El presente protocolo describe la microscopía fluorescente de lámina de luz y los métodos automatizados asistidos por software para visualizar y cuantificar con precisión los parásitos Trypanosoma cruzi proliferantes y latentes y las células T en órganos y tejidos intactos y despejados. Estas técnicas proporcionan una forma confiable de evaluar los resultados del tratamiento y ofrecen nuevos conocimientos sobre las interacciones parásito-huésped.
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Artículo de método
Imágenes cuantitativas en 3D de células infectadas por Trypanosoma cruzi, amastigotes latentes y células T en órganos aclarados intactos
En este artículo
Resumen
Resumen
La enfermedad de Chagas es una patología desatendida que afecta a millones de personas en todo el mundo, principalmente en América Latina. El agente de la enfermedad de Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), es un parásito intracelular obligado con una biología diversa que infecta a varias especies de mamíferos, incluidos los humanos, causando patologías cardíacas y digestivas. La detección confiable de infecciones in vivo por T. cruzi ha sido necesaria durante mucho tiempo para comprender la compleja biología de la enfermedad de Chagas y evaluar con precisión el resultado de los regímenes de tratamiento. El protocolo actual demuestra una tubería integrada para la cuantificación automatizada de células infectadas por T. cruzi en órganos reconstruidos y despejados en 3D. La microscopía fluorescente de lámina de luz permite visualizar y cuantificar con precisión los parásitos T. cruzi que proliferan activamente y están latentes y las células efectoras inmunes en órganos o tejidos completos. Además, se adoptó con éxito la tubería CUBIC-HistoVision para obtener un etiquetado uniforme de los órganos despejados con anticuerpos y tinciones nucleares. La limpieza de tejidos junto con la inmunotinción 3D proporciona un enfoque imparcial para evaluar exhaustivamente los protocolos de tratamiento farmacológico, mejorar la comprensión de la organización celular de los tejidos infectados por T. cruzi y se espera que avance en los descubrimientos relacionados con las respuestas inmunes anti-T. cruzi, el daño tisular y la reparación en la enfermedad de Chagas.
Introducción
La enfermedad de Chagas, causada por el parásito protozoario T. cruzi, es una de las enfermedades tropicales más desatendidas del mundo, causando aproximadamente 13.000 muertes anuales. La infección a menudo progresa de una etapa aguda a una crónica produciendo patología cardíaca en el 30% de los pacientes, incluyendo arritmias, insuficiencia cardíaca y muerte súbita 1,2. A pesar de la fuerte respuesta inmune del huésped provocada contra el parásito durante la fase aguda, un bajo número de parásitos persiste crónicamente durante toda la vida del huésped en tejidos como el corazón y el músculo esquelét....
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Protocolo
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con la Política del Servicio de Salud Pública sobre el Cuidado Humanitario y el Uso de Animales de Laboratorio y las pautas de acreditación de la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio. El Protocolo de Uso de Animales (control de la infección por T. cruzi en ratones-A2021 04-011-Y1-A0) fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Georgia. B6. Para el presente estudio se utilizaron ratones C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J y C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8As....
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Resultados
Los tejidos fijos CUBIC se lavaron con PBS para eliminar los fijadores y luego se incubaron con cócteles CUBIC-L, una solución tamponada básica de aminoácidos alcoholes que extraen pigmentos y lípidos del tejido, lo que resulta en la decoloración del tejido mientras se mantiene la arquitectura del tejido. Las líneas de cuadrícula en el papel se pueden ver a través de los tejidos que indican una limpieza adecuada de los órganos (Figura 2A). Después de la deslipidación, los te.......
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Discusión
La ausencia de imágenes extensas de los parásitos y la respuesta inmune en todo el órgano limita la comprensión de la complejidad de las interacciones huésped-parásito e impide la evaluación de las terapias para la enfermedad de Chagas. El presente estudio adoptó la tubería CUBIC para aclarar y teñir órganos y tejidos intactos de ratones infectados con T. cruzi.
En este estudio se probaron múltiples protocolos de limpieza de tejidos (PACT32, ECi 33, FLASH
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Etsuo Susaki por su valiosa ayuda y recomendaciones con respecto a los protocolos de limpieza de tejidos e inmunotinción. Además, agradecemos a M. Kandasamy del CTEGD Biomedical Microscopy Core por el apoyo técnico que utiliza LSFM e imágenes confocales. También agradecemos a todos los miembros del Grupo de Investigación Tarleton por sus útiles sugerencias a lo largo de este estudio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1-metilimidazol | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimetil-1-fenil-5-pirazolona (Antipirina | TCI | D1876 | |
| Placas de cultivo celular de 6 pocillos | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-ratón Fab fragmento | Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-conejo Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomate)Hze/J | laboratorio de Jackson | #007914 | Nombre común: Ai14, Ai14D o Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomate)Ratón Hze/J | La cepa de laboratorio de Jackson | #007914 | Nombre común: Ai14 , Ai14D o Ai14(RCL-tdT)-D |
| YODURO BOBO-1 | |||
| sérica bovina (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J | ratón La cepa de laboratorio Jackson | #032080 | Común Nombre: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Toallitas de limpieza Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Microscopio de barrido láser confocal | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 kit de inmunotinción 3D | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 kit de tinción nuclear 3D | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Superpegamento en gel a base de cianoacrilato | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindotricarbocianina yoduro) Compañía: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Etileno diamina ácido tetraacético (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Tubos de centrífuga 15 mL | Corning | ||
| Tubos de centrífuga Falcon 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalina | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparina | ThermoFisher Scientific | J16920. BBR | |
| Hyaluronidasa | Sigma | #H3884 o #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Software Imaris | BitPlane | v9.3 | |
| Software ImSpector | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Aguja de inyección intravenosa 23-G | Sartori, Minisart Filtro de jeringa | 16534 | |
| Toallitas Kimwipes | sin pelusa Microscopio | ||
| L, 200 y micro; L y 1.000 µ L | Axygen | T-300, T-200-Y y T-1000-B | |
| Dispensador de pipetas motorizado | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Solución de montaje | TCI | M3294 | |
| N-butildietanolamina | TCI | B0725 | |
| Nicotinamida | TCI | N0078 | |
| N-metilnicotinamida | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehído (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Tinción nuclear ultrarroja | Biotio | #40061 | |
| Sistema de perfusión de sacrificio | Leica | 10030-380 | |
| Tijeras | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Pipetas serológicas | Costar Estéril | 4488 | |
| incubadora agitadora | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Azida sódica (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Carbonato de sodio (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 Cloruro | |
| de sodio (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Hidrogenocarbonato de sodio (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Tinción de ácido nucleico verde | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
Referencias
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleto....
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Reimpresiones y permisos
