Caracterización de las propiedades mecánicas de la pared celular primaria en órganos vegetales vivos mediante microscopía de fuerza atómica

Resumen

Los estudios de biomecánica de la pared celular son esenciales para comprender el crecimiento y la morfogénesis de las plantas. Se propone el siguiente protocolo para investigar las paredes celulares primarias delgadas en los tejidos internos de órganos de plantas jóvenes utilizando microscopía de fuerza atómica.

Resumen

Las propiedades mecánicas de las paredes celulares primarias determinan la dirección y la tasa de crecimiento de las células vegetales y, por lo tanto, el tamaño y la forma futuros de la planta. Se han desarrollado muchas técnicas sofisticadas para medir estas propiedades; sin embargo, la microscopía de fuerza atómica (AFM) sigue siendo la más conveniente para estudiar la elasticidad de la pared celular a nivel celular. Una de las limitaciones más importantes de esta técnica ha sido que solo se pueden estudiar células vivas superficiales o aisladas. Aquí se presenta el uso de la microscopía de fuerza atómica para investigar las propiedades mecánicas de las paredes celulares primarias pertenecientes a los tejidos internos del cuerpo vegetal. Este protocolo describe las mediciones del módulo aparente de Young de las paredes celulares en las raíces, pero el método también se puede aplicar a otros órganos de la planta. Las mediciones se realizan en secciones de material vegetal derivadas de vibratomas en una celda líquida, lo que permite (i) evitar el uso de soluciones plasmolizantes o impregnación de muestras con cera o resina, (ii) hacer que los experimentos sean rápidos y (iii) prevenir la deshidratación de la muestra. Se pueden estudiar tanto las paredes celulares anticlinales como las periclinas, dependiendo de cómo se seccionó la muestra. Las diferencias en las propiedades mecánicas de diferentes tejidos se pueden investigar en una sola sección. El protocolo describe los principios de planificación del estudio, los problemas con la preparación y las mediciones de la muestra, así como el método de selección de curvas de fuerza-deformación para evitar la influencia de la topografía en los valores obtenidos del módulo elástico. El método no está limitado por el tamaño de la muestra, pero es sensible al tamaño de la célula (es decir, las células con una gran luz son difíciles de examinar).

Introducción

Las propiedades mecánicas de la pared celular de la planta determinan la forma de la célula y su capacidad para crecer. Por ejemplo, la punta en crecimiento del tubo polínico es más suave que las partes que no crecen del mismo tubo¹. La formación de primordios en el meristemo de Arabidopsis está precedida por una disminución local de la rigidez de la pared celular en el sitio del futuro primordio ^2,3. Las paredes celulares de Arabidopsis hypocotyl, que son paralelas al eje de crecimiento principal y crecen más rápido, son más suaves que las que son perpendiculares a es....

Protocolo

1. Preparación de la muestra para mediciones de AFM

1. Material vegetal: Esterilizar las semillas de maíz (Zea mays L.) y centeno (Secale cereale L.) con una solución de NaOCl al 0,35% durante 10 min, lavar 3 veces con agua destilada y luego cultivar hidropónicamente en la oscuridad a 27 °C durante 4 días y 2 días, respectivamente. Se utilizaron raíces primarias para el experimento.
2. Preparación de soluciones y muestra para la sección de vibratomo
   1. Prepare la solución de agarosa para incrustar la raíz disolviendo la agarosa de bajo punto de fusión al 3% (p/p) en agua usando un horno de microondas.
      NOTA: Todos....

Resultados

En la Figura 2 se presentan mapas típicos de módulo elástico y DFL, así como curvas de fuerza obtenidas en raíces de centeno y maíz por el método descrito. La Figura 2A muestra el módulo elástico y los mapas DFL obtenidos en la sección transversal de la raíz primaria de centeno. Las áreas blancas en el mapa de módulos (Figura 2A, izquierda) corresponden a una sobreestimación errónea del módulo de Young debido a que el escáner alcanz.......

Discusión

Las propiedades mecánicas de las paredes celulares primarias determinan la dirección y la tasa de crecimiento de las células vegetales y, por lo tanto, el tamaño y la forma futuros de la planta. El método basado en AFM presentado aquí complementa las técnicas existentes que se utilizan para estudiar las propiedades de las paredes celulares de las plantas. Permite investigar la elasticidad de las paredes celulares, que pertenecen a los tejidos internos de la planta. Utilizando el método presentado, se mapearon las propied.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarosa, bajo punto de fusión	Helicon	B-5000-0.1	para la fijación de muestras
Cepillo	-	-	para el movimiento
de secciones Voladizos NanoTools	, Alemania	NT_B150_v0020-5	Modelo: Biosfera B150-FM
Voladizos	NT-MDT, Rusia	FMG01/50	Modelo: FMG01
Adhesivo de cianoacrilato	-	-	para portaobjetos de vidrio para vibratomía
	Heinz Herenz	1042000	para vibratomía y calibración de AFM
Software ImageAnalysis P9	NT-MDT, Rusia-para	de	datos
Microscopio de epifluorescencia Leica DM1000	Leica Biosystems, Alemania	11591301	para control de secciones
NaOCl	-	-para	la esterilización de semillas
Software Nova PX 3.4.1	NT-MDT,	Rusia-para	experimentos que realizan
microscopio NTEGRA Prima con controlador HD	NT-MDT, Rusia-para		AFM y adquisición de datos
Placa de Petri de 35 mm	Thermo Fisher Scientific	153066	para la fijación de muestras
Pipeta de punta 1000 y micro; L	Pipeta Thermo Fisher Scientific	de	4642092
punta 2-20 y micro; L	Thermo Fisher Scientific		4642062-Agua
ultrapura	-	-	-Vibratome
Leica VT 1000S	Leica Biosystems, Alemania	1404723512	para el corte de muestras

análisis