Medición in vivo resuelta en el tiempo de la dinámica de neuropéptidos mediante inmunosonda capacitiva en corazón porcino

Varios métodos químicos para detectar y cuantificar biomarcadores se utilizan rutinariamente tanto en la química de proteínas como en el diagnóstico clínico, particularmente en diagnósticos de cáncer y la evaluación de la progresión de la enfermedad cardiovascular. Actualmente, métodos como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y la espectrometría de masas se basan en la recolección de muestras del compartimento vascular ^1,2,3 por extracción de líquido a granel o del compartimento intersticial por microdiálisis. La microdiálisis emplea un tubo de membrana semipermeable de longitud conocida que se coloca en una región de interés. El líquido de recolección se perfunde a través del tubo durante varios minutos⁴ para recoger la muestra para el análisis⁵, limitando así la resolución temporal. De esta manera, las muestras recolectadas solo proporcionan un valor promedio a lo largo del tiempo del microambiente local y están limitadas por la tasa de perfusión y la recolección de suficiente volumen de muestra. Además, estos métodos requieren la puesta en común de datos experimentales y el promedio de señales; por lo tanto, pueden no tener en cuenta la variabilidad entre los sujetos. Es importante destacar que el tiempo entre la recolección de muestras y el posterior análisis fuera de línea impide la intervención clínica y terapéutica inmediata.

En el presente protocolo, se describe el uso de un biosensor de inmunosonda capacitiva (sonda CI) para la detección eléctrica resuelta en el tiempo de péptidos bioactivos específicos. El neuropéptido Y (NPY), liberado de las neuronas simpáticas post-ganglionares que inervan la vasculatura, el endocardio, los cardiomiocitos y los ganglios intracardíacos, es un importante transmisor peptídico neuromodulador en el sistema cardiovascular 6,7,8,9. El método presentado aquí está diseñado para medir NPY, y la viabilidad experimental se demuestra en un modelo de corazón porcino. Sin embargo, este enfoque se aplica a cualquier péptido bioactivo para el que se disponga de un anticuerpo selectivo¹⁰. Este método se basa en la unión capacitiva entre una sonda de alambre de platino y el fluido conductor en la punta funcionalizada^11,12. En esta aplicación, la interacción fue mediada a través de un anticuerpo contra el neuropéptido objetivo (NPY), que se unió a la punta del electrodo, interactuando con el ambiente del fluido conductor. Esta funcionalización se logró mediante electrodeposición de polidopamina reactiva en la punta de la sonda de alambre de platino^10,13.

Cuando la sonda funcionalizada con anticuerpos se coloca en una región de interés in vivo, la liberación endógena evocada de NPY conduce a la unión a los anticuerpos de captura en la punta de la sonda, y el fluido conductor en la superficie del electrodo es desplazado por la proteína NPY. La alteración local en el entorno eléctrico resulta en el desplazamiento de fluido de alta movilidad y alta dieléctrico con una molécula inmóvil y cargada estáticamente. Esto altera la interfaz electrodo-fluido y, por lo tanto, su capacitancia, que se mide como un cambio en la corriente de carga en respuesta a un potencial de comando de función de paso. Se emplea un potencial de "reinicio" negativo inmediatamente después de cada ciclo de medición individual para repeler el NPY unido del anticuerpo a través de la interacción electrostática, despejando así los sitios de unión de anticuerpos para rondas posteriores de medición¹⁰. Esto permite efectivamente la medición de NPY de una manera resuelta en el tiempo. La técnica única de IC supera las limitaciones de los métodos inmunoquímicos basados en microdiálisis descritos anteriormente para medir los niveles de biomarcadores dinámicos de un solo experimento sin agrupación de datos o promedio de señales en varios experimentos⁹, proporcionando datos casi en tiempo real. Además, la capacidad de adaptar este método a cualquier biomarcador de interés para el que exista un anticuerpo apropiado en una escala resuelta y localizada proporciona un gran avance técnico en la medición inmunoquímica para la evaluación de la progresión de la enfermedad y la orientación de intervenciones terapéuticas.

El software para la adquisición y el análisis de datos fue escrito a medida en IGOR Pro (un entorno de software totalmente interactivo). Un sistema de convertidor analógico a digital (A / D) emitió un voltaje de comando bajo control de computadora y adquirió datos de un amplificador personalizado. El amplificador poseía ciertas características únicas. Estos incluían una resistencia de retroalimentación (conmutable) para cada uno de los cuatro canales de adquisición, lo que permitía elegir circuitos de abrazadera de voltaje de retroalimentación de 1 MOhm o 10 MOhm para integrar la variabilidad del electrodo. También se construyó una unidad de etapa con un solo cabezal y un circuito mutuo de tierra / referencia para los cuatro canales de adquisición para colocar el dispositivo cerca del cofre en un solo módulo físico. Se utilizó una configuración de resistencia de retroalimentación de 1 MOhm para recopilar todos los datos informados.

Los ajustes de filtro y ganancia se telegrafiaron desde el amplificador y se registraron dentro del archivo de datos. Los datos se filtraron a 1 kHz a través de un filtro Bessel analógico de 2 polos digitalizado a 10 kHz. La diferencia de potencial entre la sonda y la solución conductora circundante crea una capa capacitiva de Helmholtz en la punta de la sonda. La unión del ligando al anticuerpo en la punta de la sonda da como resultado una carga local alterada y, por lo tanto, un cambio en la capacitancia de Helmholtz. Este cambio en el componente capacitivo del circuito da como resultado un cambio en la magnitud de la carga inyectada requerida para llevar la sonda al potencial en el protocolo de voltaje de función paso a paso. Por lo tanto, la unión de un ligando específico a la sonda funcionalizada resulta en una alteración en la medición de la capacitancia del electrodo como un cambio en la corriente capacitiva máxima.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Investigación Animal de la Universidad de California, Los Ángeles y se realizaron siguiendo las pautas establecidas por la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (8ª edición, 2011). Se utilizaron cerdos Yorkshire machos adultos de aproximadamente 75 kg para estudios in vivo ¹⁰.

1. Fabricación y funcionalización de inmunosondas capacitivas

1. Corte una longitud de 25 cm de alambre de platino recubierto de perfluoroalcoxi (PFA) (consulte la Tabla de materiales) y retire aproximadamente 5 mm de recubrimiento de PFA de un extremo con un bisturí, teniendo cuidado de no cortar el alambre de platino.
2. Inserte el extremo pelado del cable de platino en un pasador de conector macho de 1 mm chapado en oro y engarce los dientes del pasador del conector alrededor del extremo pelado del cable de platino con alicates de nariz de aguja (consulte la Tabla de materiales).
3. Suelde el cable de platino al pin del conector chapado en oro. Tenga cuidado de no usar una cantidad excesiva de soldadura.
4. Prepare la solución de dopamina disolviendo 50 mg de dopamina HCl en 50 ml de solución salina tamponada con fosfato de 10 mM (PBS, pH 6.0) agitando.
5. Una vez que la dopamina esté completamente disuelta, coloque la punta del alambre de platino en el recipiente que contiene el PBS recién hecho suplementado con dopamina. Conecte un pin de conector dorado en un canal del cabezal (consulte la Tabla de materiales).
6. Conecte el electrodo de disco AgCl (electrodo de tierra, consulte la Tabla de materiales) al canal de tierra en el escenario principal. Coloque el disco AgCl en el recipiente que contiene PBS suplementado con dopamina y alambre de platino; tenga cuidado solo de sumergir el electrodo de disco y no cualquier longitud del cable o soldadura. Conecte una derivación de cable en los canales de referencia del estadio antes de continuar.
7. Abra el software interactivo de adquisición de datos (consulte la Tabla de materiales). Preparar un protocolo de potencial de comando de electrodeposición de diente de sierra con los siguientes parámetros: potencial de inicio = −0.6 V; potencial final = +0,65 V; velocidad de escaneo = 0.04 V∙^s-1; duración de la deposición = 420 s. Comience el protocolo de deposición de polidopamina, asegurándose de que todos los cables estén conectados correctamente.
8. Después de completar la deposición de polidopamina, retire el pellet de tierra AgCl y la punta del cable de platino del recipiente, teniendo cuidado de no molestar la punta del electrodo de alambre de platino. Coloque la punta del cable en un microtubo que contenga PBS (pH 7.4) durante 2-5 minutos mientras se prepara la solución de anticuerpos; asegúrese de que la punta del cable no entre en contacto con los lados o la parte inferior del microtubo.
   NOTA: La solución de anticuerpos se puede hacer durante la deposición de polidopamina; sin embargo, no se debe omitir la transferencia del alambre de platino desde el vaso que contiene dopamina al microtubo de PBS después de la deposición de polidopamina.
9. Prepare la solución de anticuerpos. Combine el anticuerpo de interés con PBS (pH 7.4) en una proporción de 1:20 en un recipiente de un tamaño apropiado (por ejemplo, un microtubo).
   NOTA: El anticuerpo monoclonal anti-NPY (ver Tabla de Materiales) utilizado aquí fue aludido a 1 mg/ml; un ejemplo de preparación de anticuerpos aquí sería 4 μL de anticuerpo a 76 μL de PBS.
10. Remoje la punta depositada en polidopamina del electrodo de platino en solución de anticuerpos durante un mínimo de 2 h a temperatura ambiente, asegurando nuevamente que la punta del alambre de platino esté suspendida en solución y no descanse en la superficie interior del microtubo.
    NOTA: La implementación reciente de esta técnica ha favorecido el uso del electrodo de alambre de platino inmediatamente después de este paso en lugar del almacenamiento húmedo o seco para su uso posterior.
11. Después de sumergirse en la solución de anticuerpos, enjuague brevemente la punta de inmunosonda capacitiva (sonda CI) recién funcionalizada en PBS (pH 7.4). La sonda ya está lista para su uso.

2. Configuración experimental para la detección y medición in vitro de péptidos

1. Coloque la punta funcional de la sonda CI en la cámara de flujo, teniendo cuidado de no perturbar la punta del electrodo de ninguna manera, ya que hacerlo puede dañar la punta sensorial de la sonda.
   NOTA: La cámara de flujo se creó vertiendo elastómero de silicona (ver Tabla de materiales) en un plato de cultivo de 35 mm con un relleno de espacio ovoide alargado en el centro del plato. Después del endurecimiento, la forma ovoide se elimina del elastómero. La cámara se sobrefunde con solución salina tamponada tris (TBS) y se permite un caudal de 3 ml / min. Asegúrese de que la entrada y la salida mantengan el nivel de líquido en la cámara de tal manera que no se observe ninguna acción de marea del superfusado. El flujo debe permanecer en su lugar mientras la sonda CI esté en uso.
2. Antes de la primera prueba experimental, realice una ejecución estándar TBS para condicionar la sonda CI. Configure el siguiente protocolo de voltaje de comando: potencial de paso positivo = +100 mV; potencial de paso negativo = −5 mV; duración del paso = 20 ms; duración de la adquisición = 600 s.
   NOTA: Es importante permitir el equilibrio de la sonda durante la fase inicial del potencial de comando de ciclo antes de la adquisición de datos.
3. Crear una solución del péptido de interés utilizando el mismo TBS para mantener la composición del superfusado. Configure un sistema de colector donde el superfusato se pueda cambiar entre TBS y TBS suplementado con péptidos sin introducir burbujas en el sistema de tubos o la cámara de flujo.
   NOTA: En el presente estudio se utilizó el péptido NPY porcino sintético (ver Tabla de Materiales).
4. Configure el protocolo de adquisición de datos de detección de péptidos utilizando los parámetros estándar de TBS (consulte el paso 2.2.).
   NOTA: En esta implementación, la duración de cada prueba experimental fue de 360 s (120 s TBS, 120 s TBS suplementado con péptidos, 120 s TBS).

3. Adaptación de la sonda CI para uso in vivo

1. Antes de la deposición de polidopamina (paso 1.7.), enhebrar la punta expuesta del electrodo de alambre de platino a través de una aguja hipodérmica de 22 G, dejando aproximadamente 2 mm más allá de la punta de la aguja. Usando fórceps, doble suavemente hacia atrás la punta del electrodo de alambre de platino, creando una "púa" que cuelga del extremo de la aguja hipodérmica.
   1. Retire suavemente la aguja de la punta de púas, dejando suficiente alambre para colocar en el recipiente sin que la aguja entre en contacto con el fluido. Continúe con los pasos 1.4.-1.11.
      NOTA: Dependiendo de la configuración in vivo , puede ser necesario cortar una longitud de alambre de platino de más de 25 cm.
2. Antes de conectar la sonda CI al estadio principal, asegúrese de que toda la configuración eléctrica esté correctamente conectada a tierra. De lo contrario, puede introducir interferencias eléctricas no deseadas durante las grabaciones experimentales.
3. Anestesiar a los animales siguiendo un informe publicado previamente¹⁰.
4. Realizar cirugía para exponer la región de interés.
   NOTA: En el presente estudio se realizó una esternotomía mediana para exponer el corazón. Consulte Kluge et ^{al.10 para obtener} detalles sobre la cirugía animal.
5. Retire suavemente la punta funcionalizada del enjuague PBS (paso 1.11.), envíe la aguja hidodérmica a la sonda C.I. de púas e implíquela suavemente en la región de interés antes de tapar el pasador del conector dorado en el escenario principal. Una vez implantada, retire la aguja hipodérmica, dejando el electrodo en su lugar.
   NOTA: Para el presente estudio, la sonda se colocó en la pared lateral media del miocardio ventricular izquierdo¹⁰.
6. Después de garantizar una configuración eléctrica adecuada, continúe con los protocolos de prueba estándar y experimentales (paso 2.2. y paso 2.4.).
7. Una vez finalizados los experimentos, sacrificar al animal siguiendo técnicas aprobadas institucionalmente.
   NOTA: En el presente estudio, los animales son sacrificados bajo anestesia profunda mediante inducción de fibrilación ventricular¹⁰.

Fabricación y caracterización de electrodos
Se fabricó una inmunosonda capacitiva flexible (sondas CI), y en la Figura 1A se representa una imagen representativa. El potencial del electrodo se estableció mediante un circuito de abrazadera de voltaje controlado por computadora (Figura 1B), y el electrodo se sumergió en una solución de polidopamina hecha en PBS. La polidopamina se electrodespuso en la punta del electrodo conductor13 para su funcionalización. El potencial de comando impulsó el voltaje de la sonda y se midió la inyección de corriente de sujeción. La corriente de sujeción medida durante un solo ciclo de deposición de polidopamina se muestra en la Figura 1C. Inmediatamente después de la deposición de polidopamina, la punta del electrodo recubierto se empapó en una solución de anticuerpos de interés (Figura 2A). Todos los electrodos se utilizaron inmediatamente después de estos pasos.

Medición in vitro de NPY
La sonda funcionalizada por anticuerpos se colocó en una cámara de flujo y fue impulsada por el circuito de abrazadera de voltaje con un potencial de comando de ejemplo, y se muestra la corriente registrada (Figura 2B, C). Los registros in vitro se realizaron en solución salina tamponada con Tris (TBS, pH 7.4). La forma de onda de función de paso comprende un potencial de paso positivo (parte azul superior, Figura 2B) y un potencial de "reinicio" negativo (parte roja inferior, Figura 2B). El rango de este potencial de comando mide eficazmente la unión y evoca la repulsión posterior de los péptidos sin degradar la sensibilidad de la sonda10. Después de la fabricación, cada sonda se probó para el acondicionamiento inicial bajo el protocolo de potencial de comando. Cabe señalar que las sondas que devolvieron el perfil de acondicionamiento inicial más estable y reproducible, definido como una desintegración inicial más pequeña seguida de una línea de base estable (Figura 2D), dieron las mediciones más reproducibles in vitro e in vivo. Por lo tanto, la medición de la estabilización inicial de las sondas CI representa un importante punto de control de calidad para determinar la idoneidad de la sonda.

Evaluación de la sensibilidad y estabilidad de los electrodos in vitro
Las inmunosondas capacitivas se colocaron en una cámara de flujo y se sobrefundieron con TBS suplementadas con concentraciones conocidas de neuropéptido Y (NPY, 5-150 pM). Las corrientes capacitivas, medidas como la amplitud máxima de la despolarización de +100 mV, se trazaron contra el tiempo. El flujo de NPY en la cámara de flujo aumentó las corrientes capacitivas sobre la línea de base (NPY de 60 pM, Figura 2E). En la Figura 3A se muestra una demostración de la respuesta actual dependiente de la dosis para 5 pM y 75 pM NPY, y en la Figura 3B se proporciona una curva estándar medida bajo todas las concentraciones probadas. Los puntos de datos de la Figura 3B se ajustaron a un único ajuste exponencial para fines de calibración.

Evaluación in vivo de perfiles de liberación de neuropéptidos con sonda CI
Esta metodología se aplicó a una preparación de corazón porcino para evaluar su idoneidad para la aplicación biológica, como se describe en las publicaciones anteriores10. Brevemente, un electrodo de CI se enhebró a través de una aguja hipodérmica de 22 G y se dobló ligeramente hacia atrás para crear una púa (Figura 4A). La aguja y el electrodo de púas se insertaron en el miocardio ventricular izquierdo de un corazón porcino que late. La aguja guía hipodérmica se retiró del electrodo, dejándola en su lugar en el miocardio. La NPY intersticial se midió antes y en respuesta a 60 s de estimulación bilateral del ganglio estrellado (ver Kluge et al.10 para una descripción completa de los pasos de simulación). Se colocó un segundo electrodo de control negativo sin funcionalización de anticuerpos adyacente a la sonda NPY. Las corrientes de pinza de inmunosonda capacitiva obtenidas se ajustaron contra la curva de calibración in vitro para proporcionar cambios evocados y resueltos temporalmente en las concentraciones de NPY en el microambiente cardíaco. Se observó NPY elevado durante la estimulación del ganglio estrellado bilateral y se co-graficó con las corrientes C.I de control negativo (Figura 4B, gráfica superior). Paralelamente, los niveles intersticiales de norepinefrina (NE) también se midieron mediante voltamperometría cíclica de barrido rápido (FSCV), una técnica utilizada previamente para evaluar la liberación de catecolaminas de células aisladas14,15, tejidos aislados 16,17,18 y en la preparación del corazón porcino 19. La norepinefrina es un neurotransmisor simpático co-liberado bajo estimulación estrellada (Figura 4B, gráfico inferior) y muestra una liberación síncrona con NPY, consistente con una respuesta simpática evocada. Estos datos demuestran que el enfoque de IC se puede utilizar simultáneamente con otros métodos de detección de biomarcadores para evaluar microambientes intersticiales con alta fidelidad temporal. Brevemente, se implanta un electrodo sensor en el miocardio adyacente a la sonda CI. El potencial del electrodo es impulsado a través de los potenciales de oxidación/reducción del transmisor por un circuito de pinza de voltaje. Por lo tanto, a medida que el potencial del electrodo se vuelve positivo al potencial de oxidación para NE, el NE se oxida a un derivado de quinona. Los electrones se generan por la reacción de oxidación, medida como una corriente compensadora en el electrodo sujeto a voltaje, proporcionando así un índice de liberación local de NE. Cambiar el potencial del electrodo a una polarización negativa disminuye el producto de quinona para regenerar la catecolamina20.

Figura 1: Fabricación de la sonda CI de alambre de platino. (A) Se utilizó un alambre de platino recubierto de PFA (25 cm de largo y 127 μm de diámetro) para crear cada sonda CI. Alrededor de 5 mm de recubrimiento de PFA se despojaron de un extremo del cable, que luego se soldó a un pasador conector chapado en oro macho (barra de escala = 3 cm). (B) Se muestra una representación del circuito de abrazadera de voltaje utilizado para aplicar el potencial de comando. (C, izquierda) La punta sensorial del electrodo se sumergió en un tubo que contenía PBS suplementado con 5 mM de dopamina. (C, derecha) La polidopamina se electrodespuso en la punta sensorial. La electrodeposición se realizó mediante el uso de una forma de onda de diente de sierra con los siguientes parámetros: −0.6 V a +0.65 V a una velocidad de escaneo de 0.04 V∙s-1. Se muestra el potencial de comando (arriba) y la corriente resultante (abajo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Medición in vitro de NPY con la sonda CI. (A) Un alambre funcionalizado con polidopamina se sumergió en PBS suplementado con un anticuerpo anti-NPY durante 2 h. Esto permitió que el anticuerpo se uniera covalentemente a la superficie de polidopamina en la punta de la sonda. (B) Se muestra el potencial de comando de voltaje. Un paso positivo en el potencial de comando sirve para medir la corriente de inyección requerida para sujetar el voltaje de la sonda (azul) y permite la medición de la corriente capacitiva. El paso de potencial de comando negativo (potencial de reinicio) elimina el péptido unido del anticuerpo a través de la repulsión electrostática (rojo). (C) La forma de onda del comando de la función de paso (traza superior; fase de medición de +100 mV a fase de reinicio de -5 mV, cada una de 20 ms de duración) proporciona detección iterativa resuelta en el tiempo y cuantificación del péptido. Se muestra el potencial de comando y el registro de corriente resultante bajo superfusión de la sonda con TBS (traza inferior). (D) Se muestra el equilibrio de una sonda de IC durante un período de 6 minutos (ver paso 2.2.). (E) Se muestra la corriente capacitiva máxima medida por la sonda C.I. funcionalizada NPY. La sonda CI se superfundió primero con solución salina tamponada con Tris, luego solución salina tamponada con Tris suplementada con NPY de 60 pM, y luego seguida de un lavado salino tamponado tris sin NPY. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Calibración in vitro de la sonda CI. (A) Las corrientes de inmunosonda capacitiva se midieron con una sonda funcionalizada con anticuerpos NPY superfundida con solución salina tamponada por Tris. El superfusado se cambió para contener 5 pM (rojo) y 75 pM (negro) NPY. Estas grabaciones representan una señal dependiente de la concentración sensible a la NPY de picomol bajo. (B) Las inmunosondas capacitivas funcionalizadas con el anticuerpo NPY se probaron para determinar la sensibilidad dosis-respuesta. Las grabaciones se realizaron bajo superfusión con TBS; luego TBS suplementado con NPY (en pM): 1, 5, 15, 25, 60, 75 y 150, y luego en un lavado de TBS sin NPY. Los valores máximos de corriente capacitiva (corriente C.I.) se midieron en un estado estacionario en cada concentración de NPY y se trazaron contra la concentración de NPY. Los datos dosis-respuesta se ajustaron para proporcionar una curva estándar para la calibración de los datos experimentales (adaptado de Kluge et al.10). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Liberación diferencial de NPY y NE evocada por estimulación estrellada bilateral. (A) Se muestra una sonda de IC con un extremo de púas para uso in vivo (barra de escala = 3 mm). La sonda se enhebra a través de una aguja hipodérmica de 22 G y se prepara como se menciona en el paso 1. y paso 2. Antes de insertar el sensor, la punta de la sonda se dobla para crear una púa, y la aguja se retira al insertarla en el miocardio, dejando así una sonda de púas anclada en la pared miocárdica del ventrículo izquierdo. (B) Se insertó una sonda funcionalizada con un anticuerpo anti-NPY en el miocardio ventricular izquierdo. Una sonda idéntica sin funcionalización de anticuerpos (ø mAb) se insertó inmediatamente adyacente y sirvió como control negativo. Las corrientes de IC se determinaron en respuesta a la estimulación estrellada bilateral a 10 Hz (BSG, ancho de pulso de 4 ms, umbral 2x). Las corrientes resultantes se calibraron contra la curva estándar (Figura 3B) y se trazaron (gráfica superior). La liberación de norepinefrina en la misma ubicación intersticial se midió mediante voltamperometría cíclica de barrido rápido (diagrama inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses, financieros o de otro tipo.