Este protocolo describe la cromatografía de exclusión de tamaño, una técnica fácil y reproducible para enriquecer vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis a partir de sobrenadantes de cultivo.
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Artículo de método
Mycobacterium tuberculosis Enriquecimiento de vesículas extracelulares mediante cromatografía de exclusión de tamaño
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Resumen
Resumen
El papel de las vesículas extracelulares (EV) en el contexto de la infección bacteriana ha surgido como una nueva vía para comprender la fisiología microbiana. Específicamente, los EV de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) desempeñan un papel en la interacción huésped-patógeno y la respuesta al estrés ambiental. Los VEHÍCULOS eléctricos Mtb también son altamente antigénicos y muestran potencial como componentes de la vacuna. El método más común para purificar los EV Mtb es la ultracentrifugación por gradiente de densidad. Este proceso tiene varias limitaciones, incluyendo bajo rendimiento, bajo rendimiento, dependencia de equipos costosos, desafíos técnicos, y puede afectar negativamente la preparación resultante. La cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) es un método alternativo más suave que combate muchas de las limitaciones de la ultracentrifugación. Este protocolo demuestra que SEC es eficaz para el enriquecimiento de Mtb EV y produce preparaciones mtb EV de alta calidad de mayor rendimiento de una manera rápida y escalable. Además, una comparación con la ultracentrifugación del gradiente de densidad mediante procedimientos de cuantificación y calificación demuestra los beneficios de sec. Si bien la evaluación de la cantidad de EV (análisis de seguimiento de nanopartículas), el fenotipo (microscopía electrónica de transmisión) y el contenido (Western blotting) se adapta a los EV Mtb, el flujo de trabajo proporcionado se puede aplicar a otras micobacterias.
Introducción
La liberación de vesículas extracelulares (EV) por patógenos puede ser la clave para desbloquear nuevas tecnologías para controlar las enfermedades infecciosas1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es un patógeno de alta consecuencia, infectando aproximadamente un tercio de la población mundial y cobrándose la vida de millones de personas cada año2. La producción de EV por Mtb está bien documentada pero es difícil de alcanzar en la biogénesis y las funciones variadas (es decir, inmunoestimulantes, inmunosupresoras, de hierro y adquisición de nutrientes) de estos EV en el contexto de la infe....
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Protocolo
El Comité de Bioseguridad Institucional de la Universidad Estatal de Colorado aprobó el presente estudio (19-046B). El cultivo de Mycobacterium tuberculosis y la cosecha de sobrenadantes de cultivo ricos en EV fueron realizados por personal capacitado en un laboratorio de alta contención. Los materiales fueron trasladados fuera del área de alta contención después de que se realizó, confirmó y aprobó un método de inactivación válido por las políticas institucionales de bioseguridad. Al replicar el protocolo, si la inactivación validada o el método de filtración estéril no son factibles, los siguientes procedimientos deben realizarse en un laboratorio de alta c....
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Resultados
La proteína de filtrado de cultivo (CFP) de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) se concentró, cuantificó y luego se aplicaron 3 mg de material a una columna de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Las concentraciones de proteínas y partículas fueron enumeradas por BCA y NTA, respectivamente. Los rangos esperados para la recuperación de proteínas y partículas más los valores exactos obtenidos para estos resultados se informan en la Tabla 1. Valores mucho más altos que estos rangos pueden indi.......
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Discusión
Las vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis son reservorios altamente antigénicos, que las presentan como una vía atractiva para el desarrollo de herramientas diagnósticas y futuras vacunas 4,19,20. Históricamente, la ultracentrifugación por gradiente de densidad se ha utilizado para separar los EV Mtb de otros materiales solubles y secretados8. Si bien este proceso es efectivo, ta.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer el apoyo de la Facultad de Medicina Veterinaria y Ciencias Biomédicas Premio Experiencial y el Programa de Investigación Compartida del Consejo de Investigación Universitaria a NKG y la financiación de ATCC (premio # 2016-0550-0002) a KMD. También nos gustaría agradecer a Anne Simpson por su apoyo técnico y a BEI Resources, NIAID, NIH por los siguientes reactivos: Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (producido in vitro), NR-13792, Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (producido in vitro), NR-49223, y Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clon CS-35 (produci....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| Placa de 96 pocillos | Corning | 15705-066 | |
| Colector automático de fracciones | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Escalera de proteínas preteñida | Invitrogen | 10748010 | |
| Centrífuga de sobremesa | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus - 70 Filtro centrífugo, corte de 100 kDa | Millipore Sigma | UFC710008 | Dispositivo de ultrafiltración utilizado en el paso 1.1 |
| Sistema de electrotransferencia | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| Paraformaldehído de grado EM | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 15714-S | |
| Malla Formvar/Carbono 200 Rejillas de Cu | Ciencias de la Microscopía Electrónica | FCF200H-Cu-TA | |
| Cabra Anti-Ratón IgG H& L (fosfatasa alcalina), molécula entera, 1 mL | AbCam | ab6790 | Anticuerpo secundario |
| JEM-1400 Microscopio electrónico de transmisión JOEL | |||
| Micro BCA Kit de ensayo de proteínas | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| microplacas | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (gen Rv3814c) | Recursos BEI | NR-49223 | Anticuerpo primario |
| Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (gen Rv3763) | Recursos BEI | NR-13792 | Anticuerpo primario |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, clon CS-35 | Recursos BEI | NR-13811 | Anticuerpo primario |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | Para la limpieza por plasma de la rejilla TEM | |
| Nanosight equipado con bomba de jeringa y ordenador con el software NanoSight NTA | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Membrana de nitrocelulosa, rollo, 0,2 μ m | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| solución salina tamponada con fosfato, 1X sin calcio ni magnesio | Corning | 21-040-CV | |
| Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Fuente de alimentación básica | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | Columna SEC |
| Tampón de muestra SDS | Boster | AR1112 | Receta interna utilizada en este procedimiento, sin embargo, este producto es equivalente |
| SDS-PAGE cámara de gel | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | Protocolo interno utilizado en este procedimiento, sin embargo, este kit es equivalente |
| la microscopía electrónica de | acetato de uranilo | 22400 |
Referencias
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
- Prados-R....
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Reimpresiones y permisos
