来，由各种破碎方法（即研钵和研杵，搅拌机和网状刨丝机）制成的颗粒水凝胶已被用作充满细胞的3D打印油墨48，治疗递送载体29，可注射组织修复支架30和球体培养平台39。在先前报道的片段化方法中，本文中描述的挤出片段化法是最简单和最具成本效益的方法之一，具有许多优点。分享本文的方法将增加颗粒水凝胶制备的可及性，并导致颗粒水凝胶生物材料领域不断增长的重大进展，使更多的研究人员能够设计出具有碎片颗粒水凝胶的创新生物医学解决方案。
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Disclosures
作者没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国家科学基金会通过UPenn MRSEC计划（DMR-1720530）和研究生研究奖学金（V.G.M和M.E.P.）以及美国国立卫生研究院（R01AR077362到J.A.B.）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 30 G NT Premium Series Dispensing Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL) | Fisher Scientific | 14-823-435 | Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX). |
| Black folders | Various Vendors | ||
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5") | Grainger | 5FVH5 | Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5") | Grainger | 5FVJ3 | |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5") | Grainger | 5FVL0 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 14190-250 | Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles. |
| Durapore Membrane Filter, 0.22 µm | Millipore | GVWP04700 | |
| Epifluorescent or confocal microscope | Various Vendors | To visualize microgels and granular hydrogels | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Extrusion printer | Custom-built | Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX. | |
| Filter Adapters | Fisher Scientific | 05-888-107 | Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX). |
| Filter Flask | Various Vendors | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa) | Sigma-Aldrich | 52471 | |
| Glass microscope slide | Various Vendors | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | "Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html | |
| Laptop | Various Vendors | ||
| Luer-Lock Tip Caps | Integrated Dispensin g Solutions | 9991329 | |
| Metal spatula for scooping | Various Vendors | ||
| Microcentrifuge | Various Vendors | Capable of speed up to 18,000 x g | |
| Microscoft Execl | Microsoft | Other programs can be used, such as Google Slides. | |
| OmniCure S2000 Spot UV Curing System | Excelitas Technologies | S2000 | Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired. |
| Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate | Fisher Scientific | FB966C | Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available. |
| Radiometer | Various Vendors | ||
| Repetier Host | Hot-World GmbH & Co. KG | 3D printing software | |
| Screw-based extrusion printer | Various Vendors | This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available. | |
| Solidworks/CAD software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD. | |
| Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line | Various Vendors | ||
| UV Eye Protection (i.e., safety glasses) | Various Vendors |
References
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