Los métodos inmunoquímicos establecidos para medir los transmisores de péptidos in vivo se basan en la microdiálisis o la extracción de líquido a granel para obtener la muestra para su análisis fuera de línea. Sin embargo, estos sufren de limitaciones espaciotemporales. El presente protocolo describe la fabricación y aplicación de un biosensor de inmunosonda capacitiva que supera las limitaciones de las técnicas existentes.
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Artículo de método
Medición in vivo resuelta en el tiempo de la dinámica de neuropéptidos mediante inmunosonda capacitiva en corazón porcino
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Resumen
Resumen
La capacidad de medir biomarcadores in vivo relevantes para la evaluación de la progresión de la enfermedad es de gran interés para las comunidades científica y médica. La resolución de los resultados obtenidos de los métodos actuales de medición de ciertos biomarcadores puede tardar varios días o semanas en obtenerse, ya que pueden tener una resolución limitada tanto espacial como temporalmente (por ejemplo, microdiálisis del compartimento fluido del líquido analizado por ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas [ELISA], cromatografía líquida de alto rendimiento [HPLC] o espectrometría de masas); por lo tanto, su orientación de diagnóstico y tratamiento oportunos se interrumpe. En el presente estudio, se informa de una técnica única para detectar y medir transmisores de péptidos in vivo mediante el uso de un biosensor de inmunosonda capacitiva (sonda IC). Se describe el protocolo de fabricación y caracterización in vitro de estas sondas. Se proporcionan mediciones de la liberación in vivo del neuropéptido Y (NPY) evocado por estimulación simpática. La liberación de NPY se correlaciona con la liberación simpática de norepinefrina como referencia. Los datos demuestran un enfoque para la medición rápida y localizada de neuropéptidos in vivo. Las aplicaciones futuras incluyen la evaluación intraoperatoria en tiempo real de la progresión de la enfermedad y el despliegue mínimamente invasivo de estas sondas basadas en catéteres.
Introducción
Varios métodos químicos para detectar y cuantificar biomarcadores se utilizan rutinariamente tanto en la química de proteínas como en el diagnóstico clínico, particularmente en diagnósticos de cáncer y la evaluación de la progresión de la enfermedad cardiovascular. Actualmente, métodos como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y la espectrometría de masas se basan en la recolección de muestras del compartimento vascular 1,2,3 por extracción de líquido a granel o del compartimento intersticial por microdiáli....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Investigación Animal de la Universidad de California, Los Ángeles y se realizaron siguiendo las pautas establecidas por la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (8ª edición, 2011). Se utilizaron cerdos Yorkshire machos adultos de aproximadamente 75 kg para estudios in vivo 10.
1. Fabricación y funcionalización de inmunosondas capacitivas
- Corte una longitud de 25 cm de alambre de platino recubierto de perfluoroalcoxi (PFA) (consulte la Tabla de material....
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Resultados
Fabricación y caracterización de electrodos
Se fabricó una inmunosonda capacitiva flexible (sondas CI), y en la Figura 1A se representa una imagen representativa. El potencial del electrodo se estableció mediante un circuito de abrazadera de voltaje controlado por computadora (Figura 1B), y el electrodo se sumergió en una solución de polidopamina hecha en PBS. La polidopamina se electrodespuso en la punta del electrodo conductor
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Discusión
El presente protocolo describe la fabricación y prueba de una inmunosonda capacitiva (sonda IC) capaz de detectar y medir biomarcadores de interés tanto en entornos in vitro como in vivo . La detección se logra atrapando el biomarcador en la punta del electrodo. El evento de atrapamiento altera la unión capacitiva entre una inmunosonda capacitiva de alambre de platino y el entorno del fluido conductor circundante, medido como un cambio en la corriente de carga en respuesta a un cambio potencial en la so.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses, financieros o de otro tipo.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Olu Ajijola (UCLA Cardiac Arrhythmia Center) por el apoyo experto para los experimentos in vivo . Este trabajo fue apoyado por NIH U01 EB025138 (JLA, CS).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Electrodo de disco AgCl | Warner Instruments (Holliston, MA) | 64-1307 | |
| Anticuerpo monoclonal anti-NPY | Abcam, (Cambridge, MA) | ab112473 | |
| Amplificador multicanal personalizado/ 1 MΩ resistencia de retroalimentación multicanal headstage | NPI Electronic, (Tamm, Alemania) | NA | Basado en NPI VA-10M amplificador multicanal |
| Dopamina HCl | Sigma Aldrich (St. Louis, MO) | H8502-10G | |
| Pin de conector macho chapado en oro | AMP-TE Connectivity (Amplimite) | 6-66506-1 | |
| HEKA LIH 8+8 dispositivo analógico a digital/digital a analógico | HEKA Elektronik, (Holliston, MA) | Software | |
| Igor Pro, v. 7.08 | WaveMetrics, (Lake Oswego, OR) | El software que impulsa el potencial de comando y la adquisición de datos fue escrito a medida | |
| Bomba peristáltica digital estándar Masterflex L/S | Cole Palmer, (Vernon Hills, IL) | ||
| Alambre de platino recubierto de PFA | A-M Systems, (Sequim, WA) | 773000 | silicona de 0,005" de diámetro desnudo, 0,008" de diámetro recubierto |
| World Precision | Instruments (Sarasota, FL) | SYLG184 | |
| Péptido sintético de NPY porcino | Bachem (Torrance, CA) | ||
| Péptido sintético porcino NPY | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 |
Referencias
- Chow, S. L., et al. Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).
- Goldstein, D. S.
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Reimpresiones y permisos
