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Artículo de método

Medición del número de copias de ADN mitocondrial unicelular y la heteroplasmia mediante la reacción en cadena de la polimerasa de gotitas digitales

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DOI:

10.3791/63870

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12 de julio de 2022

 , 
1Department of Clinical Neurosciences, School of Clinical Medicine, University of Cambridge, Cambridge Biomedical Campus, 2Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, University of Cambridge, Cambridge Biomedical Campus

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para medir el número absoluto de copias de ADN mitocondrial (mt) y los niveles de heteroplasmia de deleción de ADNmt en células individuales.

Resumen

El ADN mitocondrial (mt) de mamíferos es una molécula de ADN intramitocondrial pequeña, circular, de doble cadena, que codifica 13 subunidades de la cadena de transporte de electrones. A diferencia del genoma nuclear diploide, la mayoría de las células contienen muchas más copias de ADNmt, que van desde menos de 100 a más de 200.000 copias dependiendo del tipo de célula. El número de copias de ADNmt se utiliza cada vez más como biomarcador para una serie de afecciones y enfermedades degenerativas relacionadas con la edad y, por lo tanto, la medición precisa del número de copias de ADNmt se está convirtiendo en una herramienta clave tanto en entornos de investigación como de diagnóstico. Las mutaciones en el ADNmt, que a menudo ocurren como polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) o deleciones, pueden existir en todas las copias del ADNmt dentro de la célula (denominada homoplasmia) o como una mezcla de copias mutadas y WT de ADNmt (denominadas heteroplasmia). Las mutaciones heteroplásmicas de ADNmt son una causa importante de patología mitocondrial clínica, ya sea en enfermedades raras o en un número creciente de enfermedades comunes de aparición tardía, como la enfermedad de Parkinson. La determinación del nivel de heteroplasmia presente en las células es un paso crítico en el diagnóstico de enfermedades mitocondriales raras y en la investigación dirigida a comprender los trastornos comunes de aparición tardía donde las mitocondrias pueden desempeñar un papel. El número de copias de ADNmt y la heteroplasmia se han medido tradicionalmente mediante ensayos cuantitativos (q)PCR o secuenciación profunda. Sin embargo, la reciente introducción de la tecnología ddPCR ha proporcionado un método alternativo para medir ambos parámetros. Ofrece varias ventajas sobre los métodos existentes, incluida la capacidad de medir el número absoluto de copias de ADNmt y la sensibilidad suficiente para realizar mediciones precisas de células individuales incluso con números bajos de copias. Aquí se presenta un protocolo detallado que describe la medición del número de copias de ADNmt en células individuales utilizando ddPCR, denominado PCR de generación de gotas en adelante, con la opción de medición simultánea de heteroplasmia en células con deleciones de ADNmt. También se discute la posibilidad de ampliar este método para medir la heteroplasmia en células con SNP de ADNmt.

Introducción

El ADN mitocondrial (mt) de mamíferos es un pequeño (aprox. 16,5 Kb) genoma circular de ADN que reside en la matriz mitocondrial que codifica 37 genes, que comprende dos ARNr, 22 ARNt y 13 genes codificadores de proteínas1. A diferencia del genoma nuclear, que contiene una (haploide) o dos copias (diploides) de cada gen por célula, el ADNmt está presente en múltiples copias en las mitocondrias de cada célula, que van desde decenas de copias (por ejemplo, espermatocitos maduros) hasta cientos de miles de copias (por ejemplo, ovocitos)2,3. Una consecuencia de esta naturaleza de múltiples copias es que las mutaciones en el genoma del ADNmt, que pueden existir como polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), deleciones o duplicaciones, pueden estar presentes en niveles variables en cualquier célula dada, lo que representa entre el 0% y el 100% de la población total de ADNmt de la célula. La existencia de genomas de ADNmt de tipo salvaje y mutantes en la misma célula se denomina heteroplasmia, y las mutaciones heteroplásmicas patógenas de ADNmt son una causa importante de enfermedad mitocondrial, con varios síndromes neurológicos comunes relacionados con mutaciones de ADNmt heteroplásmicas subyacentes4.

Dos parámetros clave que contribuyen a la probabilidad de que una mutación heteroplásmica del ADNmt cause enfermedad clínica son el nivel de heteroplasmia y el número de copias de ADNmt. Muchas mutaciones heteroplásmicas muestran un efecto umbral, con fenotipos bioquímicos y clínicos que solo se manifiestan por encima de un cierto nivel de heteroplasmia, típicamente alrededor del 80%5, y posteriormente empeoran a medida que la heteroplasmia aumenta aún más4. Sin embargo, también es importante considerar el número de copias de ADNmt presentes en la célula, ya que esto influirá en el número de genomas de ADNmt de tipo salvaje (es decir, "sanos") que están presentes en un nivel de heteroplasmia dado. Estudios en pacientes con enfermedad mitocondrial han destacado la importancia de esta interacción entre la heteroplasmia y el número de copias5,6, y Filograna et al. informaron recientemente un aumento en el número de copias de ADNmt aliviando los síntomas a pesar de la heteroplasmia inalterada en un modelo de ratón de enfermedad mitocondrial7.

Si bien se ha hecho mucho en los últimos años para mejorar la comprensión de la patogénesis y la transmisión de enfermedades causadas por la heteroplasmia de ADNmt, la mayor parte de este trabajo se ha realizado a nivel de tejidos en lugar de células, comparando los niveles medios de heteroplasmia tisular y las mediciones del número de copias adquiridas a partir de biopsias de tejido a granel y muestras de sangre. Algunas técnicas bien establecidas, como la microdisección por captura láser, permiten tales mediciones a nivel celular 8,9; sin embargo, la reciente explosión de métodos de análisis de células individuales de alto rendimiento, o los llamados "Single-cell Omics"10, ha creado un requisito para métodos que puedan medir con precisión estos parámetros cruciales de ADNmt a nivel de una sola célula.

El método de PCR de generación de gotas aprovecha los avances recientes en la tecnología microfluídica para mejorar los métodos existentes de cuantificación de concentraciones desconocidas de ADN a través de la amplificación por PCR de amplicones diana específicos en la muestrade ADN 11. A diferencia de la qPCR, donde el ADN de la muestra se amplifica en una sola reacción, con la tasa relativa de acumulación del producto de PCR actuando como lectura, este método divide la muestra inicial en miles de gotitas individuales, compartimentando así las moléculas de ADN de la muestra en reacciones espacialmente separadas12. La reacción de PCR posterior procede en cada gota individual, y el producto de PCR solo se acumula en gotitas que contienen el ADN objetivo. El resultado de esta reacción es una salida digital en forma de un conjunto de gotitas que contienen una copia del ADN objetivo y el producto de PCR amplificado, o no contienen ADN objetivo. Usando sondas de ADN fluorescente o un tinte de unión de ADN de doble cadena (ds), se pueden contar las gotas que contienen producto amplificado, y la proporción de gotas "positivas" a "negativas" se puede usar para calcular el número absoluto de copias de ADN que estaban presentes en la muestra inicial. Esta medición absoluta, a diferencia de la medición relativa adquirida de una reacción de qPCR, es el factor clave que permite utilizar esta metodología para la medición precisa del número de copias de ADNmt y la heteroplasmia en células individuales11, y varios estudios recientes ya han utilizado la tecnología de PCR de generación de gotas para este propósito13,14 . Este artículo presenta un método para medir el número de copias de ADNmt y la heteroplasmia de deleción en células individuales de tejido humano y de ratón.

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Protocolo

Todos los experimentos siguieron las pautas de ARRIVE y fueron aprobados por el Organismo de Revisión Ética de Bienestar Animal de la Universidad de Cambridge (AWERB).

NOTA: Todos los pasos de preparación de la muestra antes de la generación de gotitas deben realizarse en un área de trabajo limpia antes de la PCR, idealmente en un gabinete esterilizado por UV siempre que sea posible. El protocolo descrito aquí utiliza equipos específicos de PCR de generación de gotas (ver Tabla de materiales), y aunque el método general debe ser aplicable a otros sistemas, se recomienda consultar las pautas del fabricante con respecto a las concentraciones de cebador/sonda, condiciones de ciclo de PCR, etc., ya que pueden diferir de las descritas aquí. Las líneas celulares / células primarias utilizadas en este estudio fueron las siguientes: células HeLa humanas (obtenidas comercialmente), células HEK 293T humanas (obtenidas comercialmente), células de fibroblastos dérmicos humanos primarios (obtenidas del Biobanco de Newcastle), cíbridos humanos (deleción WT & ΔH2.115, obtenida de C. Moraes, Universidad de Miami), fibroblastos embrionarios de ratón (inmortalizados, de ratones C57Bl/6, obtenidos de J. Stewart, Universidad de Newcastle), células germinales primordiales de ratón (obtenidas de embriones de ratón C57Bl/6) y ovocitos MII de ratón (obtenidos de ratones hembra adulta C57Bl/6). Todas las células cultivadas se mantuvieron en DMEM de glucosa alta (4,5 g / L) suplementado con suero bovino fetal al 10% a 37 °C con 5% deCO2. Las células primarias de ratón utilizadas en este estudio se aislaron de animales mantenidos de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) de 1986 bajo la Licencia de Proyecto del Ministerio del Interior P6C97520A.

1. Diseñar y sintetizar conjuntos de cebadores y sondas dirigidos a secuencias de ADN de interés

NOTA: La PCR de generación de gotas también se puede realizar utilizando un tinte de unión dsDNA en lugar de las sondas específicas del amplicón.

  1. Diseñe las secuencias de cebador y sonda de acuerdo con las directrices dadas por el fabricante del sistema. En la Tabla 1 se proporcionan secuencias validadas de cebadores y sondas adecuadas para medir el número de copias de ADNmt unicelulares/heteroplasmia de deleción en células humanas16,17 y18 de ratón. Al seleccionar secuencias de destino alternativas, tenga en cuenta los siguientes puntos.
    1. Multiplexar dos conjuntos de cebadores/sondas en un solo ensayo de PCR, pero asegúrese de que los dos ensayos utilicen una sonda marcada con FAM y una sonda marcada con HEX para que el lector de gotas pueda diferenciar los amplicones objetivo. Este protocolo presenta un ensayo de sonda dúplex. Con un diseño experimental cuidadoso, la multiplexación se puede aumentar hasta cuatro objetivos, y las plataformas alternativas pueden lograr una multiplexación de mayor dimensión.
    2. Al multiplexar conjuntos de cebadores/sondas dirigidos a secuencias de ADNmt separadas, asegúrese de que los amplicones generados por los dos conjuntos de cebadores no se superpongan.
    3. Al medir la heteroplasmia en muestras portadoras de deleciones de ADNmt, asegúrese de que un amplicón objetivo caiga dentro de la región eliminada esperada y el otro caiga fuera de la región eliminada esperada.
      NOTA: Las condiciones óptimas de ciclo de PCR para ensayos alternativos pueden diferir de las citadas en el Paso 5.1; consulte la Discusión para obtener más detalles sobre la optimización del ensayo.

2. Aislamiento de ADN de células individuales

NOTA: Este método también se puede utilizar para pequeñas muestras a granel de hasta 100 células.

  1. Recoja células individuales utilizando un método apropiado, como la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)19 o la microdisección de captura láser20, en un volumen lo más pequeño posible en un recipiente adecuado (por ejemplo, placa de 96 pocillos). El uso de un tinte de viabilidad celular antes o durante el aislamiento de una sola célula minimizará la probabilidad de aislar las células muertas. Clasifique las células individuales directamente en el tampón de lisis si lo desea y guárdelas a -80 °C (hasta 6 meses) antes del análisis.
  2. Lise las células en un pequeño volumen (<10 μL) de un tampón de lisis adecuado (el tampón utilizado en este estudio se describe en el paso 2.2.1.).
    NOTA: Todos los datos obtenidos de las células en este estudio provienen de lisados unicelulares o grupos de 20 células (los tamaños de muestra se estipulan en las leyendas de la figura). La formación eficiente de una emulsión de aceite/gotas durante el paso de generación de gotas del protocolo de PCR de generación de gotas puede verse afectada significativamente por la presencia de detergentes en la muestra; Por lo tanto, se recomienda validar la compatibilidad de todos los tampones de lisis celular con la generación de gotitas a la concentración de entrada prevista antes de proceder con muestras experimentales y utilizar el volumen práctico más pequeño de tampón de lisis. El siguiente protocolo de lisis da como resultado un impacto mínimo en la eficiencia de generación de gotas.
    1. Prepare el tampón de lisis que contiene 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 1% TWEEN-20 y 200 μg/mL proteinasa K.
    2. Añadir 2,5 μL del tampón de lisis a cada muestra, sellar la placa con un sello adhesivo de placa y, a continuación, centrifugar las muestras a 1.000 x g durante 1 minuto a 4 °C.
    3. Incubar las muestras a 37 °C durante 30 min en el termociclador con la tapa calentada ajustada a 105 °C para evitar la condensación de líquido en la tapa de la placa.
    4. Agregue 7,5 μL de agua libre de nucleasas a cada muestra para obtener un volumen de muestra final de 10 μL, vuelva a sellar la placa y luego centrifugue las muestras a 1.000 x g durante 1 minuto a 4 °C.
    5. Incubar en el termociclador a 80 °C durante 15 min (tapa calentada a 105 °C) para inactivar la proteinasa K.
    6. Centrifugar las muestras a 1.000 x g durante 1 minuto a 4 °C y luego mantener en hielo.
  3. Continúe con el paso 3 a continuación.
    NOTA: Los lisados celulares pueden almacenarse a -20 °C antes de continuar con el paso 3; sin embargo, utilice ADN recién eluyente siempre que sea posible para eliminar el riesgo de ciclos de congelación-descongelación que resulten en la degradación del ADN.

3. Preparación de las muestras

NOTA: Asegúrese de que se incluyan réplicas técnicas de muestras y controles sin plantilla (NTC) en cada placa de ensayo para garantizar la precisión de los resultados. El rango dinámico del ensayo de PCR de generación de gotas es de hasta 120.000 copias del amplicón objetivo por reacción. Para los lisados de muestras de células individuales o de células a granel pequeñas, es poco probable que sea necesaria la dilución, y la mezcla de lisado puede introducirse directamente en la reacción para la medición del número de copias de ADNmt (por ejemplo, una muestra de lisado de 10 μL se puede dividir y ejecutar por triplicado con una entrada de 3 μL directamente en cada ensayo). Sin embargo, el uso de lisado sin diluir de células con números de ADNmt de copia muy altos (por ejemplo, ovocitos) o que contienen un mayor número de células (por ejemplo, 50-100) puede exceder este rango dinámico. En tales casos, se requiere una dilución seriada inicial para identificar un factor de dilución apropiado que evite la saturación del ensayo para ese tipo de célula/número de células específico (ver Resultados representativos para más detalles).

  1. Descongele todos los reactivos en hielo, vórtice y gire brevemente antes de usarlos.
  2. Prepare la mezcla maestra (menos la muestra de ADN) en hielo como se describe en (Tabla 2).
    NOTA: Si solo se mide un amplicón objetivo, agregue 2,55 μL adicionales de agua libre de nucleasa por muestra para alcanzar el volumen final de 22 μL. Prepare suficiente mezcla maestra para el número de muestras y NTC que se analizarán, más lo suficiente para tener en cuenta cualquier pocillo "en blanco" requerido en la placa de PCR de generación de gotas (consulte el siguiente paso).
  3. Vortex la mezcla maestra preparada brevemente para mezclar y alícuota el volumen requerido (22 μL menos el volumen de ADN de entrada) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de PCR de generación de gotas. Organice las muestras en columnas completas en la placa de 96 pocillos; llenar los pozos vacíos en columnas incompletas con mezcla maestra y utilizarlos como NTC.
  4. Agregue el ADN de entrada a cada pocillo de muestra y el tampón de agua/elución libre de nucleasas a los pocillos NTC para que el volumen total de cada uno alcance hasta 22 μL.
  5. Sellar la placa con un sello adhesivo y colocarla en una coctelera a 2.000 rpm durante 1 min, y luego centrifugar a 1.000 x g durante un minuto a 4 °C.
  6. Coloque la placa en hielo y continúe con el Paso 4.
    NOTA: Las placas preparadas pueden almacenarse en hielo y protegerse de la luz durante cortos períodos de tiempo (por ejemplo, 1-2 h) antes de proceder con la generación de gotas.

4. Generación de gotitas

NOTA: Consulte la Figura 1A para obtener el esquema de la plataforma de instrumentos del generador de gotas a la que se hace referencia en esta sección.

  1. Encienda el generador de gotas.
  2. Compruebe que una botella de aceite generador de gotas esté cargada en la posición E de la plataforma de instrumentos. Si se le solicita, siga las instrucciones en pantalla para reemplazar la botella.
  3. Haga clic en Configurar placa de muestra en la pantalla táctil. Seleccione todas las columnas de la placa de muestra que contengan muestras/espacios en blanco.
    NOTA: La introducción del nombre de la placa y los detalles del experimento en este paso es opcional y no es necesaria para continuar configurando el experimento.
  4. Haga clic en Aceptar para confirmar la configuración de la placa; Las luces naranjas se iluminarán en la plataforma de instrumentos para indicar las posiciones donde se deben cargar los consumibles.
  5. Cargue los cartuchos del generador de gotas para colocar B en la plataforma de instrumentos para que todas las luces se vuelvan verdes.
  6. Coloque un canal de residuos de punta vacío en la posición C de la plataforma de instrumentos.
  7. Retire las tapas de las cajas de puntas del filtro y cargue hasta la posición D en el escenario del instrumento para que todas las luces se vuelvan verdes.
  8. Retire el sello de la placa adhesiva de la placa de muestra y cargue en la posición F de la plataforma de instrumentos para que la luz se vuelva verde.
  9. Coloque una placa vacía de 96 pocillos de recolección de gotas en un bloque frío (preenfriado a -20 °C) y cargue en la posición G de la plataforma de instrumentos para que la luz se vuelva verde.
  10. Haga clic en Iniciar generación de gotas en la pantalla táctil del instrumento.
  11. Haga clic en Iniciar ejecución en la pantalla táctil del instrumento. La tapa del instrumento se cerrará automáticamente. Después de inicializar, el tiempo restante hasta que se complete la generación de gotas se mostrará en la pantalla táctil del instrumento.
  12. Una vez que se complete la generación de gotas, verifique visualmente la placa de recolección de muestras para confirmar que hay una capa de emulsión de gotas por encima de la fase de aceite en cada pozo (Figura 1B).
    NOTA: Si una capa de emulsión de gotas no es visible, no continúe con el experimento y compruebe si hay errores que puedan haber ocurrido durante los pasos anteriores del protocolo.
  13. Limpie los consumibles usados de la plataforma de instrumentos y vacíe el canal de descarga de la punta.
  14. Encienda el sellador de placas, ajuste la temperatura a 180 °C y el tiempo de sellado a 5 s, y permita que la máquina alcance la temperatura de funcionamiento.
  15. Coloque la placa de recolección de muestras en el soporte de placas selladora de placas y coloque un sello de aluminio nuevo en la parte superior de la placa con la línea roja hacia arriba. Tenga cuidado de no tocar la parte inferior del sello de aluminio.
    NOTA: El soporte de la placa debe almacenarse a temperatura ambiente (RT) y solo colocarse en el cajón sellador de placas cuando se aplica un sello de aluminio para evitar la transferencia de calor a la placa de recolección de muestras.
  16. Cuando el sellador de placas haya alcanzado la temperatura de funcionamiento, pulse Expulsar en la pantalla táctil del instrumento; El cajón se abrirá automáticamente.
  17. Coloque el soporte de la placa en el cajón del sellador de placas y presione Seal. El cajón se cerrará automáticamente y luego se abrirá de nuevo una vez que se complete el sellado.
  18. Reemplace la placa sellada en el bloque frío, apague el sellador de placas y continúe inmediatamente con el Paso 5.
    NOTA: En esta etapa, las gotas son inestables, así que asegúrese de que el paso de PCR se inicie dentro de 1 h de la finalización de la generación de gotas.

5. PCR

  1. Coloque la placa de recolección de gotas sellada en un ciclador de PCR equipado con un bloque de pozo de 96 profundidades y ejecute el protocolo de ciclo térmico descrito en la Tabla 3.
    NOTA: Ajuste la temperatura de la tapa calentada a 105 °C y el volumen de muestra a 40 μL. Los pasos de desnaturalización y recocido/extensión deben incluir una velocidad de rampa de temperatura de 2 °C/s para garantizar que el aceite tenga tiempo de equilibrarse a la temperatura correcta.
  2. Continúe con el paso 6.
    NOTA: Una vez que se completa el protocolo de ciclo térmico, las gotas son más estables y la placa se puede almacenar hasta 4 días a 4 ° C antes de continuar con el siguiente paso.

6. Lectura de gotas

  1. Encienda el lector de gotas y la computadora conectada.
  2. Verifique los niveles de líquido en las botellas de residuos de aceite del lector de gotas y llene/vacíelas, respectivamente, si es necesario.
  3. Cargue la placa que contiene las muestras post-PCR en el soporte de la placa del lector de gotas, coloque la cubierta en la parte superior del soporte y asegúrela en su lugar con los clips de bloqueo negros. No retire la tapa de aluminio de la placa de muestra.
  4. Presione el botón Abrir/Cerrar en la tapa del lector de gotas para abrirlo.
  5. Cargue el soporte de la placa del lector de gotas que contiene la placa de muestra en la cámara del lector y ubíquela de forma segura en la base magnética.
  6. Presione el botón Abrir/Cerrar en la tapa del lector de gotas para cerrarlo.
  7. Abra la interfaz del software de análisis, seleccione la pestaña Agregar placa y prepare una nueva placa de muestra de la siguiente manera:
    1. Haga clic en Agregar placa y, a continuación, en Configurar placa.
    2. En la ficha Información de la placa, introduzca un Nombre de placa, seleccione Supermix para sondas (sin dUTP) en el menú desplegable Supermix e introduzca un nombre de archivo en Guardar archivo de datos como.
    3. En la pestaña Selección de pozos, resalte los pozos que se analizarán y haga clic en Incluir pozos seleccionados.
      NOTA: Los pasos 6.7.4 – 6.7.7 son opcionales.
    4. En la ficha Información del pozo , seleccione los pozos que desea anotar.
      NOTA: Consulte la Figura 1D para ver un ejemplo de la interfaz de la ficha Información del pozo .
    5. Seleccione Cuantificación directa (DQ) en el menú desplegable Tipo de experimento, rellene los cuadros Descripción de la muestra, Tipo de muestra y Nombre del objetivo, y agregue Notas de pozo y/o Notas de placa según sea necesario.
    6. Haga clic en Aplicar. La información en los campos se aplicará a los pozos seleccionados.
    7. Repita los pasos 6.7.4–6.7.6 hasta que se hayan anotado todos los pocillos de muestra.
  8. Una vez completada la configuración de la placa, haga clic en Iniciar ejecución.
  9. Cuando finalice la ejecución, deseche la placa de muestra vacía y vacíe la botella de desechos del lector de gotas si es necesario.
  10. Continúe con el paso 7.

7. Análisis de resultados

NOTA: El lector de gotas mide la intensidad de fluorescencia en el canal FAM y HEX para cada gota en una muestra. En un ensayo exitoso, las gotitas se dividen en una de dos categorías para cada sonda: Negativa (lo que significa que el objetivo no estaba presente en la gota) o Positiva (lo que significa que el objetivo estaba presente en la gota). Antes de analizar las muestras, asegúrese de que cada pocillo contenga >10,000 gotas y tenga dos poblaciones claramente separadas de gotas de baja fluorescencia (negativa) y alta fluorescencia (positiva) en cada canal (Figura 2A).

  1. Seleccione la ficha Análisis de datos y abra el archivo que desea analizar en el menú Mis archivos de datos .
  2. Haga clic en la ficha Amplitud 1D para experimentos de un solo color o en la ficha Amplitud 2D para experimentos de dos colores.
  3. Aplique un umbral de fluorescencia a cada canal para diferenciar las gotas positivas y negativas. El software de análisis intentará aplicar un umbral automático muestra por muestra y canal por canal, pero si parece haber fallado o parece inexacto, aplique manualmente el umbral de la siguiente manera:
    1. Seleccione los pozos que requieren umbral.
    2. Aplique manualmente el umbral en el espacio libre entre las poblaciones positiva y negativa en la gráfica de amplitud mediante la herramienta Modo de línea de umbral . Al establecer umbrales manuales en la vista 2D, asegúrese de que la cruz esté colocada de modo que las cuatro poblaciones de gotas (doble negativo, FAM positivo simple, HEX positivo simple y doble positivo) estén claramente separadas.
      NOTA: El umbral se puede hacer bien por pozo o aplicar a varios pozos a la vez.
  4. Una vez que se haya aplicado un umbral a todas las muestras, exporte los resultados como un archivo .csv para su posterior análisis haciendo clic en la pestaña Tabla de datos, haciendo clic en Importar/Exportar y seleccionando Exportar datos visibles a CSV. Introduzca un nombre de archivo adecuado y haga clic en Guardar.
  5. Calcule el número de copias de ADNmt en la muestra inicial de la siguiente manera:
    Número de copias = concentración objetivo de ADNmt × 22 × 1/fracción de la entrada total de lisado
    NOTA: Si se utilizan dos sondas mitocondriales, entonces la concentración de los dos objetivos se promedia antes de hacer el cálculo. Para muestras que contengan más de una celda, el número de copias por celda se calcula dividiendo por el número de celdas de la muestra. Es importante utilizar el valor de "Concentración" (es decir, número de copias por microlitro) multiplicado por el volumen de muestra inicial de 22 μL, en lugar del valor de "Copias por 20 μL" calculado en el archivo de .csv, ya que las copias de ADNmt que quedan en el excedente de 2 μL requerido por el generador de gotas deben tenerse en cuenta al calcular el número absoluto de copias de la muestra inicial.
  6. Para las células portadoras de deleciones heteroplásmicas de ADNmt, calcule el número de copias utilizando los resultados del objetivo del ADNmt fuera de la región eliminada (es decir, el objetivo presente en las moléculas de ADNmt eliminadas y WT). La heteroplasmia de deleción se calcula utilizando las concentraciones del objetivo dentro de la región eliminada y el objetivo fuera de la región eliminada de la siguiente manera:
    figure-protocol-1

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Resultados

Después de la generación de gotas, una capa transparente de gotas opacas es visible flotando sobre la fase petrolera en cada pozo (Figura 1B). La formación de gotitas puede verse afectada negativamente por la presencia de detergentes en el lisado de entrada cuando se realizan experimentos en células individuales. Utilizando el protocolo de lisis descrito en 2.1.2., se alcanzan rutinariamente rendimientos de gotitas por encima del nivel recomendado de 10.000, a pesar de la presencia de una pe...

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Discusión

El protocolo descrito aquí es aplicable a una amplia gama de tipos de células y especies, además de los discutidos anteriormente, aunque la optimización cuidadosa de los nuevos diseños de ensayo será clave para garantizar que la precisión y la repetibilidad del método se mantengan cuando se aleje de las combinaciones de cebador / sonda previamente validadas. Cuando se trabaja con células individuales, es vital garantizar que la recolección de muestras se realice con la mayor precisión posible (por ejemplo, utilizando par...

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Divulgaciones

No hay conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Gracias al Dr. L Bozhilova por su asesoramiento sobre el análisis estadístico de los datos de PCR de generación de gotas. Gracias al Dr. H Zhang por proporcionar los ovocitos utilizados para generar datos en la Figura 3C y la Figura 4B. Este trabajo fue llevado a cabo por SPB en la Unidad de Biología Mitocondrial del Consejo de Investigación Médica (MC_UU_00015/9), Universidad de Cambridge, y financiado por una beca de investigación principal de Wellcome Trust en poder de PFC (212219 / Z / 18 / Z).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución 50% Tween-20Novex3005
Aceite generador de gotas automatizado Bio Rad1864110Formulación comercial de aceite utilizada para generar la emulsión de aceite/gota (utilizada en el Paso 4.1 del Protocolo)
Máquina de PCR C1000 con bloque de pozo profundoBio Rad1851197termociclador de PCR equipado con un bloque de calentamiento de pozo profundo, utilizado para la lisis celular (Paso de protocolo 2.1.2.) y el ciclo de PCR (Paso de protocolo 5)
Bloque de enfriamiento de placa de recolecciónBio Rad12002819Bloque de enfriamiento que mantiene las muestras refrigeradas durante la generación de gotas (utilizado en el paso 4.3 del Protocolo)
ddPCR placas de 96 pocillos Bio Rad12001925puntas de pipeta de placas de 96 pocillos diseñadas para su uso en el generador de gotas QX200 AutoDG, utilizadas para la preparación de muestras (paso de protocolo 3.4) y la recolección de gotas (paso de protocolo 4.3)
ddPCR aceite de lector de gotas Bio Rad1863004Formulación comercial de aceite utilizada por el lector de gotas (utilizada en el paso 6.1 del protocolo)
ddPCR Supermix para sondas (sin dUTP)Bio Rad1863023Supermix comercial para uso en experimentos de ddPCR que utilizan sondas (utilizada en el paso 3.3 del protocolo)
Cartuchos generadores de gotas automatizados DG32 Bio Rad1864108Cartuchos microfluídicos utilizados en el generador de gotas QX200 AutoDG para generar la emulsión de aceite/gota (utilizados en el paso 4.3 del protocolo)
Suero fetal bovinoGibco10270-106Suero fetal bovino calificado
Cubiertas de placas de aluminio Bio Rad1814040Cubiertas de placas de aluminio utilizadas para sellar las placas de recolección de gotas después de la generación de gotas (utilizadas en el paso 4.6 del protocolo)
Células HEK 293TTakara632180Subclon comercial de la línea celular de riñón embrionario humano transformado, HEK 293, que expresa las células HeLa del antígeno SV40 Large-T
ECACC93021013Células de carcinoma epiteloide de cuello uterino humano
de alta glucosa133453644,5 g/L de D-glucosa, con L-glutamina y piruvato de sodio
Cíbridos humanosFibroblastos embrionarios de ratón de la Universidad de Miami
 Universidad de NewcastleInmortalizado a partir de ratones
Agua sin nucleasasSellosAM9937
PierceSP-0027Sellos de placa adhesiva transparente, solo se usan antes de la generación de gotas (se debe usar el sello de aluminio en el paso 4.6)
Contenedores de basura con punta de pipetaBio Rad1864125Contenedor de recolección desechable utilizado para recoger puntas desechadas en el generador de gotas QX200 AutoDG (utilizado en el paso de protocolo 4.3)
Puntas de pipeta para el sistema AutoDG Bio Rad1864120Puntas de pipeta filtradas diseñadas para su uso en el generador de gotas QX200 AutoDG (utilizado en el paso 4.3 del protocolo)
Células primarias de fibroblastos dérmicos humanos Imprimacionesdel Biobanco
IDTN/ALas secuencias exactas del cebador/sonda dependerán del ensayo. Los cebadores y sondas utilizados en este estudio se dan en la Tabla 1
Solución de proteinasa K 20 mg/mLAmbionAM2546
PX1 Sellador de placas PCRBio Rad1814000Aplica sellos de aluminio a las placas de muestra ddPCR después de la generación de gotas (utilizado en el paso 4.6 del protocolo)
Software QX ManagerRad12012172Software de configuración y análisis del lector de gotas (utilizado en los pasos 6 y 7 del protocolo)
QX200 Generador de gotas AutoDGBio Rad1864101Generador de gotas microfluídico automatizado (utilizado en el Paso 4 del Protocolo)
Lector de gotas QX200Bio Rad1864003Lector de gotas (utilizado en el Paso 6 del Protocolo)
Cristales preestablecidos Trizma pH 8.3SigmaT8943-100G
DMEM GibcoC57Bl/6 de placa PCR Ambion /sondas Newcastle Bio

Referencias

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